蔡 凌,賀黎銘,李 芳,姚 珂,羅 霞

(四川省中醫(yī)藥科學院/菌類藥材系統(tǒng)研究與開發(fā)實驗室/中藥材品質及創(chuàng)新中藥研究四川省重點實驗室,成都 610041)

靈芝又稱神芝、仙草、瑞草,屬于擔子菌綱多孔菌科靈芝屬,是一味傳統(tǒng)的名貴中藥。含有多糖(肽)、靈芝三萜等多種藥用活性成分[1],具有抗腫瘤、降低血糖和血壓、消炎、利尿、益胃、提高機體免疫力等多種功效[2],在中醫(yī)藥界享有極高的美譽。近年來,科研人員在靈芝育種方面取得了一些進展,文章概述了靈芝選擇育種、誘變育種、原生質體融合育種、基因工程育種等育種技術的研究和應用,以期為靈芝育種工作提供參考。

1 選擇育種

靈芝選擇育種是從野生靈芝子實體中分離獲得菌絲體,經過栽培馴化試驗,篩選獲得優(yōu)良菌種的方法,在靈芝育種工作中廣泛采用。陳體強等[3-4]通過馴化福建野生紫芝,成功獲得2個適于推廣栽培的菌株“紫S2(黑)”“閩紫96”。蘭玉菲等[5]以泰山野生種馴化選育成具有產量高,出芝整齊等特點的靈芝新品種“泰山赤靈芝1號”。唐明先等[6]從野生藏靈芝菌株中馴化培育而成靈芝新品“康定靈芝”,該菌株出芝整齊、農藝性狀穩(wěn)定。林興生等[7]從南非夸祖魯納塔爾省采集的野生靈芝經馴化培育而成形狀好,產量高,有效活性成分高的靈芝新品種“南GL11”。

2 誘變育種

靈芝誘變育種可采用物理誘變(紫外線等)、化學誘變(氯化鋰、甲基磺酸乙酯等)、太空環(huán)境、離子束注入誘變方法處理孢子、菌絲體、原生質體,提高發(fā)生基因突變頻率,在較短的時間內獲得較多的優(yōu)良變異類型。

2.1 紫外誘變

靈芝進行紫外誘變育種通常選用10～30W功率的紫外燈,誘照距離在20～45cm區(qū)間,誘照時間為30～120s,采用的材料包括組織塊、孢子懸浮液、菌絲體、原生質體。張倫等[8]采用紫外燈對野生靈芝組織塊進行誘照120s,2d后再對剛萌發(fā)的菌絲進行第2次誘照處理,篩選獲得了多孢靈芝菌株,產孢量從3.78%提升至8.48%。羅立新等[9]利用紫外燈對靈芝孢子懸浮液進行60s誘照處理,選育出高產菌株UV-60S,其菌體干重達13.1g/L,粗多糖含量為640mg/L,分別比原菌株提高了21.3%和30.6%。張帥等[10]利用20W紫外燈照射靈芝菌種瓊脂塊10min,發(fā)現(xiàn)靈芝菌絲體多糖含量可達 9.57%,比未經紫外照射的靈芝菌絲體多糖含量提高了 3.45%。余昭瑋[11]利用20W紫外燈,20cm距離照射靈芝菌絲體懸浮液30s,發(fā)現(xiàn)誘變株液態(tài)發(fā)酵所得菌絲干重、菌絲多糖、胞外多糖與原始菌株相比分別提高了 16.1%、15.5%、18.0%。朱芬等[12]選擇15W紫外燈,30cm距離誘照原生質體30s,獲得了菌絲干重和三萜含量穩(wěn)定提高的誘變株UV-3,分別比出發(fā)菌株高58.6%和29.4%。孫金旭等[13]利用20W紫外燈,距離40cm照射原生質體60s,獲得了菌體產量相對提高38.71%,多糖產量相對提高79.16%的高產突變株Hs-26。董玉瑋等[14]選擇15W紫外燈,距離30cm照射原生質體30s,選育出3株高產有機鍺誘變赤靈芝菌株,有機鍺含量分別比出發(fā)菌株提高了113.58%、105.87%、103.86%。劉月芹等[15]用功率為10W的紫外燈,距離20cm照射原生質體30s,篩選出能在37℃高溫下生長的靈芝新菌株。

