楊曉東,羅宇琴,吳文平,潘禮業(yè),劉曉琳,龐 偉,邢菊玲,李國衛(wèi)

廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室,佛山 528244

馬鞭草為馬鞭草科植物馬鞭草VerbenaofficinatisL.的干燥地上部分[1],始載于《名醫(yī)別錄》,列為下品。馬鞭草的化學成分主要為環(huán)烯醚萜苷類[2]、黃酮類[3]、甾醇類、三萜類、多酚類和揮發(fā)油[4]、鞣質、β-胡蘿卜素,咖啡酸,糖類等。主要活性成分為環(huán)烯醚萜苷類成分[5]。其性涼,味苦,歸肝、脾經。具有活血散瘀、解毒、利水、退黃、截瘧的功效。臨床用于癥瘕積聚,痛經經閉,喉痹,癰腫,水腫,黃疸,瘧疾。馬鞭草資源豐富[6],其中環(huán)烯醚萜苷類[7]成分具有抗氧化、保肝、保護神經[8]、保護心臟及腦缺血[9]、抗炎[10]等多種作用。中藥湯劑(標準湯劑)是中醫(yī)臨床最常用的中藥復方制劑,也是中醫(yī)歷史上應用最久和最廣的制劑。無論是中藥傳統(tǒng)飲片,還是破壁飲片、中藥配方顆粒等中藥新型飲片,均是采用水煎服或者水沖服,因此,將標準湯劑研究作為其他中藥制劑研究的首選對照具有十分重要的意義[11]。本研究通過闡明飲片到標準湯劑的量值傳遞規(guī)律,為馬鞭草中藥制劑工藝研究和質量評價奠定基礎。

本研究以馬鞭草飲片為研究對象,建立其UPLC特征圖譜,結合化學模式分析圖譜信息并采用超高效液相色譜法聯(lián)合一測多評法同時測定馬鞭草中毛蕊花糖苷、5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷含量的方法,與外標法測定結果進行比較。并測定其標準湯劑出膏率、毛蕊花糖苷、5-羥基馬鞭草苷及馬鞭草苷含量,計算轉移率,以此為基礎進行馬鞭草飲片到標準湯劑的量值傳遞研究,說明各項質量指標設定的合理性。

1 材料

1.1 儀器

Waters H-Class型超高效液相色譜儀(沃特世公司);Thermo Vanquish型超高效液相色譜儀(賽默飛科技有限公司);ME204E型萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)。

1.2 試劑

甲醇(西隴科學股份有限公司)為分析純;液相用磷酸(天津市科密歐化學試劑有限公司);乙腈(默克股份有限公司)為色譜純;水為超純水(實驗室自制)。

1.3 試藥

馬鞭草苷(成都瑞芬思生物科技有限公司,批號:M-042-170613,含量:98.0%);5-羥基馬鞭草苷(維克奇生物科技有限公司,批號:wkq18110104,含量:98.0%);毛蕊花糖苷(中國食品藥品檢定研究院,批號:111530-201713,含量:92.5%)。本次實驗共收集18批馬鞭草藥材,產地信息(見表1),經廣東一方制藥有限公司孫冬梅教授鑒定,均為馬鞭草科植物馬鞭草VerbenaofficinatisL.的干燥地上部分,并經廣東一方制藥有限公司質量中心鑒定合格,均符合2020版《中華人民共和國藥典》(后文簡稱《中國藥典》)馬鞭草項下的各項規(guī)定,并按2020版《中國藥典》馬鞭草飲片項下炮制成飲片,具體炮制方法為:取馬鞭草藥材,挑去非藥用部位和雜質,洗凈,稍潤,切成5～15 mm的段,60 ℃烘干。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Waters HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)色譜柱;流動相為乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B),梯度洗脫(0～2 min,10% A;2～14 min,10%→18% A;14～16 min,18% A;16～25 min,18%→25% A;25～28 min,25%→95% A);流速為0.3 mL/min;柱溫為35 ℃;檢測波長為230 nm;進樣量為1 μL。

2.2 對照品及供試品溶液制備

2.2.1 對照品溶液配制

取馬鞭草苷對照品、5-羥基馬鞭草苷對照品、毛蕊花糖苷對照品適量,精密稱定,置量瓶中,加甲醇制成每1 mL含馬鞭草苷30 μg,5-羥基馬鞭草苷76 μg,毛蕊花糖苷22 μg的混合溶液,即得。

