金鉞,李濱洲,郭珍珍,王亞賓,魏戰(zhàn)勇,陳麗穎

(1.河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,河南 鄭州 450046;2.河南省動物性食品安全重點實驗室,河南 鄭州 450046;3.北京市華都峪口禽業(yè)有限責任公司,北京 101206)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是人體和動物體內(nèi)的常駐菌群,存在于腸道和糞便中,作為條件性致病菌已成為醫(yī)院獲得性感染的第三大病原菌。隨著多重耐藥菌株的出現(xiàn),該菌已經(jīng)對公共健康構(gòu)成較大威脅[1-2]。細菌在宿主細胞表面的黏附和定植是其感染宿主過程的關(guān)鍵步驟,絕大多數(shù)細菌在進化過程中逐漸形成了精細的黏附機制,如生物被膜的形成等。相關(guān)研究證實,糞腸球菌所形成的生物被膜可使其耐受吞噬作用并大幅提高其耐抗菌藥物能力[3]。但是,細菌的侵染是極其復雜的過程,病原菌通過多種免疫逃逸機制實現(xiàn)在機體內(nèi)的定植,而宿主免疫系統(tǒng)則利用先天免疫和適應(yīng)性免疫機制靶向?qū)共≡w感染。此外,病原體還可以利用宿主的炎癥反應(yīng)對抗益生微生物定植,從而在腸道內(nèi)生長[4-5]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是極化上皮細胞經(jīng)歷一系列形態(tài)變化并獲得間充質(zhì)表型的生物學過程,可使細胞運動性和侵襲性增加,同時誘導慢性炎癥的微生物病原體會促進EMT的發(fā)生[6],且該過程伴隨著細胞表面標志物表達水平的變化。

雖然糞腸球菌對于人類和動物的健康威脅已經(jīng)得到了研究者的共識,但是關(guān)于該菌突破腸上皮屏障的機制及該菌入侵細胞后對細胞炎性應(yīng)答的影響相關(guān)研究還較為缺乏。本研究通過構(gòu)建糞腸球菌體外感染豬小腸上皮細胞(intestinal porcine epithelial cells,IPEC)模型[7],經(jīng)染色鏡檢、間接免疫熒光觀察和掃描電子顯微鏡觀察糞腸球菌對IPEC-J2的黏附狀態(tài),并檢測了感染糞腸球菌后IPEC-J2中相關(guān)炎性因子包括促炎因子白細胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、IL-6、IL-8、IL-12和轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)的表達變化,觀察細胞的炎性反應(yīng);應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測了EMT標志物包括上皮細胞鈣黏蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)鈣黏蛋白(N-cadherin)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、蝸形蛋白(snail)和波形蛋白(vimentin)的轉(zhuǎn)錄水平變化,探究糞腸球菌感染對細胞表面標志蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株與細胞株來源

豬源糞腸球菌N8菌株和N41菌株,以及對照菌株大腸桿菌O157∶H7由河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院微生物實驗室保存并提供[8]。IPEC-J2由河南農(nóng)業(yè)大學預(yù)防獸醫(yī)系動物分子病原學團隊實驗室保存。

1.2 主要儀器

主要儀器包括熒光顯微鏡(日本Olympus公司)、場發(fā)射掃描電子顯微鏡SU8010(日本Hitachi公司)、酶標儀(美國Thermo公司)、WGZ-2XJ細菌濁度計(上海昕瑞儀器有限公司)、CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)、PCR儀(美國ABI公司)、熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)、CJ-ZDF凈化工作臺(天津市泰斯特儀器有限公司)和電泳儀(美國Thermo公司)等。

1.3 主要試劑

帶有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記和異硫氰酸酯(fluoresceine isothiocyanate,FITC)標記的羊抗兔二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;單抗Anti-β-catenin Rabbit、Anti-vimentin Rabbit和Anti-snail Rabbi購自美國Immunoway公司;其余試劑主要包括弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑(美國Sigma公司)、DMEM/F12營養(yǎng)液(Hyclone公司)、胎牛血清(Gibco公司)、低分子質(zhì)量預(yù)染Marker(安徽欣伯玉生物科技有限公司)、TaqDNA聚合酶(康為世紀生物科技有限公司)、增強型化學發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)顯色液(蘇州新賽美生物科技有限公司)、0.22 μm聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)(北京索萊寶科技有限公司)、腦心浸出液肉湯(brain heart infusion broth,BHI)(青島海博生物技術(shù)有限公司)和SYBR Green I(寶生物工程有限公司)等。

