三級淋巴結(jié)構(gòu)在腫瘤免疫治療中的研究進(jìn)展*

董麗媛 王燕妮 魯智豪

腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的“土壤”，除腫瘤細(xì)胞外，還包含免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及腫瘤血管系統(tǒng)等，其中三級淋巴結(jié)構(gòu)（tertiary lymphoid structures，TLS）是反映TME 狀態(tài)的重要標(biāo)志物[1-2]。TLS 是在自身免疫性疾病、慢性感染及腫瘤等慢性炎癥刺激下，在非淋巴器官內(nèi)形成的異位淋巴樣結(jié)構(gòu)，反映了外周組織在長期暴露于由趨化因子和細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥信號時出現(xiàn)的淋巴新生[2]。多項研究表明，B 細(xì)胞和TLS 與不同腫瘤患者更好的預(yù)后相關(guān)[3-5]，但是TLS 塑造腫瘤微環(huán)境，發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的具體機(jī)制仍不清楚，因此深入解析TLS 有助于充分挖掘其在抗腫瘤免疫反應(yīng)中的潛在應(yīng)用價值，指導(dǎo)腫瘤精準(zhǔn)免疫治療。

本文重點(diǎn)介紹TLS 的組成及其形成過程，檢測方法，同時強(qiáng)調(diào)了TLS 對腫瘤免疫反應(yīng)的影響并討論通過誘導(dǎo)TLS 形成增強(qiáng)抗腫瘤免疫療效的可能性。

1 TLS 的形成和細(xì)胞組成

在腫瘤微環(huán)境中，TLS 的形成過程極為復(fù)雜，涉及多個細(xì)胞及細(xì)胞/趨化因子的調(diào)控作用。目前普遍認(rèn)為TLS 的發(fā)育與形成過程類似于次級淋巴結(jié)構(gòu)（secondary lymphoid organ，SLO），由淋巴組織誘導(dǎo)細(xì)胞（lymphoid-tissue inducer，LTi）和淋巴組織形成細(xì)胞（lymphoid tissue organizer，LTo）通過相互作用在特定部位形成。在小鼠腫瘤中，LTi 可以是T 細(xì)胞和B 細(xì)胞[6]，在人類腫瘤中，LTi 可以是固有淋巴樣細(xì)胞（innate lymphoid cell，ILC）NKp44+ILC3 細(xì)胞等[7]。LTo則主要是基質(zhì)細(xì)胞，如腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancerassociated fibroblast，CAF）等[6]。

在TLS 形成過程中，一方面LTi 通過表達(dá)淋巴毒素α1β2（lymphotoxin α1β2，LTα1β2）與LTo 上的淋巴毒素β受體（lymphotoxin-β receptor，LTβR）結(jié)合，促進(jìn)LTo 分泌血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGFC），介導(dǎo)HEV 的形成，同時HEV 也可以分泌多種黏附分子（ICAM1、VCAM1、MADCAM1），進(jìn)而促進(jìn)B 細(xì)胞和T 細(xì)胞的發(fā)育[2]。另一方面，LTi 通過分泌IL-17，與LTo 上的IL-17R 結(jié) 合，促 進(jìn)LTo 分 泌CXCL12、CXCL13、CCL19 和CCL21等趨化因子，這些趨化因子可以從附近的HEV中募集CXCR5（CXCL13受體）和CCR7（CCL19/CCL21 受體）陽性的淋巴細(xì)胞[8]，組織形成T 細(xì)胞和B 細(xì)胞區(qū)（圖1）。

成熟TLS 的結(jié)構(gòu)是T 細(xì)胞區(qū)包圍著含有生發(fā)中心的B 細(xì)胞區(qū)，由免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞組成的有組織的聚集體?；|(zhì)細(xì)胞除了作為LTo 分泌趨化因子招募免疫細(xì)胞外，還能進(jìn)一步轉(zhuǎn)分化為濾泡樹突狀細(xì)胞（follicular dendritic cells，F(xiàn)DC）和成纖維網(wǎng)狀細(xì)胞（fibroblastic reticular cells，F(xiàn)RC），分別支持B 細(xì)胞區(qū)和T 細(xì)胞區(qū)[6]。免疫細(xì)胞主要包含樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC），F(xiàn)DC，CD20+B 細(xì)胞，CD3+T 細(xì)胞，CD4+濾泡輔助T 細(xì)胞（follicular helper T，Tfh），CD4+輔助T1 細(xì)胞（helper T1，Th1），CD8+細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T cells，Tregs）等，DC 和B 細(xì)胞可將局部抗原呈遞給T 細(xì)胞，從而導(dǎo)致T 細(xì)胞活化和增殖。Tfh 和Th1 則可以通過共刺激分子或受體配體相互作用，促進(jìn)B 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為增殖的B 細(xì)胞簇，即生發(fā)中心（germinal centre，GC）。在這個過程中，B 細(xì)胞經(jīng)歷了親和力成熟，類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞超突變的過程，成為具有成熟免疫功能的B 細(xì)胞[2]。

