食品中副溶血性弧菌和單核細胞增生李斯特氏菌能力驗證結(jié)果分析

◎ 陸 雯，彭醒醒，朱晗昀，俞琦婭，王 珍

（綠城農(nóng)科檢測技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310000）

能力驗證是認可實驗室技術(shù)能力的重要方式，它已經(jīng)成為中國合格評定國家認可委員會保障實驗室認可的手段[1]。參加能力驗證可幫助實驗室發(fā)現(xiàn)潛在問題，及時采取預(yù)防措施，提高實驗室的技術(shù)能力和管理水平。

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）和單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes，LM）是重要的食源性致病菌。VP 為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，具有嗜鹽性，主要存在于海產(chǎn)品中，是許多沿海國家發(fā)生食物中毒的重要病原菌之一，該病菌在中國位居食源性細菌感染疾患的前3 位[2]。李斯特菌屬（Liareria）共分2 個群，7 個種，LM 簡稱單增李斯特菌，為革蘭氏陽性短桿菌，是唯一能引起人畜共患病的病原菌，20 世紀90 年代被WHO 列為四大食源性致病菌之一，其余3 種為大腸桿菌O157:H7、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌。LM 能引起腸胃炎、敗血癥、腦膜炎和流產(chǎn)等，對免疫力低下、孕婦等人群影響較大，廣泛存在于自然界中[3-4]。目前，VP 和LM的檢測技術(shù)主要有傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)、全自動鑒定系統(tǒng)、分子生物學(xué)檢測技術(shù)等，如熒光定量PCR 檢測法、MALDI 飛行時間質(zhì)譜（MALDI-Time of Flight Mass Spectrometer，MALDI-TOF-MS）、微流控檢測等[4-8]。本實驗室采用傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)及普通生化鑒定的方法，結(jié)合熒光定量PCR 檢測法和MALDI 飛行時間質(zhì)譜檢測進一步確認結(jié)果，分析過程中出現(xiàn)的可疑現(xiàn)象，提高結(jié)果的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

ACAS-PT1599 食品中副溶血性弧菌（定性）檢測能力驗證、ACAS-PT1366 乳粉中單核細胞增生李斯特氏菌（定性）檢測能力驗證，各2 份樣品，均由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院組織實施。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

3%TSA、3%氯化鈉堿性蛋白胨水、TCBS、弧菌顯色培養(yǎng)基、LM 生化鑒定試劑盒、李氏菌增菌肉湯（LB1，LB2）基礎(chǔ)與配套添加劑、LM 顯色培養(yǎng)基、PALCAM 瓊脂、TSA-YE 瓊脂，購自海博生物技術(shù)有限公司；副溶血性弧菌細菌生化鑒定盒，購自環(huán)凱微生物科技有限公司；羊血瓊脂平板，購自北京陸橋生物技術(shù)有限公司；Premix Ex TaqTM（RR390Q）試劑盒，購自寶生物工程有限公司。

1.1.3 引物探針

采用《出口食品中食源性致病菌檢測方法 實時熒光PCR法》（SN/T 1870 2016）[12]提供的引物探針序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.4 對照菌株

副溶血性弧菌ATCC17802、單核細胞增生李斯特氏菌CICC23929、英諾克李斯特氏菌ATCC33090、伊氏李斯特氏菌ATCC19119、斯氏李斯特氏菌ATCC35967，均為本實驗室保存的工作菌株。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-250F 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HFSafe-1500LC 生物安全柜，力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；BagnMixer400CC 拍擊氏均質(zhì)器，法國英特塞恩斯有限公司；BSA224S 電子天平，德國賽多利斯公司；精密移液器，德國艾本德股份公司；CFX96熒光定量PCR 儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；rapifleX MALDI-TOF-MS，美國布魯克道爾頓公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 副溶血性弧菌樣品檢驗方法

（1）傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)檢驗。按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 副溶血性弧菌檢驗》（GB 4789.7 2013）[9]檢測2 個樣品。

（2）熒光定量PCR 擴增。取經(jīng)GB 4789.7 2013[9]中的方法增菌的培養(yǎng)物1 mL，置于1.5 mL 離心管中，8 000 r·min-1離心1 min，棄去液體，沉淀物用無菌水反復(fù)清洗離心2 次，用100 μL 無菌水制成菌懸液，100 ℃處理5 min，此液體作為模板，根據(jù)SN/T 1870 2016[12]，開展副溶血性弧菌熒光定量PCR 擴增實驗。

（3）飛行質(zhì)譜鑒定。用1 μL 接種環(huán)挑取經(jīng)過3%TSA純化的可疑菌落，均勻涂布于靶板上，滴加1 μL MS-CHCA 基質(zhì)液，待其干燥，放入飛行質(zhì)譜儀器進行檢測，自動圖譜分析，給出確信分值，得出鑒定結(jié)果。

1.3.2 單增李斯特菌樣品檢驗方法

（1）傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)檢驗。按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》（GB 4789.30 2016）[10]第一法進行檢測。

（2）熒光定量PCR 擴增。分別取經(jīng)GB 4789.30 2016）[10]方法中LB1、LB2增菌的培養(yǎng)液進行單增李斯特菌熒光定量PCR 擴增實驗，具體步驟同1.3.1（2）。

（3）飛行質(zhì)譜鑒定。取經(jīng)過TSA-YE 瓊脂培養(yǎng)基純化的可疑菌落，進行飛行質(zhì)譜鑒定，步驟同1.3.1（3）。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血性弧菌樣品檢驗結(jié)果