1.4 染色鏡檢觀察

在24孔細胞培養(yǎng)板中提前放置好細胞爬片并使IPEC-J2長成單層,然后用調(diào)整至5×107cfu·mL-1、感染復數(shù)(multiplicityofinfection,MOI)=100∶1的糞腸球菌進行感作,于37 ℃下孵育2 h后,用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗去未黏附的細菌,再以體積分數(shù)4%多聚甲醛溶液于37 ℃固定30 min。隨后,取出細胞爬片放置在載玻片上,分別進行革蘭氏染色和吉姆薩染色,在油鏡下觀察糞腸球菌黏附IPEC-J2狀態(tài)。

1.5 間接免疫熒光檢查

1.5.1 糞腸球菌的滅活與抗體制備 將活化的糞腸球菌培養(yǎng)物調(diào)整至1×108cfu·mL-1,以體積分數(shù)0.4%的甲醛溶液進行滅活(37 ℃、24 h)。將經(jīng)甲醛滅活的糞腸球菌N41菌液與弗氏佐劑(首次使用弗氏完全佐劑,之后使用弗氏不完全佐劑)等體積混合后,以多點皮下注射方式接種6周齡新西蘭白兔(購自河南省實驗動物中心,清潔級),免疫菌數(shù)為1×108cfu·只-1,每間隔14 d免疫1次,共接種3次,第3次免疫7 d后進行心臟采血,分離制備陽性血清;同時耳緣靜脈采集未免疫健康新西蘭白兔血制備陰性血清,于-20 ℃保存。動物試驗過程符合河南農(nóng)業(yè)大學動物倫理委員會的相關(guān)要求。

1.5.2 間接免疫熒光 同方法1.4制備黏附有糞腸球菌的細胞爬片,依次進行如下處理:1.5 mL細胞組織固定液(37 ℃,30 min),1.5 mL細胞破膜液(25 ℃,15 min),體積分數(shù)5%牛血清白蛋白溶液1.5 mL(37 ℃,60 r·min-1,2 h),每一步驟后均以PBS溶液洗滌3次。每孔加入1.5 mL稀釋至1∶200的兔抗糞腸球菌血清(一抗)孵育2 h(37 ℃,60 r·min-1),以PBS溶液洗滌3次;隨后每孔加入1.5 mL帶FITC標簽的羊抗兔二抗(1∶1 000稀釋),于37 ℃以60 r·min-1緩慢振搖50 min進行孵育,洗滌3次;每孔加入600 μL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino2-phenylindole,DAPI)溶液,25 ℃下孵育10 min,洗滌3次;最后,以體積分數(shù)60%甘油PBS溶液進行封閉。熒光顯微鏡下觀察糞腸球菌黏附IPEC-J2狀態(tài)。

1.6 場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察

同方法1.4制備黏附有糞腸球菌的細胞爬片,加入電鏡組織固定液(體積分數(shù)2%戊二醛),在4 ℃下固定1 h,用不同體積分數(shù)的丙酮溶液(10%、30%、50%、70%、90%和100%,各15 min)對樣品進行梯度脫水(置冰上),然后更換體積分數(shù)100%丙酮并使其恢復至25 ℃,用液態(tài)CO2進行臨界點干燥,通過濺射涂覆將干燥樣品涂覆于金鈀膜。使用Everhart Thornley SE檢測器和InLens SE檢測器以加速電壓3 kV在場發(fā)射掃描電子顯微鏡(Zeiss Merlin)下觀察糞腸球菌黏附IPEC-J2的狀態(tài)。

1.7 EMT標志物檢測

以大腸桿菌O157:H7為陽性對照,對糞腸球菌N41誘導IPEC-J2 EMT標志物的變化進行檢測和觀察。調(diào)整菌液含量至5×106cfu·mL-1(MOI=10∶1),于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2條件下感染單層IPEC-J2持續(xù)12 h,用PBS洗去未黏附細胞,將細胞板置于液氮速凍10 min以終止細胞的mRNA轉(zhuǎn)錄。用Trizol法提取細胞總RNA,然后用TaKaRa去基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)GenBank中公布的相關(guān)基因序列設(shè)計PCR引物(表1),以β-actin基因為內(nèi)參,檢測IPEC-J2上述EMT標志物的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