2.2.2 飲片供試品溶液制備

取馬鞭草飲片粉末(過三號篩)約1 g,精密稱定,置錐形瓶中,精密加入80%甲醇50 mL,稱定重量,加熱回流120 min,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.2.3 標準湯劑供試品溶液制備

取馬鞭草標準湯劑約0.1 g,精密稱定,置錐形瓶中,精密加入80%甲醇20 mL,稱定重量,超聲處理(功率300 W,頻率40 kHz)30 min,放冷,再稱定重量,用80%甲醇補足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。

2.3 馬鞭草UPLC特征圖譜建立

2.3.1 特征圖譜方法學考察

2.3.1.1 精密度考察

取馬鞭草飲片粉末(過三號篩,編號:S1),按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次,以毛蕊花糖苷峰為參照峰,各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.0%,表明儀器精密度良好。

2.3.1.2 重復性考察

取馬鞭草飲片粉末(過三號篩,編號:S1),按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,以毛蕊花糖苷峰為參照峰,各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.5%,表明樣品制備方法重復性良好。

2.3.1.3 穩(wěn)定性考察

取馬鞭草飲片粉末(過三號篩,編號:S1),按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件分別與0、2、4、6、8、12 h進樣測定。以毛蕊花糖苷峰為參照峰,各特征峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.1%,表明樣品在12 h內穩(wěn)定。

2.3.2 特征圖譜的建立及相似度評價

取18批馬鞭草飲片按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣檢測。將色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012年版),設定S1為參照圖譜,自動匹配后多點校正,進行全譜峰匹配,得到18批樣品疊加圖,共確認5個特征峰(見圖1)。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012年版)計算18批馬鞭草飲片特征圖譜與對照指紋圖譜的相似度。結果顯示,18批樣品的相似度均不低于0.83(見表2)。

圖1 18批馬鞭草特征圖譜Fig.1 Characteristic chromatogram of 18 batches of Verbenae Herba

表2 相似度結果Table 2 Results of the similarity

2.3.3 共有峰指認

為考察特征圖譜是否具有代表性及能否表征待測成分的專屬性,通過與對照品對照,指認其中3個特征峰,峰1為5-羥基馬鞭草苷、峰2為馬鞭草苷、峰3為毛蕊花糖苷(見圖2)。

圖2 特征圖譜共有峰的指認Fig.2 Identification of common peaks in characteristic chromatogram注:A:供試品;B:混合對照品。1:5-羥基馬鞭草苷;2:馬鞭草苷;3:毛蕊花糖苷。Note:A:Sample;B:Mixed reference substance.1:Hastatoside;2:Cornin;3:Verbascoside.

2.3.4 主成分分析

以18批馬鞭草飲片特征圖譜中的5個共有峰峰面積為數(shù)據(jù),用SPSS 20.0軟件對其進行主成分分析,得出相關矩陣的特征值及其方差(見表3),碎石圖(見圖3),由表3可知,根據(jù)特征值大于1,得到兩個主成分,對總方差的累計貢獻度達80.766%,具有很好的代表性,可代表馬鞭草特征圖譜共有峰的大部分信息。成分矩陣(見表4),由表4可知,第1主成分主要反應了峰3(毛蕊花糖苷)和峰5的信息,第二主成分反映了峰1(5-羥基馬鞭草苷)、峰2(馬鞭草苷)的信息。

圖3 主成分分析碎石圖Fig.3 Scree plot of principal component analysis

表3 特征值及累積方差貢獻率Table 3 Eigenvalue and cumulative variance contribution rate

表4 主成分分析矩陣Table 4 Matrix of principal component analysis

2.4 一測多評法建立

根據(jù)主成分分析結果,以峰3(毛蕊花糖苷)、峰1(5-羥基馬鞭草苷)、峰2(馬鞭草苷)對馬鞭草飲片整體質量影響較大。三者光譜特性基本一致且響應值比例接近,因此,以毛蕊花糖苷為內參物,馬鞭草苷和5-羥基馬鞭草苷為待測成分,建立上述三種成分的一測多評定量表征方法。

2.4.1 一測多評法方法學考察

2.4.1.1 精密度考察

取馬鞭草飲片粉末(過三號篩,編號:S1),按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次、5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花糖苷峰面積RSD分別為0.27%、0.56%、0.70%,表明儀器精密度良好。

