楊旭,馬季祥,皇甫衛(wèi)康,盧家頂,牛家寬,張喜喜,栗守仁,曹仕僖,王志昌,2,3,史瑩華,2,3

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,河南 鄭州 450046; 2.河南省草地資源創(chuàng)新與利用重點實驗室,河南 鄭州 450046; 3.河南省草業(yè)工程技術(shù)研究中心,河南 鄭州 450046)

在中國畜牧業(yè)生產(chǎn)中,飼糧蛋白質(zhì)原料多以豆粕為主。近年來,由于豆粕價格上漲,“人畜爭糧”的矛盾日益凸顯,蛋白質(zhì)資源短缺嚴(yán)重阻礙了中國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[1]。為此,2022年中國出臺了玉米-豆粕減量替代的相關(guān)政策。在當(dāng)前母豬養(yǎng)殖規(guī)模擴大、蛋白資源日益緊張的形勢下,尋找適合的蛋白原料具有重要的戰(zhàn)略意義。

目前,使用本土雜粕如菜籽粕[2]、棕櫚核仁粕等[3]替代豆粕方面的研究取得了一定成果,但本土雜粕在應(yīng)用中仍具有諸多限制[4],尚未在畜牧業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模推廣。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是一種優(yōu)質(zhì)牧草,在反芻動物中應(yīng)用較多,同時作為膳食纖維添加在母豬日糧中亦具有較多益處[5]。在妊娠日糧中添加苜蓿草粉能夠提高母豬繁殖性能,改善仔豬初生個體質(zhì)量[6]。苜蓿草粉可以防止哺乳母豬異常行為的發(fā)生,提高母豬初乳和常乳中的脂肪含量,有利于初生仔豬的存活和生長[7]。苜蓿中粗蛋白含量高,氨基酸組成較平衡,苜蓿葉中蛋白含量是莖的2倍[8],而苜蓿莖葉分離可以得到粗蛋白含量更高的苜蓿葉粉,具有替代豆粕進一步發(fā)展成為新型蛋白質(zhì)原料的潛力。目前,以苜蓿葉粉替代豆粕在母豬飼糧中的可行性研究尚有待加強。因此,本試驗探討了苜蓿葉粉替代飼糧豆粕對母豬妊娠后期血清抗氧化能力、免疫功能及繁殖性能的影響,為苜蓿葉粉作為新型蛋白源及進一步應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試驗設(shè)計

苜蓿葉粉加工自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)原陽試驗基地,營養(yǎng)成分見表1。本試驗在河南省周口市鑫欣牧業(yè)有限公司某一豬場進行,選取30頭健康狀況和體質(zhì)量相近的妊娠63 d初產(chǎn)母豬,分別為對照組(control group,CTRL)和苜蓿葉粉組(alfalfa leaf meal,ALM),每組15個重復(fù),每個重復(fù)為1頭母豬。CTRL組飼喂玉米-豆粕型基礎(chǔ)飼糧,ALM組使用苜蓿葉粉替換基礎(chǔ)飼糧中豆粕。預(yù)飼期7 d,飼喂至母豬轉(zhuǎn)入產(chǎn)房舍,根據(jù)美國科學(xué)研究委員會(National Research Council,NRC)(2012)[9]母豬營養(yǎng)需求配制妊娠后期飼糧,其成分及營養(yǎng)水平見表2。

表1 苜蓿葉粉及豆粕常規(guī)營養(yǎng)成分(風(fēng)干基礎(chǔ))

表2 妊娠后期母豬飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

試驗?zāi)肛i按照豬場的免疫程序進行常規(guī)免疫。母豬妊娠期飼喂方式為單欄限飼,分別于當(dāng)天7:30和14:00進行飼喂。試驗過程中,母豬自由采食和飲水,豬舍管理方式按照豬場程序正常進行。每天觀察試驗?zāi)肛i的食欲、飲水和糞便形態(tài)等情況。