總體而言，TLS 的形成與發(fā)展是一個多步驟、動態(tài)變化過程，免疫細(xì)胞衍生的促炎信號作為誘導(dǎo)劑，活化的成纖維細(xì)胞通過建立并維持淋巴細(xì)胞結(jié)構(gòu)或產(chǎn)生關(guān)鍵的趨化因子來充當(dāng)組織者，將多種細(xì)胞招募到相應(yīng)位置，這些細(xì)胞通過廣泛的細(xì)胞間相互作用，最終分化成熟，并發(fā)揮免疫效應(yīng)。

2 TLS 的標(biāo)記與檢測方法

目前，TLS 已在肺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌和黑色素瘤[3-5,9]等多個瘤種中被檢測，然而不同瘤種對TLS 的標(biāo)記策略存在較大差異，這也導(dǎo)致不同癌癥類型的數(shù)據(jù)無法直接進(jìn)行比較。常用的方式主要有蘇木精—伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，H&E）、免疫組織化學(xué)染色（immunohistochemistry，IHC）、多重免疫組織化學(xué)（multiplex immunohistochemistry，mIHC）/多重免疫熒光（multiplex immunofluorescence，mIF）染色以及測序檢測（趨化因子-score 等），見表1。

H＆E 染色是表征TLS 最簡單的技術(shù)，在形態(tài)學(xué)上，TLS 被識別為明顯的淋巴濾泡樣結(jié)構(gòu)和致密的細(xì)胞聚集物，但是H&E 染色無法精準(zhǔn)評估TLS 種類且受觀察者影響較大，評估結(jié)果有一定的局限性。IHC和mIHC/mIF 是對TLS 的檢測較為準(zhǔn)確和特異性較高的檢測手段，主要應(yīng)用多種細(xì)胞的標(biāo)志分子對連續(xù)的腫瘤切片進(jìn)行雙重或多重標(biāo)記，然后利用定量數(shù)字病理學(xué)軟件來評估TLS 的位置、數(shù)量、大小及成熟度等，實現(xiàn)定性及定量分析。一般情況下，由T 細(xì)胞（CD3+細(xì)胞）包圍著致密B 細(xì)胞（CD20+細(xì)胞），并存在HEV、FDC 等細(xì)胞的區(qū)域可定義為TLS（圖2）。

圖2 食管癌中TLS 的表達(dá)

現(xiàn)有的研究使用不同的標(biāo)記分子組合來識別這些結(jié)構(gòu)。mIHC/mIF 檢測相比于傳統(tǒng)的IHC 檢測，可同時標(biāo)記更多分子且不受抗體類型的限制，節(jié)約了時間成本，但受染色過程復(fù)雜、成本較高等因素限制，此方法暫時無法在臨床上進(jìn)一步推廣應(yīng)用。此外，考慮到基于活檢或手術(shù)等取樣方式檢測TLS 存在異質(zhì)性，更多研究嘗試?yán)门cTLS 相關(guān)的細(xì)胞/趨化因子等分泌蛋白表征TLS，解決了對TLS 的研究完全依賴于石蠟切片的局限性。如有研究利用經(jīng)典的12-趨化因子（CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL18、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL13），根據(jù)特定趨化因子的基因表達(dá)特征來定義TLS，如CXCL13、CCL19 和CCL21 的高表達(dá)預(yù)示著淋巴細(xì)胞的募集和淋巴新生[10-11]，但是這種方法由于組織測序成本較高，又不能完整表示TLS 的成熟度及空間表達(dá)和定位，臨床應(yīng)用價值有限。由此可見，目前TLS 的檢測方法各有利弊，未來有待開發(fā)既可全面表征TLS 信息，又具備成本低、操作簡單且便于臨床推廣應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)的新方法。

