李娜,王悅欣,李孝法,王璐陽,梁冠達(dá),李俊強(qiáng),張龍現(xiàn),李曉迎

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽類產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450046; 2.河南三高農(nóng)牧股份有限公司,河南 固始 465200)

成簇的有規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)是一類重復(fù)的DNA序列,與CRISPR相關(guān)蛋白(Cas蛋白)組成了CRISPR/Cas系統(tǒng),對(duì)外來入侵的核苷酸(如噬菌體和質(zhì)粒DNA)產(chǎn)生免疫力[1]。根據(jù)所含Cas蛋白種類與降解外源核酸的機(jī)制不同,CRISPR/Cas系統(tǒng)被分為三大類型,即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系統(tǒng)的免疫機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜,在基因組工程中沒有得到應(yīng)用,而Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)只需要1個(gè)Cas蛋白(Cas9蛋白)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)基因的編輯[2]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的靶向切割需要3個(gè)組分,包括Cas9蛋白、CRISPR RNA (crRNA)和轉(zhuǎn)活化crRNA(trans-activating crRNA,tracrRNA)[3]。在適應(yīng)階段,攜帶1個(gè)或多個(gè)CRISPR基因座的細(xì)菌和古生菌通過將外來序列(protspacers)的短片段整合到CRISPR陣列近端的宿主染色體中來應(yīng)對(duì)病毒的攻擊[4-5]。在表達(dá)和干擾階段,重復(fù)間隔元件轉(zhuǎn)錄成前體CRISPR RNA(precursor crRNA,pre-crRNA)分子,然后酶切產(chǎn)生短的crRNA,與入侵病毒的互補(bǔ)原始間隔序列配對(duì),Cas9蛋白與crRNA形成復(fù)合體來指導(dǎo)外源序列的沉默[6-11]。在Cas9蛋白結(jié)合到靶點(diǎn)并對(duì)靶點(diǎn)切割后,斷裂的雙鍵通過同源重組修復(fù)(homology directed repair,HDR)或非同源末端(non-homologous end joining,NHEJ)來進(jìn)行修復(fù)[12]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物模型及體外細(xì)胞系的基因敲除或敲入[13-16],進(jìn)行基因編輯的第一步是要將目的基因的小向?qū)NA(small guide RNA,sgRNA)導(dǎo)入到表達(dá)Cas9蛋白的細(xì)胞系中。但是,Cas9蛋白是大分子,將其導(dǎo)入細(xì)胞是應(yīng)用該系統(tǒng)的一大難題。研究表明,Cas9蛋白及其相關(guān)向?qū)NA(guide RNA,gRNA)RNA的質(zhì)?？梢员徽系讲《据d體中,研究人員利用這一特點(diǎn)開發(fā)設(shè)計(jì)了慢病毒載體系統(tǒng);慢病毒載體可以將目的基因高效地整合到宿主基因組中,也是將Cas9蛋白導(dǎo)入到目的細(xì)胞系中最常用的方式[17]。人回盲腸癌(human ileocecal adenocarcinoma,HCT-8)細(xì)胞系是單層貼壁細(xì)胞,廣泛應(yīng)用于類器官培養(yǎng)、癌癥研究和藥物毒性研究[18-21],目前常用于隱孢子蟲體外培養(yǎng)等[22-23]。本研究利用慢病毒感染的方式,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的HCT-8細(xì)胞系,為后續(xù)靶標(biāo)基因的編輯奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

HEK293T細(xì)胞系、HCT-8細(xì)胞系均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部禽類產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并提供。LentiCas9-Blast質(zhì)粒、pXPR_011質(zhì)粒購自Addgene公司;慢病毒pMD2.G、pSPAX2質(zhì)粒由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng);大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京莊盟生物有限公司;鼠源Cas9單克隆抗體購自Cell Signaling Technology公司;HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;嘌呤霉素、殺稻瘟菌素、多聚賴氨酸、聚凝胺均購自北京索萊寶科技有限公司;轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 LentiCas9-Blast慢病毒的包裝 HEK293T細(xì)胞接種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,接種前用0.025 g·L-1的多聚賴氨酸包被,37 ℃放置1 h,待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)皿至超凈臺(tái)內(nèi),將舊的培養(yǎng)基棄去,用PBS溶液洗滌3次,再更換為Opti-MEM培養(yǎng)基,采用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染。LentiCas9-Blast、pSPAX2和pMD2.G這3種質(zhì)粒按照質(zhì)粒質(zhì)量比為4∶3∶1進(jìn)行轉(zhuǎn)染,總質(zhì)粒與感染試劑質(zhì)量比為1∶3,混勻后,室溫(25 ℃)靜置5 min。將已靜置完的混合液逐滴緩慢加入Opti-MEM培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)6 h后吸去Opti-MEM培養(yǎng)基,加入8 mL RPMI 1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)到48 h后收集上清液,保存于4 ℃,同時(shí)加入8 mL正常培養(yǎng)基;培養(yǎng)到72 h再次收集上清液,并與48 h收集的上清液混在一起,2 000 r·min-1離心10 min,將上清液用0.45 μm的濾膜過濾,分裝到1.5 mL無菌EP管中于-80 ℃保存,用于后續(xù)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)試驗(yàn)。