1.3 樣品采集及方法

分別于妊娠85、105 d清晨每組選取6頭母豬,空腹從耳緣靜脈采血10 mL至促凝管中,靜置1 h后在3 500 r·min-1、4 ℃離心15 min(Heraeus Multifuge X1R臺式冷凍離心機,賽默飛世爾公司),分離血清至-20 ℃保存。本研究的所有試驗程序均符合河南農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物福利與動物倫理相關(guān)規(guī)定。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 血清抗氧化指標(biāo)的測定 使用試劑盒(南京建成生物工程研究所),按照說明書檢測步驟,測定母豬血清中活性氧(reactive oxygen species,ROS)濃度、丙二醛(malondialdehyde,MDA)濃度、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)酶活、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)酶活和總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)。

1.4.2 血清免疫指標(biāo)的測定 使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司),按照說明書檢測步驟,檢測血清免疫球蛋白A(immune globulin A,IgA)、免疫球蛋白G(immune globulin G,IgG)、免疫球蛋白M(immune globulin M,IgM)、輔助性T細胞(helper T cell,CD4+)、細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte,CD8+)質(zhì)量濃度,CD4+質(zhì)量濃度與CD8+質(zhì)量濃度的比值即為CD4+/CD8+值。

1.4.3 產(chǎn)仔性能的測定 按照刁新迎等[10]的方法對母豬產(chǎn)仔性能進行測定,于母豬分娩時記錄窩總產(chǎn)仔數(shù)、窩產(chǎn)活仔數(shù)、仔豬初生個體質(zhì)量和仔豬初生窩質(zhì)量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析使用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行t檢驗,結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,p<0.05差異顯著,p<0.01差異極顯著;選取ALM組和CTRL組母豬妊娠105 d機體抗氧化及免疫指標(biāo)同仔豬初生個體質(zhì)量、仔豬初生窩質(zhì)量2個產(chǎn)仔性能指標(biāo),使用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行spearman相關(guān)性分析,探究母豬機體代謝狀況的變化同妊娠結(jié)局改變的聯(lián)系。

德國應(yīng)用科技大學(xué)的師資主要由教授、教學(xué)專業(yè)人員和兼職教師組成。三類人員均要求具備大學(xué)任教資格，學(xué)術(shù)助理要求具有博士學(xué)位，任期不超過6年；理論課兼職教師必須大學(xué)畢業(yè)，且接受過一定的專業(yè)教育與師范訓(xùn)練，掌握教育理論；實踐教學(xué)兼職教師必須為相關(guān)專業(yè)學(xué)校畢業(yè)，具有2年以上的實踐經(jīng)驗，同時還須具有相關(guān)證書；教授的聘任條件不僅要求有博士學(xué)位，具備扎實的理論及學(xué)術(shù)研究能力，通常還要求在科學(xué)知識、方法應(yīng)用等方面具有至少5年的專業(yè)實踐經(jīng)驗，其中至少有3年在高校以外領(lǐng)域工作的經(jīng)驗，并做出突出的貢獻[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿葉粉對妊娠后期母豬血清抗氧化水平的影響

由表3可知,妊娠85 d時ALM組母豬血清GSH-Px酶活顯著高于CTRL組(p<0.05),MDA濃度顯著低于CTRL組(p<0.05),其他指標(biāo)無顯著差異(p>0.05);妊娠105 d時,ALM組母豬血清SOD、GSH-Px酶活極顯著高于CTRL組(p<0.01),ROS濃度極顯著低于CTRL組(p<0.01),其他指標(biāo)無顯著差異(p>0.05)。以上結(jié)果表明苜蓿葉粉提高了母豬血清抗氧化水平。