3 TLS 對免疫反應(yīng)的影響及預(yù)測價值

B 細(xì)胞和TLS 是免疫微環(huán)境的重要組成部分，與免疫治療的療效和患者預(yù)后密切相關(guān)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)在接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）治療的過程中，應(yīng)答者和非應(yīng)答者之間TLS 的成分有明顯的差異，提示TLS 對ICIs 反應(yīng)可能具有較高的預(yù)測價值。如位于TLS 內(nèi)的PD-1+CD8+T 細(xì)胞的浸潤情況可預(yù)測晚期非小細(xì)胞肺癌患者對PD-1的阻斷反應(yīng)[14]。既往研究表明，TLS對PD-（L）1或PD-（L）1 聯(lián)合細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4（CTLA-4）阻斷等免疫治療的影響大多是積極的，這在黑色素瘤[5]、膀胱癌[13]、肺鱗癌[15]等多個免疫治療隊列中均已被證實。然而，也有一些研究并未發(fā)現(xiàn)TLS對患者預(yù)后的積極影響，提示不同腫瘤組織中TLS 的作用存在差異，除受腫瘤類型、分期的影響外，這種差異可能來源于TLS 的大小、形態(tài)、成熟度、空間位置和內(nèi)部組成多樣性等。

3.1 不同成熟度的TLS 對免疫反應(yīng)的預(yù)測作用

TLS 在腫瘤微環(huán)境中存在不同的分化階段，分別為早期TLS、初級濾泡樣TLS 及次級濾泡樣TLS[16]。早期TLS（CD21-CD23-）是密集的淋巴細(xì)胞簇，含有HEV，不含F(xiàn)DC。初級濾泡樣TLS（CD21+CD23-）含有HEV 及FDC，但不含GC。次級濾泡樣TLS（CD21+CD23+）更為成熟，含有HEV、FDC 及GC。不同成熟狀態(tài)的TLS 發(fā)揮作用不同。如在肺鱗癌中，只有含有GC 的次級濾泡樣TLS 高表達(dá)免疫反應(yīng)相關(guān)基因，若GC 形成受損，TLS 將不再有預(yù)后價值[15]。Posch等[16]評估了TLS 成熟度作為結(jié)直腸癌輔助化療標(biāo)志物的預(yù)測價值，發(fā)現(xiàn)與未成熟的TLS 相比，含有GC的次級濾泡樣TLS 的腫瘤富含免疫原性抗原，其免疫評分更高，同時具有更優(yōu)的預(yù)后結(jié)果。因此，成熟的TLS 可能預(yù)示著更強(qiáng)的免疫應(yīng)答和更好的預(yù)后，甚至可獨(dú)立于PD-L1 表達(dá)來預(yù)測免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效，并且這種預(yù)測作用不受腫瘤類型的限制，即使在胰腺癌或肉瘤等對免疫檢查點(diǎn)阻斷（immune checkpoint blockade，ICB）治療不敏感的腫瘤中依然適用[17]。

不同成熟度的TLS 引起免疫反應(yīng)強(qiáng)度的不同，可能與免疫細(xì)胞的豐度、功能狀態(tài)和分布有關(guān)。早期TLS 存在T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的聚集，但不存在B 細(xì)胞濾泡和FDC，其中的幼稚或記憶B 細(xì)胞也不會進(jìn)一步成熟[15]。在次級濾泡樣TLS 中，CD21+FDC 可能參與向B 細(xì)胞的抗原呈遞，B 細(xì)胞進(jìn)一步成熟，但可能不會經(jīng)歷B 細(xì)胞濾泡中免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換和親和力成熟的過程。而在完全成熟的次級濾泡樣TLS 中，CD21+CD23+FDCs 可以通過抗原呈遞選擇具有高親和力BCR 的B 細(xì)胞，以及能夠促進(jìn)B 細(xì)胞成熟和分化的Tfh，使得B 細(xì)胞進(jìn)一步成熟，分化為漿細(xì)胞[18]。因此，TLS 的成熟過程與B 細(xì)胞成熟過程相輔相成，TLS 中B 細(xì)胞的成熟度可能是影響患者免疫應(yīng)答和預(yù)后的重要因素。