2.2 化學誘變

靈芝化學誘變常用的誘變劑包括氯化鋰、甲基磺酸乙酯、亞硝酸鈉等。其中氯化鋰在提升鍺含量、胞內、胞外三萜方面較紫外誘變效果更佳、在提升胞外多糖產量較甲基磺酸乙酯、亞硝酸效果更佳。董玉瑋等[16]采用氯化鋰誘變赤靈芝原生質體,發(fā)現(xiàn)經0.3%氯化鋰誘變,誘變菌株鍺含量比原發(fā)菌株提高了269.02%,胞內、胞外三萜類產量達到最高,比原菌株分別提高了461.72%和136.57%[17]。紫外誘變選育的高產有機鍺菌株僅較出發(fā)菌株提高113.58%[14],多糖產量相對提高79.16%[14],三萜含量穩(wěn)定提高29.4%[12]。董玉瑋等[18]對比氯化鋰、甲基磺酸乙酯、亞硝酸對靈芝原生質體誘變篩選胞外多糖產量,發(fā)現(xiàn)氯化鋰最佳誘變劑量為0.03%,此時誘變株L31胞外多糖產量最高為19.99mg/mL,較原發(fā)菌株提高914.72%。EMS最佳誘變劑量為0.12%,此時誘變株E40胞外多糖產量最高為6.14mg/mL,較原發(fā)茵株提高211.68%。亞硝酸鈉(0.25mL 1mo/l pH4.5的醋酸緩沖液,加入0.06mol/L的亞硝酸鈉0.25mL)最佳誘變時間為15min,此時誘變株H48胞外多糖產量最高為10.13mg/mL,較原發(fā)菌株提高414.21%。3種誘變方式下,誘變株L31的胞外多糖產量最高,且遺傳性狀最穩(wěn)定,第三、五、七、九代胞外多糖產量較原發(fā)菌株分別提高了738.58%、671.07%、683.25%、673.10%。QuanYL等[19]用濃度為0.1mol/L的亞硝酸鈉對靈芝菌絲體進行誘變處理5min。得到了比原始菌絲生長能力更強的菌株。

2.3 太空誘變(航天)

靈芝太空誘變育種是將小試優(yōu)選的出發(fā)菌株以木屑為基質發(fā)好菌絲填裝入玻璃瓶,搭載返回式衛(wèi)星或飛船進入太空,利用太空中微重力、太空輻射、弱地磁效用等綜合因素復合效應影響,返回后經復壯培養(yǎng),分離純化,品比及穩(wěn)定性試驗獲得優(yōu)異菌株的方法。誘變菌株在產量、品質、抗性等方面綜合表現(xiàn)優(yōu)異。王振福等[20-21]觀測搭載“961020”返地式衛(wèi)星誘變的新菌株衛(wèi)星靈芝2號,該菌株比對照菌株子實體產量提高75.3%,優(yōu)級品率達到88.9%,發(fā)酵收率平均達到2.57%,纖維素酶活力提高33%,抑瘤作用差異顯著,16種氨基酸含量均有顯著提高。祁建軍等[22-23]發(fā)現(xiàn)搭載我國“神舟1號”宇宙飛船誘變的靈芝Sh菌株,孢子粉多糖含量比對照增加79.7%。Sx菌株孢子粉腺苷含量比對照增加42%。張蕾等[24]以“仙芝1號”為出發(fā)菌株,搭載我國第二十一顆返回式衛(wèi)星進行航天誘變,經高溫栽培篩選出一株耐高溫35℃以上,具有抗逆性強、孢子產量高、飽滿度高等優(yōu)良特性菌株“仙芝2號”[25]。