表3 苜蓿葉粉對母豬妊娠后期血清抗氧化水平的影響

2.2 苜蓿葉粉對妊娠后期母豬血清免疫指標(biāo)的影響

由表4可知,苜蓿葉粉極顯著降低了妊娠85 d母豬血清CD8+質(zhì)量濃度(p<0.01),而母豬血清IgA、IgG、IgM、CD4+質(zhì)量濃度及CD4+/CD8+值無顯著差異影響(p>0.05);妊娠105 d時,ALM組母豬血清CD8+質(zhì)量濃度極顯著低于CTRL組(p<0.01),CD4+/CD8+值顯著高于CTRL組母豬(p<0.05),其他指標(biāo)無顯著差異(p>0.05)。結(jié)果表明,苜蓿葉粉改善了妊娠母豬的補體系統(tǒng)水平。

表4 苜蓿葉粉對母豬妊娠后期血清免疫指標(biāo)的影響

2.3 苜蓿葉粉對母豬繁殖性能的影響

由表5可知,苜蓿葉粉顯著提高了妊娠母豬的初生窩質(zhì)量和初生個體質(zhì)量(p<0.05),但對窩總產(chǎn)仔數(shù)、窩產(chǎn)活仔數(shù)、窩產(chǎn)健仔數(shù)及健仔率無顯著差異影響(p>0.05)。這表明苜蓿葉粉能夠改善母豬的繁殖性能,提高了初生窩質(zhì)量和初生窩均質(zhì)量,有利于仔豬的存活及后續(xù)的生長發(fā)育。

表5 苜蓿葉粉對母豬繁殖性能的影響

2.4 母豬繁殖性能與機體抗氧化能力、免疫功能相關(guān)性分析

由表6可知,相關(guān)性分析結(jié)果表明,血清ROS濃度同初生個體質(zhì)量呈顯著負相關(guān)關(guān)系(p<0.05),同初生窩質(zhì)量呈極顯著負相關(guān)關(guān)系(p<0.01),SOD酶活同初生個體質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(p<0.01),同初生窩質(zhì)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(p<0.05);血清CD8+質(zhì)量濃度同ROS濃度呈顯著正相關(guān)關(guān)系(p<0.05),同SOD酶活呈顯著負相關(guān)關(guān)系(p<0.05),同GSH-Px酶活呈極顯著負相關(guān)關(guān)系(p<0.01),而CD4+/CD8+值同ROS濃度呈顯著負相關(guān)關(guān)系(p<0.05),與血清GSH-Px酶活呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(p<0.01)。

表6 母豬繁殖性能與血清抗氧化水平及免疫功能的相關(guān)性分析

3 結(jié)論與討論

本研究使用由紫花苜蓿莖葉分離得來的苜蓿葉粉替代妊娠后期母豬飼糧豆粕,結(jié)果表明,苜蓿葉粉作為新型蛋白源代妊娠后期母豬飼糧豆粕可以提高妊娠85 d母豬血清GSH-Px酶活,降低ROS濃度,提高了妊娠105 d母豬血清GSH-Px、SOD酶活,降低了MDA濃度,進而增強了妊娠母豬機體的抗氧化能力,改善了母豬免疫性能和繁殖性能,提高了初生窩質(zhì)量和初生個體質(zhì)量。