3.2 不同位置和密度的TLS 對免疫反應(yīng)和預(yù)后的影響

TLS 在腫瘤組織內(nèi)、腫瘤浸潤邊界和腫瘤周圍組織中均有分布，位于腫瘤不同位置的TLS 對免疫反應(yīng)和預(yù)后的作用也可能不同。在一項軟組織肉瘤的研究中，TLS 多位于腫瘤的中心，招募更多的腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞，促進(jìn)患者對ICIs 的應(yīng)答[19]。在乳腺癌中，腫瘤周圍區(qū)域TLS 與較差的無病生存期相關(guān)，且密度越高患者預(yù)后越差[20]。在肝癌中，靠近腫瘤浸潤性邊界和腫瘤組織內(nèi)部的TLS 可以促進(jìn)主動免疫反應(yīng)和各種免疫細(xì)胞的浸潤，且TLS 密度越高，免疫反應(yīng)越強(qiáng)，患者預(yù)后越好[21]，并且瘤內(nèi)的TLS 降低了術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險，提示持續(xù)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)的存在[22]。然而，位于腫瘤周圍的肝組織中的TLS 卻與晚期肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）復(fù)發(fā)風(fēng)險升高相關(guān)，這可能是由于TLS 為HCC 祖細(xì)胞提供了富含細(xì)胞因子的微生態(tài)位，HCC 祖細(xì)胞在其中茁壯成長，然后獲得獨(dú)立并離開生態(tài)位，最終形成了完全成熟的HCC[23]。由此可見，即便在同一瘤種中，位于腫瘤不同位置的TLS 也會影響免疫反應(yīng)以及患者的預(yù)后和生存。

由于TLS 強(qiáng)大的免疫功能，TLS 的定位和密度可能對患者的治療產(chǎn)生很大影響，而在關(guān)于TLS 對ICIs 反應(yīng)預(yù)測價值的研究中，大多并無細(xì)致區(qū)分TLS的具體定位或探究TLS 定位與ICIs 反應(yīng)之間的聯(lián)系。因此，探究TLS 與腫瘤組織的位置關(guān)系對免疫治療的影響具有很強(qiáng)的研究價值。

3.3 不同內(nèi)部組成的TLS 對免疫反應(yīng)的預(yù)測作用

TLS 對免疫治療的影響不僅取決于其成熟度、位置及密度等，還依賴于其內(nèi)部的細(xì)胞組成、功能、活性以及細(xì)胞因子的表達(dá)。在TLS 中，PD-1+CD8+T 細(xì)胞產(chǎn)生殺傷性細(xì)胞因子的能力降低，但卻高表達(dá)趨化因子CXCL13，通過與B 細(xì)胞和Tfh 上的CXCR5 結(jié)合，促進(jìn)B 細(xì)胞的激活[14]。B 細(xì)胞可能通過產(chǎn)生對抗腫瘤的抗體來促進(jìn)抗腫瘤反應(yīng)，也可能通過改變T 細(xì)胞的激活和功能以及其他機(jī)制（分泌TNF、IL-2、IL-6和IFN 等細(xì)胞因子），與TLS 的其他關(guān)鍵免疫成分一起發(fā)揮作用。因此CD20+B 細(xì)胞、PD-1+CD8+T 細(xì)胞和PD-1+Tfh 細(xì)胞聚集的TLS 可能預(yù)示著患者對ICIs 的反應(yīng)更強(qiáng)。然而，TLS 中的某些成分還可以抑制ICIs 的療效，如TLS 中的Treg 細(xì)胞和Breg 細(xì)胞可以減少T 細(xì)胞的浸潤，從而削弱免疫治療的療效[24-25]。也有研究表明，富含Th 細(xì)胞的TLS 可能會干擾抗腫瘤免疫反應(yīng)，并與晚期結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)有關(guān)[26]。因此，TLS 中不同的成分對于腫瘤免疫反應(yīng)的影響不同，應(yīng)用TLS 預(yù)測免疫療效時需考慮TLS 獨(dú)特的內(nèi)部特征。

由此可見，TLS 的成熟度、密度、位置和細(xì)胞組成對有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)至關(guān)重要，B 細(xì)胞和TLS 的浸潤情況，很大程度上能夠預(yù)測患者對腫瘤的免疫反應(yīng)以及ICIs 的療效，并有助于篩選出更適合接受免疫治療的患者。因此，深入解析TLS 對免疫治療的影響，對于精準(zhǔn)預(yù)測免疫療效和優(yōu)化臨床獲益人群篩選策略具有極其重要的意義。