2.4.1.2 重復性考察

取馬鞭草飲片粉末(過三號篩,編號:S1),按照“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,計算馬鞭草中5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花糖苷的含量,3種成分含量RSD均小于3%,表明樣品制備方法重復性良好。

2.4.1.3 穩(wěn)定性考察

取馬鞭草飲片粉末(過三號篩,編號:S1),按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12 h進樣測定。5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花糖苷峰面積RSD均小于1%。表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定。

2.4.1.4 線性關系考察

取馬鞭草苷對照品、5-羥基馬鞭草苷對照品、毛蕊花糖苷對照品適量,精密稱定,置量瓶中,加甲醇制成5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花糖苷濃度分別為757.305、463.932、1038.220 μg/mL的混合對照品儲備溶液。

精密吸取上述混合儲備液1 mL至2、5、10、20、50、100 mL量瓶,加甲醇定容至刻度,同上述對照品儲備液分別按照“2.1”項下色譜條件依次進樣測定,記錄色譜峰峰面積。以峰面積為縱坐標(y),對照品濃度為橫坐標(x),并繪制標準曲線(見表5)。結果表明,3種成分在線性范圍內線性關系良好。

表5 回歸方程及相關系數(shù)Table 5 Linear equation and correlation coefficient

2.4.1.5 加樣回收率考察

取已測定含量馬鞭草(S1)飲片粉末約0.5 g,精密稱定,平行3組,每組3份,分別按1∶0.5、1∶1、1∶1.5加入5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花糖苷對照品;按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,計算加樣回收率,3種成分平均加樣回收率在94.4%～102.04%范圍內。RSD均小于3.0%,均符合2020年版《中國藥典》四部通則9101的規(guī)定。表明該測定方法準確度良好。

2.4.2 一測多評法建立

2.4.2.1 相對校正因子計算

因毛蕊花糖苷含量相對較高,且其對照品較易獲得,本研究以毛蕊花糖苷為內參物(s)與其他待測成分為(i)的相對校正因子的計算公示為

(1)

其中,RCF代表相對校正因子、s代表內參物、i代表其他待測成分、A為峰面積、C為相應對照品濃度。

2.4.2.2 耐用性考察

利用相對保留時間法,以毛蕊花糖苷峰為參照峰,計算5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷的相對保留時間ris=tRi/tRs(式中,tRs為參照峰的保留時間,tRi為待測成分的保留時間)。對各色譜峰進行定位。精密吸取“2.4.1.1”項下樣品溶液,分別考察不同柱溫(33、35、37 ℃)、流速(0.28、0.30、0.32 mL/min)、色譜柱(YMC Triart、Waters HSS T3)、色譜儀(Waters H-Class、Thermo Vanquish)對相對保留時間的影響(見表6),RSD小于2%。

表6 耐用性考察(相對保留時間)Table 6 Durability investigation(relative retention time)

2.4.2.3 相對校正因子重現(xiàn)性考察

分別對柱溫(33、35、37 ℃)、流速(0.28、0.30、0.32 mL/min)、色譜柱(YMC Triart、Waters HSS T3)、色譜儀(Waters H-Class、Thermo Vanquish)進行耐用性考察,取“2.4.1.1”項下樣品,按“2.1”項下色譜條件進樣測定,計算5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷的相對校正因子(見表7),RSD小于2%。

表7 不同條件對相對校正因子的影響Table 7 Effects of different conditions on relative correction factors (RCF)

2.4.2.4 樣品測定

取18批馬鞭草飲片樣品,按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液,平行兩份,按照“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄峰面積。以毛蕊花糖苷為參照物,按照一測多評法計算5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷的含量。并與外標法測定結果(毛蕊花糖苷除外)進行比較,計算相對誤差RE=(WQAMS-WESM)/WESM×100%(式中,除WESM為外標法測得的成分含量,WQAMS為一測多評法測得的成分含量)[12]。結果顯示,18批樣品兩種方法測定結果的RE%均小于3%范圍內,表明兩者無明顯差異(見表8),所建立的一測多評法可以用于馬鞭草質量評價研究。