妊娠過程對母體是一種挑戰(zhàn),尤其是在妊娠后期,胚胎的快速生長增加了母體代謝負擔(dān),易引發(fā)全身氧化應(yīng)激、免疫失調(diào)、代謝紊亂和組織細胞損傷[11]。母體氧化應(yīng)激與多種不良結(jié)果有關(guān),如妊娠糖尿病、胎兒死亡和低初生體質(zhì)量等[12]。機體ROS濃度升高及氧化應(yīng)激狀態(tài)與仔豬低初生體質(zhì)量有關(guān),影響母豬繁殖性能和仔豬生長性能[13],機體氧化應(yīng)激狀態(tài)還與胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩相關(guān)[14]。MDA是機體膜脂過氧化的產(chǎn)物,其濃度可以反映脂質(zhì)過氧化的程度,間接反映自由基對機體的損傷程度[15]。GSH-Px、SOD是機體抗氧化酶系統(tǒng)的重要組成部分,對氧自由基等具有清除作用。本研究結(jié)果表明,苜蓿葉粉作為新型蛋白源替代妊娠后期母豬飼糧豆粕后,提高了妊娠后期母豬血清抗氧化酶活性,降低了血清中過氧化物等的水平,與LIU等[16]關(guān)于苜蓿草的應(yīng)用報道具有相似性。苜蓿葉蛋白與豆粕蛋白相比具有諸多有益作用。苜蓿葉蛋白水解得到的苜蓿葉多肽在體外具有抗氧化功能,對超氧自由基、羥基自由基和DPPH自由基具有較強的清除能力,苜蓿葉多肽清除自由基活性是谷胱甘肽過氧化物的3～5倍[17],而苜蓿濃縮蛋白能夠提高畜禽血漿中的抗氧化潛能,提高SOD活性、降低MDA濃度[18]。同時本研究中所用苜蓿葉粉含有纖維,使ALM組母豬飼糧中粗纖維含量升高,而諸多研究已證明纖維尤其是苜蓿的纖維成分具有調(diào)節(jié)母豬機體代謝的作用[19-20]。因此,本次試驗結(jié)果中母豬血清抗氧化水平的改善亦有可能是苜蓿葉蛋白和苜蓿纖維的共同作用,但是苜蓿葉粉對于母豬機體抗氧化能力的作用機制還有待進一步探究。本研究中,隨著母豬飼喂苜蓿葉粉飼料時間的增加,妊娠母豬機體抗氧化系統(tǒng)得到的改善效果愈加顯著,表明苜蓿葉粉飼糧對于母豬機體抗氧化系統(tǒng)的改善效果具有隨著飼喂時間增加的累加效應(yīng),而這種改善機體抗氧化系統(tǒng)的累加效應(yīng)還有待進一步驗證和探究。相關(guān)性分析表示,抗氧化酶SOD、GSH-Px酶活同母豬繁殖性能呈正相關(guān)關(guān)系,而ROS濃度與母豬繁殖性能負相關(guān)。這表明機體抗氧化能力同母豬繁殖性能的強相關(guān)性,對于在商業(yè)化養(yǎng)殖過程中改進妊娠母豬飼養(yǎng)策略、加強妊娠母豬養(yǎng)殖過程中的母豬代謝狀況監(jiān)測及降低養(yǎng)殖過程中母豬氧化應(yīng)激的發(fā)生,從而提高母豬繁殖性能具有重要意義。本次試驗結(jié)果表明,苜蓿葉粉替代豆粕能夠通過降低妊娠母豬機體氧化應(yīng)激水平,改善母豬機體健康狀況。