4 誘導(dǎo)TLS 形成的策略

TLS 是腫瘤微環(huán)境產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答的核心，其可能給腫瘤患者帶來更好的生存獲益，加之大量的臨床前動物模型結(jié)果表明，TLS 可自發(fā)或誘導(dǎo)形成，如Finkin 等[23]在肝癌小鼠模型的肝臟組織中先觀察到TLS 樣結(jié)構(gòu)后發(fā)生腫瘤，TLS 形成提示肝癌的不良預(yù)后，而抑制LTβR 信號可有效阻斷TLS 形成并降低肝癌發(fā)生。Fleig 等[27]發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮Notch 信號的缺失可以介導(dǎo)動脈去分化和高內(nèi)皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，可誘導(dǎo)小鼠腎臟、肝臟和肺組織中TLS 的形成。此外，在黑色素瘤小鼠模型及肺癌細(xì)胞系異種移植模型中均觀察到具有HEV 的TLS，并且腹腔注射比皮下注射的腫瘤形成TLS 的豐度更高[1]。這些動物模型為誘導(dǎo)TLS 形成的可及性提供了大量的證據(jù)。因此，在免疫原性低的腫瘤中通過誘導(dǎo)TLS 形成增強(qiáng)免疫反應(yīng)和免疫治療療效已成為關(guān)注的重點(diǎn)。目前誘導(dǎo)TLS 產(chǎn)生的策略主要包括：細(xì)胞因子或趨化因子誘導(dǎo)、腫瘤疫苗誘導(dǎo)、常規(guī)放化療方案及免疫治療誘導(dǎo)等。

4.1 細(xì)胞因子或趨化因子誘導(dǎo)

TLS 形成過程依賴多種細(xì)胞因子和趨化因子，因此多項研究通過控制關(guān)鍵細(xì)胞因子或趨化因子的分泌誘導(dǎo)TLS 形成。Delvecchio 等[28]發(fā)現(xiàn)將CXCL13和CCL21 注射到無法自發(fā)形成TLS 的胰腺癌臨床前小鼠模型的腫瘤內(nèi)后，B 細(xì)胞和T 細(xì)胞會浸潤到腫瘤位點(diǎn)組裝形成TLS，甚至可觀察到TLS 形成的過程，從單純T 細(xì)胞的聚集到B 細(xì)胞、T 細(xì)胞和FDC 區(qū)域形成。Ukita 等[29]利用同樣的方法，在小鼠卵巢癌模型中注射CXCL13，誘導(dǎo)了TLS 形成，促進(jìn)了細(xì)胞免疫和體液免疫的協(xié)同抗腫瘤反應(yīng)。Drayton 等[30]發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控LTα1β2 的表達(dá)可以促進(jìn)HEV 的形成和CCL19、CCL21 及CXCL13 的分泌，進(jìn)而誘導(dǎo)B 細(xì)胞募集和TLS 形成。

TNF 超家族細(xì)胞因子LIGHT 是LTβR 的另一種配體，也是TLS 形成的關(guān)鍵分子。在非免疫源性胰腺癌RIP1-Tag5 小鼠模型中，利用LIGHT-VTP（一種具有調(diào)節(jié)腫瘤血管和誘導(dǎo) TLS 形成的雙重能力的化合物）靶向腫瘤血管，可以重塑腫瘤血管并促進(jìn)內(nèi)源性T 細(xì)胞流入誘導(dǎo)TLS 形成，LIGHT 還可以將大量效應(yīng)和記憶T 細(xì)胞募集到腫瘤中，顯著增強(qiáng)免疫治療療效[31]。干擾素基因刺激蛋白（stimulator of interferon genes，STING）是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，可誘導(dǎo)抗腫瘤免疫應(yīng)答。Chelvanambi 等[32]發(fā)現(xiàn)，B16-F10 黑色素瘤小鼠模型中瘤內(nèi)注射低劑量的STING 激動劑ADUS100 可以使腫瘤血管正?；?，改善免疫細(xì)胞募集，誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境中的局部TLS 形成，延緩腫瘤生長。