表8 各成分含量測定結果Table 8 Results of content determination of various constituents

2.5 標準湯劑量值傳遞研究

2.5.1 馬鞭草標準湯劑制備

按《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》制備18批馬鞭草標準湯劑,取馬鞭草飲片各100 g,煎煮2次,一煎加水12倍,浸泡30 min,武火煮沸,文火保持微沸30 min,用350目篩網(wǎng)趁熱過濾;二煎加水10倍,武火煮沸,文火保持微沸25 min,用350目篩網(wǎng)趁熱過濾;合并2次煎液,65 ℃真空減壓濃縮至100 mL,冷凍干燥即得。

2.5.2 馬鞭草標準湯劑含量、出膏率測定及轉移率計算

馬鞭草標準湯劑批號對應飲片批號分別為B1～B18,計算出膏率(出膏率=凍干粉重量/飲片重量×100%),18批馬鞭草標準湯劑出膏率波動范圍為10.94%～22.25%,平均出膏率為16.68%;測定毛蕊花糖苷、5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷含量,并計算轉移率(外標法)[13](見表9)。毛蕊花糖苷轉移率的波動范圍為7.9%～36.3%;5-羥基馬鞭草苷轉移率的波動范圍為35.0%～113.4%;馬鞭草苷轉移率的波動范圍為52.1%～109.2%。

表9 馬鞭草標準湯劑出膏率、含量及轉移率Table 9 Dry extract rate,content and transfer rate of Verbenae Herba standard decoction

3 討論與結論

馬鞭草樣品特征圖譜等度洗脫無法實現(xiàn)基線分離,故采用梯度洗脫,在前期預實驗中,本研究對比了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液等流動相,最終選定乙腈-0.05%磷酸溶液為流動相,在上述色譜條件下,色譜峰分離度、理論板數(shù)及峰型等參數(shù)均較好。本研究借助單因素實驗系統(tǒng)考察了提取溶劑、提取方法及時間、料液比對提取效率的影響,結果顯示,當提取溶劑為80%甲醇、料液比為1∶50(g/mL)、回流提取120分鐘時,提取效率最高,故以上述方法為馬鞭草飲片的提取方法。

中藥多指標成分整體質量控制已成為中藥質量控制必然發(fā)展趨勢[14],特征/指紋圖譜是一種有效的質量評價方法,將其與一測多評分析方法相結合可實現(xiàn)質量評價的整體性和準確性。本研究建立了馬鞭草飲片UPLC特征圖譜,確定了5個特征共有峰并指認了其中3個成分,分析時間比HPLC有明顯縮短,且色譜條件可用于5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷及毛蕊花糖苷含量測定。對特征峰峰面積進行主成分分析,該主成分綜合評價模型進一步完善了馬鞭草質量評價分析方法。

2020年《中國藥典》中馬鞭草的含量測定指標為齊墩果酸和熊果酸總量,均為三萜類化合物,極性小,水溶性較低,前期實驗研究結果顯示,馬鞭草標準湯劑中齊墩果酸和熊果酸的總含量低于2.0 mg/g,轉移率低于6%。因此,基于特征圖譜,建立了5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷及毛蕊花糖苷3種成分含量一測多評測定方法。馬鞭草的極性成分以環(huán)烯醚萜類物質為主,其中馬鞭草苷和5-羥基馬鞭草苷為含量最高的主要成分,標準湯劑轉移率較高。部分批次轉移率超100%,而5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷總量的總轉移范圍在56.6%～91.2%?？赡茉驗橥惓煞衷诩訜峒逯蟮冗^程中發(fā)生結構轉化。18批馬鞭草標準湯劑中毛蕊花糖苷、5-羥基馬鞭草苷和馬鞭草苷含量和轉移率批間存在差異,可能與飲片含量、飲片的質地有關,部分飲片顏色較淺,存放時間較久,炮制時,碎屑較多,可能是導致其含量和轉移率波動較大的原因。所選的3種成分在馬鞭草中含量較高,在抗氧化、保肝、保護神經、保護心臟及腦缺血、抗炎等方面具有較好的藥理活性,是馬鞭草發(fā)揮藥效的主要物質基礎之一。

一測多評法測定結果與外標法測定結果無明顯差異,可用于馬鞭草中多種成分定量分析。UPLC特征圖譜結合多指標成分一測多評定量分析法可為馬鞭草及馬鞭草中藥制劑工藝研究和質量評價提供參考。