表1 檢測EMT標志物基因的PCR引物序列

收取每個培養(yǎng)孔的細胞,檢測每孔蛋白質(zhì)含量。用上樣緩沖液對樣品進行處理后進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳,將電泳產(chǎn)物半干轉(zhuǎn)印到0.22 μm PVDF膜上。以0.05 g·mL-1脫脂奶室溫封閉2 h,TBST洗滌3次。分別使用5種EMT標志物單抗4 ℃孵育過夜,以HRP標記羊抗兔抗體為二抗,經(jīng)ECL顯色后觀察結(jié)果。

1.8 IPEC-J2炎性因子表達的檢測

1.8.1 細胞樣品處理與總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 將活化的豬源糞腸球菌N8菌株和N41菌株以5×107cfu·mL-1(MOI=100∶1)感染單層IPEC-J2(24孔板),感作后定時使用PBS洗去游離細胞,將細胞板置液氮中速凍10 min,然后在-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將細胞板置于冰上,刮取細胞,然后用Trizol法提取細胞總RNA,用去基因組反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)進行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系為20 μL。所得cDNA樣品保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.8.2 細胞炎性因子的測定 根據(jù)GenBank公布的細胞因子基因序列設(shè)計PCR引物序列(表2),送至生工生物工程(上海)有限公司合成引物。PCR反應(yīng)體系為25 μL(上、下游引物各1 μL,TaqDNA聚合酶10 μL,ddH2O 11 μL,模板2 μL),反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性50 s,60 ℃退火50 s,72 ℃延伸40 s,共35個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。用質(zhì)量分數(shù)2%瓊脂糖凝膠電泳檢查引物的特異性。熒光定量PCR檢測以β-actin為內(nèi)參基因,試驗體系為20 μmoL·L-1的上、下游引物各1 μL,cDNA目的片段2 μL,2×SYBR Premix Ex Taq酶10 μL,用ddH2O補足至20 μL反應(yīng)體系。使用SYBR Green染料法,采用2步法,程序為95 ℃ 60 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,共40個循環(huán),并分析其熔解曲線,檢測各引物的特異性。

表2 檢測5種細胞因子的PCR引物名稱和序列

2 結(jié)果與分析

2.1 糞腸球菌黏附IPEC-J2的革蘭氏和吉姆薩染色鏡檢結(jié)果

將經(jīng)糞腸球菌感染后的單層IPEC-J2采用革蘭氏染色和吉姆薩染色后進行顯微鏡鏡檢,結(jié)果顯示,糞腸球菌可以黏附到IPEC-J2表面及細胞間的緊密連接處,且細菌在腸上皮細胞上的黏附并不均勻,出現(xiàn)聚集現(xiàn)象(圖1)。2種染色方法下所觀察到的糞腸球菌黏附IPEC-J2狀態(tài)具有一致性。

A為革蘭氏染色,B為吉姆薩染色。箭頭所指為黏附的糞腸球菌。

2.2 糞腸球菌黏附IPEC-J2的間接免疫熒光觀察

為了特異性觀察糞腸球菌對IPEC-J2的黏附,利用糞腸球菌N41菌株滅活菌免疫家兔制備了多克隆抗血清,用該一抗對爬片上的糞腸球菌進行感作,然后用帶FITC標記的羊抗兔二抗處理,同時使用DAPI進行細胞核染色并對IPEC-J2狀態(tài)進行定位。熒光顯微鏡下,與未感染糞腸球菌的IPEC-J2(陰性對照)相比,感染糞腸球菌的IPEC-J2的細胞膜上出現(xiàn)明顯的綠色熒光(圖2),表明帶FITC標簽的二抗成功與一抗結(jié)合,指示出糞腸球菌的存在。進一步觀察顯示,糞腸球菌并不是均勻黏附在IPEC-J2膜上,而是存在聚集現(xiàn)象。這一結(jié)果與染色鏡檢法一致。