細(xì)胞/趨化因子誘導(dǎo)TLS 策略并非均能增強(qiáng)抗腫瘤免疫，這些細(xì)胞/趨化因子的數(shù)量或來源可能影響免疫應(yīng)答和免疫耐受之間的平衡，并且誘導(dǎo)免疫抑制性細(xì)胞的募集。經(jīng)基因工程改造大量分泌CCL21 的腫瘤可以吸引FOXP3+Treg 細(xì)胞和髓源抑制細(xì)胞，反而削弱抗腫瘤免疫反應(yīng)[24]。在以免疫抑制微環(huán)境為特征的神經(jīng)膠質(zhì)瘤小鼠模型中，免疫刺激性激動劑CD40抗體（αCD40）可成功誘導(dǎo)LTα、LTβ 和LIGHT 的產(chǎn)生及腫瘤附近TLS 的形成，然而αCD40 同時誘導(dǎo)抑制性CD11b+Breg 細(xì)胞增加，削弱并損害對ICIs 的反應(yīng)[25]。因此，通過控制細(xì)胞因子和趨化因子誘導(dǎo)TLS的方法仍需深入研究，調(diào)控免疫應(yīng)答和免疫耐受之間的平衡，避免抑制性免疫細(xì)胞產(chǎn)生，增強(qiáng)抗腫瘤免疫治療療效。

4.2 腫瘤疫苗誘導(dǎo)

部分研究發(fā)現(xiàn)對免疫原性較差的腫瘤進(jìn)行治療性疫苗接種也可誘導(dǎo)TLS 形成。HPV16 陽性宮頸癌患者接種針對HPV 抗原的疫苗后可在間質(zhì)形成TLS，并產(chǎn)生強(qiáng)大的組織局部免疫應(yīng)答效應(yīng)[33]。Lutz 等[34]發(fā)現(xiàn)胰腺患者接種分泌粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的同種異體疫苗（GVAX）后，85%（33/39）的患者瘤內(nèi)可形成明顯的TLS 結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)與部分接受GVAX 治療患者的生存期延長相關(guān)，為非免疫原性腫瘤免疫治療方案提供了新的可能，但在腫瘤抗原刺激下，相關(guān)免疫細(xì)胞的活化和重組機(jī)制尚不完全清楚。Wen 等[35]開發(fā)了一種用單寧酸裝載EB 病毒核抗原1（EBNA1）和Mn2+和CpG 雙佐劑組成的納米疫苗，這種納米疫苗可以激活LT-α 和LT-β 通路，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中下游趨化因子CCL19/CCL21、CXCL10 和CXCL13 的表達(dá)，通過促進(jìn)TLS 的形成顯著增強(qiáng)了局部免疫反應(yīng)，增加腫瘤組織中CD8+T 細(xì)胞浸潤比例，延緩腫瘤生長。這是利用腫瘤疫苗誘導(dǎo)TLS比較成功的范例，隨著新型腫瘤疫苗研究的不斷發(fā)展，TLS 或許可以作為評估腫瘤疫苗有效性的預(yù)測因子，并進(jìn)一步探索疫苗使用背景下免疫微環(huán)境重塑的具體機(jī)制。

4.3 化療誘導(dǎo)

化療藥物可以通過誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡（immunogenic cell death，ICD）增強(qiáng)抗腫瘤免疫療效，并伴隨著免疫微環(huán)境的重塑[36]。有證據(jù)表明，這種免疫重建部分伴隨著B 細(xì)胞聚集和TLS 形成。如Lu 等[37]在接受新輔助化療后的乳腺癌標(biāo)本中檢測出更多的TLS，其中ICOSL+B 細(xì)胞顯著富集并與T 細(xì)胞相互作用，引起抗腫瘤T 細(xì)胞免疫應(yīng)答，顯著提高患者無病生存期和總生存期。接受過新輔助化療的肺癌[3]和胰腺癌患者CD8+T 細(xì)胞、HEV、CD163+巨噬細(xì)胞和Ki67+TLS 比例顯著增加[9]，提示更多TLS 的形成。因此，化療誘導(dǎo)TLS 的形成可能是化療后免疫療效增強(qiáng)的關(guān)鍵因素之一，通過分析化療后TLS 出現(xiàn)的時間，部位和特征，前瞻性、針對性地在特定瘤種中使用化療藥物，可以有目的地誘導(dǎo)TLS 形成，從而達(dá)到使免疫治療反應(yīng)倍增的效果。