1.2.2 目的細(xì)胞系的獲取 待HCT-8細(xì)胞傳至第5～6代,將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞均勻鋪至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí),棄去舊培養(yǎng)基,用PBS漂洗3次,加入1.5 mL慢病毒液和1 mL含10 mg·L-1聚凝胺的RPMI 1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清)培養(yǎng)細(xì)胞,留1孔作空白對(duì)照。于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后更換含15 mg·L-1殺稻瘟菌素的RPMI 1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞,直至陰性對(duì)照組細(xì)胞全部死亡,采用有限稀釋法對(duì)陽性細(xì)胞進(jìn)行單克隆篩選并擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.3 HCT-8-Cas9單克隆細(xì)胞系的鑒定 將挑選出的HCT-8-Cas9單克隆細(xì)胞提取全基因組,根據(jù)目的基因序列(Gene ID: 61270322)設(shè)計(jì)引物對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增,引物序列見表1。擴(kuò)增體系如下:2×TSINGKE? Master Mix 12.5 μL,Cas9-F/R(10 μm)各1 μL,基因組DNA 2 μL,補(bǔ)水至25 μL;擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸l min,反應(yīng)35個(gè)循環(huán),72 ℃繼續(xù)延伸7 min。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%瓊脂糖凝膠上電泳分離。另取部分細(xì)胞進(jìn)行Western Blot試驗(yàn),用RIPA裂解液將細(xì)胞裂解,取裂解液進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分析,而后轉(zhuǎn)印至0.45 μm的聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜上,恒流400 mA,常溫轉(zhuǎn)膜30 min;將PVDF膜置于5%脫脂牛奶封閉2 h,以鼠源Cas9 MAb(1∶1 000)為一抗,4 ℃過夜孵育后用PBST洗滌3遍,以羊抗鼠IgG-HRP(1∶10 000)為二抗,室溫孵育2 h,PBST洗滌3遍后在PVDF膜上滴加顯色液,置于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(GE AI 680)中拍照觀察和圖像采集,檢測(cè)HCT-8細(xì)胞系中Cas9蛋白的表達(dá)情況。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物序列

1.2.4 pXPR_011慢病毒的制備及慢病毒液滴度測(cè)定 慢病毒載體pXPR_011可用于檢測(cè)Cas9蛋白的活性,該質(zhì)粒同時(shí)含有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)序列及針對(duì)GFP基因的gRNA序列。細(xì)胞內(nèi)Cas9蛋白會(huì)在gRNA的引導(dǎo)下對(duì)GFP基因進(jìn)行切割,因此細(xì)胞表達(dá)的GFP越少,說明Cas9蛋白的基因編輯效率越高,并可用流式細(xì)胞儀準(zhǔn)確地對(duì)GFP陽性和陰性細(xì)胞的比例進(jìn)行定量。按照1.2.1的步驟獲得慢病毒質(zhì)粒pXPR_011高滴度的重組慢病毒液。將HCT-8細(xì)胞系按1×104個(gè)·孔-1接種于96孔板,并將獲得的慢病毒液按比例稀釋進(jìn)行感染(1.56、3.12、6.25、12.5、25、50、100 μL),48 h后,以未感染慢病毒液的HCT-8細(xì)胞為陰性對(duì)照,用CytoFLEX流式細(xì)胞儀分析HCT-8細(xì)胞中表達(dá)GFP的細(xì)胞比例。病毒滴度/(TU·mL-1)=(初始感染細(xì)胞數(shù)×GFP陽性細(xì)胞比例)/(病毒體積)×1 000[24-25]。