A:IPEC-J2(陰性對照);B:糞腸球菌+IPEC-J2。箭頭所指綠色熒光為糞腸球菌。

2.3 場發(fā)射掃描電子顯微鏡對糞腸球菌黏附IPEC-J2的觀察

通過場發(fā)射掃描電子顯微鏡對糞腸球菌N41菌株的黏附進行觀察,掃描電子顯微鏡圖片顯示,作為體外模型的IPEC-J2系與體內(nèi)腸上皮細胞具有高度的形態(tài)學相似性,其頂端具有微絨毛(圖3-A);糞腸球菌與IPEC-J2的黏附發(fā)生在頂端微絨毛部位(圖3-B～C);糞腸球菌的黏附具有聚集性(圖3-B～C)。同時觀察到,糞腸球通過絨毛屏障與細胞壁結(jié)合并發(fā)生內(nèi)陷(圖3-D),這是細菌侵入細胞的初始階段。

2.4 糞腸球菌感染對IPEC-J2炎性因子轉(zhuǎn)錄水平的影響

利用熒光定量PCR技術(shù)檢測了糞腸球菌感染組和空白組IPEC-J2在不同時間段炎性因子轉(zhuǎn)錄水平。與對照組相比,感染組IPEC-J2的細胞因子IL-1β、IL-6和IL-8表達呈現(xiàn)出相似的炎癥反應(yīng)規(guī)律,其總體趨勢為感染后1～4 h炎癥反應(yīng)隨著時間而升高,而4～6 h間炎癥反應(yīng)降低,但仍高于空白組腸上皮細胞炎癥因子的表達水平(圖4-A～C)。同時,研究還發(fā)現(xiàn),不同糞腸球菌菌株對IPEC-J2中炎性因子表達的調(diào)節(jié)能力不同,其中,糞腸球菌N41菌株對IPEC-J2所引起的炎癥水平要高于N8菌株(p<0.05)。相反,糞腸球菌感染后,IPEC-J2中另外一些細胞因子的表達受到抑制,其中IL-12表達水平有顯著降低,TGF-β的表達也呈現(xiàn)下降趨勢,而糞腸球菌N8感染組的下降幅度均高于N41感染組(圖4-D～E)。

(A)IL-1β;(B)IL-6;(C)IL-8;(D)IL-12;(E)TGF-β。p<0.001標記為***。

2.5 細菌感染IPEC-J2后對上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物的影響

為了檢測糞腸球菌感染對上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物的影響,用出腸血性大腸桿菌O157∶H7作為陽性對照,以糞腸球菌N41菌株和大腸桿菌O157∶H7分別對IPEC-J2持續(xù)感染12 h,檢測、觀察IPEC-J2上皮標志物轉(zhuǎn)錄水平的變化。熒光定量PCR檢測結(jié)果表明,大腸桿菌O15∶H7增強了IPEC-J2的波形蛋白、蝸形蛋白和β-連環(huán)蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄水平,而糞腸球菌N41對這3種EMT標志物蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄水平影響不大;大腸桿菌O157∶H7促進了IPEC-J2的N-鈣黏蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄而抑制E-鈣黏蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄,糞腸球菌則抑制N-鈣黏蛋白和E-鈣黏蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄。針對上述mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化較大的EMT標志物波形蛋白、蝸形蛋白和β-連環(huán)蛋白進行了蛋白水平的檢測,結(jié)果顯示,上述3種標志物蛋白的表達量變化與其mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化具有較高一致性。大腸連環(huán)桿菌O157∶H7上調(diào)了波形蛋白、蝸形蛋白和β-連環(huán)蛋白的表達,而糞腸球菌N41對波形蛋白、蝸形蛋白和β-連環(huán)蛋白的表達量影響較小(圖5—圖6)。