2.1.1 傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)檢驗結(jié)果

副溶血性弧菌樣品檢驗結(jié)果見表1、表2。2 個樣品經(jīng)3%氯化鈉堿性蛋白胨水增菌液培養(yǎng)后變渾濁，說明樣品中存在活的微生物。培養(yǎng)物分別劃線接種平板進行分離，培養(yǎng)后顯色平板上分離出典型菌落，TCBS平板上分離出綠色具有口香糖質(zhì)感的可疑菌落，分別轉(zhuǎn)接3%TSA 平板純化培養(yǎng)，菌落形態(tài)、氧化酶試驗、革蘭氏染色鏡檢、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂穿刺反應(yīng)、嗜鹽試驗及生化鑒定結(jié)果均與副溶血性弧菌相符，即樣品中檢出副溶血性弧菌。

表1 副溶血性弧菌初步鑒定結(jié)果表

表2 副溶血性弧菌生化鑒定結(jié)果表

2.1.2 熒光定量PCR 擴增結(jié)果

利用副溶血性弧菌引物探針對副溶血性弧菌樣品增菌液進行熒光定量PCR 擴增反應(yīng)，出現(xiàn)了與副溶血性弧菌陽性對照一致的典型“S”型曲線，見圖1。在檢測開始24 h 內(nèi)，確認樣品副溶血性弧菌陽性。

圖1 副溶血性弧菌樣品擴增結(jié)果圖

2.1.3 飛行質(zhì)譜鑒定結(jié)果

副溶血性弧菌樣品經(jīng)1.3.1（3）步驟上機分析，結(jié)果顯示為副溶血性弧菌，2 個樣品得分為1.894、2.076，得分為1.7 ～3.0 表示陽性結(jié)果，檢測48 h 內(nèi)進一步確認樣品檢測結(jié)果為副溶血性弧菌陽性。

2.2 單增李斯特菌樣品檢驗結(jié)果

2.2.1 傳統(tǒng)生物學(xué)培養(yǎng)檢驗結(jié)果

單增李斯特菌樣品檢驗結(jié)果見表3、表4。2 個樣品經(jīng)LB1、LB2增菌液培養(yǎng)后變渾濁，說明樣品中存在活的微生物。

表3 單增李斯特菌初步鑒定結(jié)果表

表4 單增李斯特菌生化鑒定結(jié)果表

培養(yǎng)物劃線接種平板進行分離，培養(yǎng)后顯色平板上分離出典型菌落，PALCAM 平板上分離出灰綠色中間有黑色凹陷的菌落，分別轉(zhuǎn)接TSA-YE 瓊脂平板純化培養(yǎng)，菌落形態(tài)、酶促試驗、革蘭氏染色鏡檢、溶血試驗及生化鑒定結(jié)果均與單增李斯特菌相符，但其中一個樣品的溶血試驗可疑，溶血圈大小界于伊氏李斯特氏菌和單增李斯特菌之間，如圖2 所示。結(jié)合熒光定量PCR 和飛行質(zhì)譜鑒定結(jié)果，排除可疑，確認樣品中檢出單增李斯特氏菌。

圖2 單增李斯特菌樣品2 溶血試驗結(jié)果圖

2.2.2 熒光定量PCR 擴增結(jié)果

利用單增李斯特菌引物探針對單增李斯特菌樣品進行熒光定量PCR 擴增反應(yīng)，出現(xiàn)了與單增李斯特菌陽性對照一致的典型“S”型曲線，見圖3。在檢測24 ～48 h 內(nèi)確認樣品檢測結(jié)果為單增李斯特氏菌陽性。

2.2.3 飛行質(zhì)譜鑒定結(jié)果

單增李斯特菌樣品經(jīng)過上機分析，結(jié)果顯示為單增李斯特菌，得分在1.7 以上，得分1.7 ～3.0 表示陽性結(jié)果，在檢測開始48 h 內(nèi)進一步確認樣品檢測結(jié)果為單增李斯特菌陽性。

3 結(jié)論與討論

ACAS-PT1599 的2 個樣品均檢出副溶血性弧菌，ACAS-PT1366 的2 個樣品均檢出單增李斯特菌，上報結(jié)果后獲得滿意結(jié)果。本次能力驗證采用了常規(guī)國家標準方法，借助熒光定量PCR 法和飛行質(zhì)譜進行輔助確認，使結(jié)果更加可靠。此外，檢測人員掌握了不同方法，提高了檢測人員和實驗室的檢測水平。

副溶血性弧菌和單增李斯特菌常規(guī)國家標準方法檢測周期一般需要4 ～7 d，副溶血性弧菌常規(guī)國家標準方法中的嗜鹽試驗需通過肉眼判斷菌體的生長情況，易出現(xiàn)偏差，單增李斯特菌常規(guī)國家標準方法中溶血試驗表現(xiàn)出狹窄清晰的溶血圈，但本次單增李斯特菌能力驗證中樣品2 分離的可疑菌落表現(xiàn)出的溶血圈大小介于伊氏李斯特氏菌和單增李斯特氏菌之間，在結(jié)果判定上存在干擾。利用熒光定量PCR 儀或飛行質(zhì)譜不僅可在48 h 內(nèi)確認結(jié)果，還能排除傳統(tǒng)方法鑒定確認過程中的可疑菌落，使結(jié)果更可靠。