1.2.5 HCT-8-Cas9單克隆細(xì)胞系基因編輯效率檢測(cè) 將HCT-8和HCT-8-Cas9單克隆細(xì)胞系按1×105個(gè)·孔-1接種于6孔板,并用pXPR_011慢病毒液以MOI=0.8分別進(jìn)行感染,以確保每個(gè)細(xì)胞都被1個(gè)pXPR_011慢病毒顆粒感染,48 h后更換含2 mg·L-1嘌呤霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基,之后2 d更換1次含2 mg·L-1嘌呤霉素RPMI 1640培養(yǎng)基,同時(shí)觀察GFP的表達(dá)情況。未處理的HCT-8細(xì)胞系作為陰性對(duì)照,感染慢病毒液的HCT-8細(xì)胞系作為陽性對(duì)照,篩選7 d后,用CytoFLEX流式細(xì)胞儀對(duì)上述試驗(yàn)組進(jìn)行分析,用SPSS 24.0對(duì)基因編輯效率進(jìn)行計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.2.6 HCT-8-Cas9單克隆細(xì)胞系細(xì)胞活性驗(yàn)證 將Cas9蛋白表達(dá)量較高的HCT-8-Cas9_2、HCT-8-Cas9_4單克隆細(xì)胞系以及HCT-8細(xì)胞系分別以1×104個(gè)·孔-1接種于96孔板,每組設(shè)置6個(gè)重復(fù),培養(yǎng)24 h后更換為10 μL CCK-8試劑和90 μL含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基的混合液,繼續(xù)培養(yǎng)2 h后用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度在450 nm時(shí)的數(shù)值,并用Graph Pad Prism 9進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 HCT-8-Cas9單克隆細(xì)胞系的篩選

將HCT-8-Cas9細(xì)胞接種到96孔板中,采用有限稀釋法使每孔接種1個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)7 d,在顯微鏡下觀察每孔中細(xì)胞生長情況,共篩選出8株單克隆細(xì)胞系,從中選取能成功表達(dá)Cas9蛋白的6株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),分別命名為HCT-8-Cas9_1、HCT-8-Cas9_2、HCT-8-Cas9_3、HCT-8-Cas9_4、HCT-8-Cas9_5、HCT-8-Cas9_6。

2.2 PCR試驗(yàn)檢測(cè)Cas9基因的整合情況

收集篩選的6株單克隆細(xì)胞系,分別取少量細(xì)胞提取基因組,用Cas9-F、Cas9-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以檢測(cè)目的基因的整合情況。如圖1所示,擴(kuò)增基因大小為738 bp,6株單克隆細(xì)胞系均可以擴(kuò)增出與預(yù)期大小相符的基因片段,表明Cas9基因已成功整合到HCT-8細(xì)胞基因組上。

M:Marker;1:HCT-8-Cas9_1;2:HCT-8-Cas9_2;3:HCT-8-Cas9_3;4:HCT-8-Cas9_4;5:HCT-8-Cas9_5;6:HCT-8-Cas9_6;7:對(duì)照;8:HCT-8細(xì)胞;9:H2O。

2.3 Western Blot試驗(yàn)檢測(cè)Cas9蛋白表達(dá)情況

用RIPA裂解緩沖液提取HCT-8-Cas9單克隆細(xì)胞總蛋白,并以HCT-8細(xì)胞裂解液為對(duì)照。Western Blot結(jié)果顯示,HCT-8-Cas9_2和HCT-8-Cas9_4細(xì)胞系的Cas9蛋白表達(dá)水平較高(圖2),表明這2個(gè)細(xì)胞系比較適合后續(xù)HCT-8細(xì)胞系Cas9蛋白基因編輯效率的檢測(cè)。

1:HCT-8-Cas9_1;2:HCT-8-Cas9_2;3:HCT-8-Cas9_3;4:HCT-8-Cas9_4;5:HCT-8-Cas9_5;6:HCT-8-Cas9_6.

2.4 pXPR_011慢病毒滴度的測(cè)定結(jié)果

將稀釋的pXPR_011慢病毒液分別感染1×104個(gè)HCT-8細(xì)胞系,48 h后,以未感染慢病毒液的HCT-8細(xì)胞為對(duì)照,分析HCT-8細(xì)胞中表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞比例。如圖3所示,用25 μL慢病毒液進(jìn)行感染時(shí),表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞比例20.1%。在此基礎(chǔ)上計(jì)算該慢病毒液滴度為4.02×105TU·mL-1,用于后續(xù)感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)的計(jì)算。

圖3 pXPR_011慢病毒液滴度測(cè)定流式細(xì)胞儀分析結(jié)果

2.5 HCT-8-Cas9單克隆細(xì)胞系基因編輯效率檢測(cè)結(jié)果

將獲得的pXPR_011重組慢病毒液以MOI=0.8的劑量分別感染HCT-8和HCT-8-Cas9細(xì)胞系,7 d后,利用流式細(xì)胞儀CytoFLEX對(duì)樣本進(jìn)行分析。如表2所示,HCT-8-Cas9_4細(xì)胞系表達(dá)的GFP較少,加入25 μL慢病毒液時(shí),表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞占20.1%,Cas9基因編輯效率為48.82%,顯著高于其他5株HCT-8-Cas9細(xì)胞系(p<0.05),這表明HCT-8-Cas9_4單克隆細(xì)胞系在后續(xù)的敲除中可以發(fā)揮更為高效作用。