p<0.05標記為*;p<0.01標記為**;p<0.001標記為***。

(+)感染豬源糞腸球菌或大腸桿菌O157∶H7;(-)正常細胞。

3 結(jié)論與討論

以不同毒力的豬源糞腸球菌菌株作為研究對象,通過染色鏡檢、免疫熒光、掃描電子顯微鏡試驗等手段,觀察了糞腸球菌對IPEC-J2的黏附,證實了糞腸球菌對IPEC-J2的體外黏附性,并發(fā)現(xiàn)了細菌黏附的不均勻性。細菌黏附到宿主細胞的機制有多種,有些細菌可分泌毒力因子,通過蛋白水解作用或激活其黏附活性而特異性地抑制靶連接蛋白(target junction proteins)[9]。在掃描電子顯微鏡觀察中發(fā)現(xiàn),與糞腸球菌接觸的細胞表面存在凹陷,這可能是糞腸球菌釋放的相關(guān)毒力因子如溶細胞素(cytolysin,Cyl)等造成的。溶細胞素也稱為細胞溶酶,是一種使糞腸球菌具備溶血性的獨特毒素,還能廣泛溶解包括革蘭氏陽性細菌和真核細胞在內(nèi)的多種靶細胞[10]。細胞溶素對糞腸球菌的致病性有較大作用,并在多種動物模型及臨床試驗中證實了細胞溶解素表達與腸球菌感染性增加的關(guān)系[11-13]。

機體內(nèi)多種細胞可以分泌細胞因子,而細胞因子種類眾多,它們相互之間通過協(xié)同、拮抗、疊加或遞進而構(gòu)成極為復雜的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)[14-16]。炎性細胞因子(如TNF-α、IL-1β和 IL-6等)在細菌感染后表達水平升高,在宿主的先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮著極其重要的作用,但其表達過高時又會反過來引起機體損傷[17]。LEECH等[18]報道,在抗金黃色葡萄球菌感染的應(yīng)答中,機體內(nèi)抗炎細胞因子IL-10表達水平明顯上升,且其表達可被促炎因子TNF-α上調(diào)。IL-1β主要在攝取抗原抗體復合物時產(chǎn)生,具有較強的促炎作用,并參與中性粒細胞募集。IL-6參與機體急性細菌感染性炎癥反應(yīng)的發(fā)生,在刺激Th細胞活化、抑制Treg細胞和B細胞分化中均具有調(diào)節(jié)作用[19]。趨化因子IL-8是巨噬細胞和上皮細胞等分泌的細胞因子。IL-12是一種具有多種生物活性的細胞因子,能調(diào)節(jié)T淋巴細胞和NK細胞分化與增殖,誘導IFN-γ生成,促進Th1細胞分化[20]?？寡滓蜃覶GF-β不僅參與組織修復、胚胎發(fā)育、炎癥反應(yīng)等過程,能抑制PBMC中IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生,對細胞的免疫功能也具有顯著調(diào)節(jié)作用[21-23]。糞腸球菌雖然是哺乳動物胃腸道的共生細菌,但也是一種機會性致病菌,在某些情況下可引起嚴重疾病,在此過程中,也有多種細胞因子發(fā)揮著作用。本研究分別用2株糞腸球菌感染IPEC-J2后,均能促進炎性因子IL-1β、IL-6和IL-8的表達,且其變化規(guī)律基本一致,而毒力較強的N41菌株的促進作用更強。同時,2株糞腸球菌感染后對上皮細胞中IL-12和TGF-β的表達均有一定的抑制作用,尤以IL-12為甚。造成上述變化的原因有可能與菌株的毒力相關(guān),王亞賓等[24]研究已經(jīng)證實糞腸球菌N41菌株的致病性高于N8菌株,因此其引起的炎癥反應(yīng)會更為強烈。但上述變化對糞腸球菌致病性的確切影響及其機制還有待于進一步探究。

機體細胞發(fā)生EMT可使上皮標志物(E-鈣黏蛋白、閉合蛋白、橋粒蛋白)的表達降低,而間充質(zhì)標志物(玻連蛋白,成纖維細胞特異性蛋白,平滑肌肌動蛋白,波形蛋白,纖連蛋白,N-鈣黏蛋白等)的表達升高[25]。誘導慢性炎癥的微生物病原體可促進EMT的發(fā)生[26]。本研究表明,糞腸球菌感染IPEC-J2后,并未對波形蛋白、蝸形蛋白、β-連環(huán)蛋白和E-鈣黏蛋白的表達水平造成明顯影響,甚至下調(diào)了N-鈣黏蛋白的表達水平,這表明作為條件性致病菌的糞腸球菌對細胞骨架遷移及病理性間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程并無明顯促進作用。