4.4 ICIs 療法誘導(dǎo)

已有大量證據(jù)證明TLS 可以對于ICIs 的療效產(chǎn)生重要影響，然而TLS 的形成與ICIs 療效之間的因果關(guān)系目前尚不清楚[5,19]。在一項晚期尿路上皮癌的研究中，患者在腫瘤切除前接受了PD-1 和CTLA-4抗體的聯(lián)合治療，雖然基線TLS 與治療反應(yīng)之間無相關(guān)性，但治療后所有病理完全緩解的患者TLS 的豐度明顯升高[13]，這提示TLS 可以在ICIs 治療期間被誘導(dǎo)，并有利于局部抗腫瘤免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。在接受新輔助ICIs 治療的黑色素瘤隊列中，應(yīng)答者包含更豐富和多樣化的BCR 序列以及更高的B 細(xì)胞特異性基因的表達(dá)[8]。Petitprez 等[19]通過分析肉瘤標(biāo)本的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ICIs 應(yīng)答者存在更多TLS，并且CD20+B細(xì)胞被幼稚T 細(xì)胞包圍。新輔助抗PD-1 治療響應(yīng)的黑色素瘤腫瘤組織中TLS 富含大量反應(yīng)性B 細(xì)胞，并通過改變T 細(xì)胞的激活和功能以及其他機(jī)制與TLS 的其他關(guān)鍵免疫成分一起發(fā)揮作用[5]。這表明TLS 可能在ICIs 治療期間被誘導(dǎo)和募集，并通過激活B 和T 細(xì)胞啟動新的適應(yīng)性免疫反應(yīng)來重啟抗腫瘤免疫反應(yīng)。

越來越多的研究表明TLS 可以在腫瘤微環(huán)境中通過各種方法被誘導(dǎo)，雖然TLS 誘導(dǎo)的時機(jī)和方法尚無一致定論，但利用趨化因子、腫瘤疫苗、化療和免疫治療的方法已顯示出強(qiáng)大的效果，在今后的腫瘤治療策略中，TLS 的誘導(dǎo)極有可能成為增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)調(diào)節(jié)的新靶點(diǎn)。

5 結(jié)語與展望

多項研究表明腫瘤內(nèi)TLS 的存在與局部較高的炎癥狀態(tài)及免疫浸潤密切相關(guān)，可促進(jìn)淋巴細(xì)胞浸潤、腫瘤抗原激活和分化以增加抗腫瘤免疫應(yīng)答[1,12,32]。在部分瘤種的回顧性研究中，TLS 作為免疫治療療效預(yù)測標(biāo)志物的潛能甚至優(yōu)于臨床中常用的PD-L1[17]。而不同成熟度、密度、空間位置和內(nèi)部組成的TLS 對不同癌種免疫療效、腫瘤復(fù)發(fā)和患者生存的影響存在差異，為提高TLS 作為癌癥治療標(biāo)志物的預(yù)測價值，需開發(fā)新的檢測方法準(zhǔn)確評估TLS 的各項特征。目前研究發(fā)現(xiàn)使用趨化因子、細(xì)胞因子、腫瘤特異性抗原、放化療及免疫治療等均可誘導(dǎo)TLS 形成，但對于不同方法誘導(dǎo)成功率及調(diào)控機(jī)制罕有報道。未來仍需開發(fā)新型治療策略發(fā)揮TLS 介導(dǎo)免疫反應(yīng)的優(yōu)勢，克服腫瘤免疫逃逸，從而改變ICIs 的臨床效用。

目前腫瘤中TLS 與患者臨床預(yù)后的相關(guān)性研究多為回顧性研究，有必要將其納入篩選標(biāo)準(zhǔn)，在不同瘤種中開展前瞻性、大規(guī)模臨床試驗進(jìn)行探索。綜上所述，TLS 將有望成為評估免疫療效的重要生物標(biāo)志物以及癌癥治療的重要靶點(diǎn)，腫瘤微環(huán)境中TLS 的全面解析將為深入認(rèn)識腫瘤微環(huán)境提供新思路，為腫瘤精準(zhǔn)免疫治療提供新方法。

本文無影響其科學(xué)性與可信度的經(jīng)濟(jì)利益沖突。