表2 HCT-8-Cas9單克隆細(xì)胞系基因編輯效率結(jié)果

2.6 穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的HCT-8細(xì)胞系的細(xì)胞活性

采用CCK-8試劑檢測(cè)HCT-8-Cas9_2、HCT-8-Cas9_4細(xì)胞系的活性。如圖4所示,HCT-8-Cas9_2及HCT-8-Cas9_4的細(xì)胞活性與HCT-8細(xì)胞相比均無顯著差異(p>0.05),表明穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白對(duì)HCT-8細(xì)胞的活性無顯著影響,且能在HCT-8細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。

ns表示無顯著差異(p>0.05)。

3 結(jié)論與討論

基因編輯技術(shù)能夠?qū)蚪MDNA進(jìn)行精準(zhǔn)修飾,近年來得到迅猛發(fā)展。目前,只有3種技術(shù)可用于靶向基因編輯,即鋅指核酸酶 (zinc-finger nucleases,ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶 (transcription activator-like effector nucleases,TALEN)及CRISPR/Cas9技術(shù)[26-27]。相較于其他2種基因編輯技術(shù),CRISPR/Cas9技術(shù)只需要設(shè)計(jì)和目標(biāo)核酸對(duì)應(yīng)的RNA序列,便可對(duì)哺乳動(dòng)物等細(xì)胞基因組進(jìn)行精準(zhǔn)修飾,具有高效、簡便且便宜等特點(diǎn),因此被廣泛應(yīng)用于篩選和鑒定功能基因[28]。在CRISPR/Cas9技術(shù)出現(xiàn)之前,RNA干擾(RNAi)技術(shù)被應(yīng)用于功能基因的篩查[29-31]。但該技術(shù)不能完全抑制基因表達(dá)而導(dǎo)致假陽性[32-33],影響對(duì)基因功能的正確判斷。CRISPR/Cas9技術(shù)能夠在基因組中進(jìn)行編輯,既能避免RNA干擾技術(shù)抑制不徹底的情況,也能在不同物種和不同細(xì)胞中進(jìn)行,具有其他技術(shù)手段不可比擬的優(yōu)勢(shì)[34]。SHALEM等[35]首次在人體細(xì)胞內(nèi)成功用CRISPR/Cas9系統(tǒng)完成了基因編輯。該發(fā)現(xiàn)給CRISPR/Cas系統(tǒng)帶來了巨大變革。

HCT-8細(xì)胞應(yīng)用廣泛且易于培養(yǎng),是類器官培養(yǎng)、高通量篩選、藥物毒性研究和寄生蟲培養(yǎng)等重要載體。本研究建立HCT-8細(xì)胞系的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng),對(duì)于保證后續(xù)靶標(biāo)基因的高效敲除,以及篩選具有高切割效率的HCT-8-Cas9單克隆細(xì)胞系至關(guān)重要。為了保證單克隆細(xì)胞系來源于同一細(xì)胞克隆,采用有限稀釋法分選,共篩選出8株HCT-8-Cas9單克隆細(xì)胞系,但有2株沒有檢測(cè)到Cas9蛋白的表達(dá),因此從中選取6株能穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的細(xì)胞系進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。為了驗(yàn)證所挑選細(xì)胞系的基因編輯效率,以MOI=0.8的pXPR_011慢病毒液感染單克隆細(xì)胞系,并通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明HCT-8-Cas9_4的基因編輯效率在第7 d達(dá)到48.82%,與張紀(jì)文等[36]和覃鴻妮等[37]所構(gòu)建的CRISPR/Cas9基因編輯細(xì)胞系相比效率偏低,可能與基因插入位點(diǎn)及細(xì)胞系類型有關(guān)。下一步可通過對(duì)單克隆細(xì)胞系二次單克隆化進(jìn)一步提高其編輯效率。對(duì)HCT-8-Cas9單克隆細(xì)胞系活性進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示HCT-8-Cas9_2和HCT-8-Cas9_4與HCT-8細(xì)胞活性均無顯著差別。這表明,HCT-8-Cas9_4為本試驗(yàn)獲取的最優(yōu)單克隆細(xì)胞系,能穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白,并具有良好的基因編輯效率,為后續(xù)靶標(biāo)基因的編輯奠定基礎(chǔ)。