在妊娠期間,胚胎的成功著床、胎盤發(fā)育和胎兒的生長,以及母體和胎兒健康的維持,都需要免疫反應(yīng)的平衡[21];妊娠期間母體免疫系統(tǒng)得到加強,能夠識別、交流、轉(zhuǎn)運和修復(fù)機體免疫網(wǎng)絡(luò),在必要時能夠發(fā)出警報,維持母體和胎兒的健康[22]。免疫球蛋白是免疫系統(tǒng)的重要組成部分,在機體抵御病原體,對抗疾病方面具有重要的作用,主要包括IgA、IgG、IgM等,而妊娠階段母體IgG能夠通過胎盤進入胚胎中,是胎兒的先天性免疫的重要組成部分[23]。CD4+細胞能夠通過提供關(guān)鍵的抗病毒細胞因子或通過直接的細胞毒性在抗病毒免疫中發(fā)揮直接作用[24]。CD8+細胞是先天性和適應(yīng)性免疫防御機制中的重要角色,保護人們免受外在的病原體、病毒和細菌等,以及內(nèi)在的惡性細胞等的威脅[25]。CD4+/CD8+值的變化直接反映了免疫系統(tǒng)的狀態(tài)[26]。本研究中ALM組母豬血清CD8+質(zhì)量濃度較CTRL組降低,CD4+/CD8+值較CTRL組提高,而苜蓿葉粉不影響血清免疫球蛋白質(zhì)量濃度。與豆粕相比,苜蓿具有調(diào)節(jié)動物免疫的作用,苜蓿草粉能夠提高仔豬及育肥豬血清中免疫球蛋白的水平[27-28],同時苜蓿多糖類生物活性物質(zhì)具有激活豬淋巴細胞活性的作用[29]。而苜蓿葉粉中諸多生物活性物質(zhì)的具體含量還有待進一步測定。本研究中,母豬機體的補體系統(tǒng)隨著苜蓿葉粉飼喂時間的延長,得到愈加顯著的改善效果,表明了苜蓿葉粉對于母豬補體系統(tǒng)的改善同樣具有隨作用時間增加的累加效應(yīng),但是這種累加效應(yīng)還需要進一步驗證和分析。相關(guān)性分析結(jié)果表明,血清CD8+質(zhì)量濃度同ROS濃度呈負相關(guān)關(guān)系,同抗氧化酶SOD、GSH-Px酶活呈正相關(guān)關(guān)系。在動物體內(nèi),氧自由基含量的下降及抗氧化能力的提升能夠減少細胞的氧化損傷,降低感染疾病的風(fēng)險,增強動物免疫力[30]。本研究證明了相較于使用豆粕作為蛋白源,苜蓿葉粉作為飼糧蛋白源能夠改善妊娠母豬機體抗氧化能力同時提高機體免疫力,為胎兒的生長提供有利的條件。

妊娠中后期母豬機體會發(fā)生代謝紊亂等癥狀,而母體的代謝變化會對胚胎的生長發(fā)育造成影響,可能導(dǎo)致流產(chǎn)等不良狀況的發(fā)生[22]。妊娠中后期改善母豬營養(yǎng)狀況,能夠改善胚胎的均勻性,減少胚胎發(fā)育的變化和妊娠后期胚胎體質(zhì)量的變化[31]。本研究結(jié)果表明,苜蓿葉粉提高了仔豬初生個體質(zhì)量及初生窩均質(zhì)量,有利于初生仔豬的存活及生長,證明了苜蓿葉粉對母豬繁殖性能具有改善作用。苜蓿對于母豬生產(chǎn)具有積極影響,飼糧中添加苜蓿草粉能夠提高仔豬初生個體質(zhì)量和仔豬初生窩質(zhì)量,改善母豬繁殖性能[32],而苜蓿中含有的B族維生素、維生素E以及β-胡蘿卜素對于繁殖性能具有重要的作用[33]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),使用本土雜粕代替豆粕對母豬繁殖性能無改善作用。GRELA等[34]研究發(fā)現(xiàn),使用發(fā)酵菜籽粕替代豆粕可以提高初乳中免疫球蛋白含量,增加哺乳期活仔數(shù)和哺乳期窩質(zhì)量,但對于產(chǎn)仔數(shù)、仔豬初生個體質(zhì)量、初生窩質(zhì)量等繁殖性能方面并沒有改善效果。SWIATKIEWICZ等[35]使用蠶豆飼喂妊娠母豬發(fā)現(xiàn)對繁殖性能無影響。本研究分別使用豆粕和苜蓿葉粉作為妊娠母豬飼糧蛋白源,通過對各時期母豬妊娠期機體抗氧化能力、機體免疫水平和最終妊娠結(jié)局的分析,證明了苜蓿葉粉作為新型蛋白源替代妊娠母豬飼糧中豆粕的可行性,在一定程度上可以緩解中國蛋白質(zhì)資源緊缺問題,為苜蓿葉粉作為新型蛋白源在畜牧養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。