2.4 離子束注入誘變

靈芝離子束注入誘變采用低能N+離子注入和物理等離子體方式,其中物理等離子體包括介質阻擋放電低溫等離子體(DBD-LTP)和常壓室溫等離子(ARTP),工作氣體為氦。N+離子注入根據正突變率和存活率綜合考慮注入劑量,根據選用材料的不同,選擇注入能量15-20KeV之間,注入劑量1015～1016ions·cm-2之間。ARTP通氦氣量在10slm左右,根據誘變時間選擇致死率在90%左右時為最佳誘變條件。趙世光等[26]確定了低能 N+ 離子注入菌絲體,在注入能量 20KeV,注入劑量2.6×1015～3.9×1015ions·cm-2范圍內可獲得高比例正突變株。李穎穎等[27]確定了新鮮靈芝孢子進行低能 N+ 離子注入的適宜參數(shù)：注入劑量 1.25×1016ions·cm-2,注入能量 20KeV,靶室真空度10-3Pa,以 5s脈沖式注入,間隔為 15s,正突變率最高,出現(xiàn)孢子存活率峰值13.33%,選到了一株靈芝高產菌株GL1026,其靈芝子實體產量、多糖含量、三萜含量分別較對照菌株提高了15.94%、9.68%、17.60%。韋達等[28]運用介質阻擋放電低溫等離子體在最優(yōu)放電條件通入氦氣,氣流量為2L/min、電壓15.6kV、電流1.8mA、放電頻率1.8kHz、處理2.5min對靈芝原生質體進行誘變,篩選出菌絲體中納米硒含量與出發(fā)菌株相比提高了約30%的突變菌株H10。余雯雯[29]采用ARTP對靈芝菌株(滬農1號)菌絲體進行誘變處理,氦氣流量為10slm/s,誘變50s,致死率93%,獲得菌絲產量及靈芝酸產量顯著提高的ATP3菌株。李塬等[30]利用ARTP對其原生質體進行誘變處理,通氣量9.8slm,處理12.88s,致死率90%,獲得遺傳穩(wěn)定性良好,多糖產量提高268.57%的誘變菌株A-246。

2.5 復合誘變

靈芝復合誘變是指采用不同誘變組合,產生協(xié)同效應,以期提高發(fā)生基因突變頻率,獲得更多的優(yōu)良變異類型。研究發(fā)現(xiàn)復合誘變在胞外多糖、三萜產量提高方面與單一化誘變相比不具優(yōu)勢,但在誘變高產漆酶菌株中應用較多。王淑珍等[31-32]將靈芝CL988菌株孢子懸浮液經60CO-γ射線與紫外線交替累積誘變,獲得菌絲高長速靈芝菌株CjL990,通過過氧化物酶和酯酶同工酶的電泳分析結果表明靈芝CL988菌株和靈芝CJL990菌株在酶帶條數(shù)RF值尚有差異,說明誘變靈芝菌株遺傳基因有所改變。董玉瑋等[33]分別采用紫外線+甲基磺酸乙酯、紫外線+氯化鋰復合誘變靈芝原生質體,對高產胞外多糖的菌株進行了篩選。最佳誘變條件下,紫外線+氯化鋰復合誘變所獲得的胞外多糖產量較原始菌株提高57.87%,紫外線+甲基磺酸乙酯復合誘變提高49.75%。單一化學試劑誘變胞外多糖產量,0.03%氯化鋰誘變株L31較原發(fā)菌株提高914.72%,0.12%EMS誘變株E40較原發(fā)茵株提高211.68%[18]。20W紫外燈,距離40cm,照射原生質體60s,誘變株Hs-26菌體多糖產量相對提高79.16%[13]。PengR等[36]用氯化鋰和TritonX-100處理靈芝原生質體,三萜類化合物的含量比原菌株增加373.43%。0.3%氯化鋰誘變菌株胞內、胞外三萜類產量達到最高,比原菌株分別提高了461.72%和136.57%[17]。趙世光等[26]采用多輪低能 N+ 離子注入靈芝菌絲體,獲得了遺傳性穩(wěn)定的漆酶高產突變株 UIM-281,2次產漆酶活力峰值分別是出發(fā)菌株的1.7倍及 2.28倍,且產酶發(fā)酵周期相對縮短 24h。易小暢等[34]通過紫外線-亞硝基胍逐級誘變處理藥用真菌紅芝菌絲體片段,獲得1株漆酶高產誘變菌株LYL263,其平均酶活力比出發(fā)菌株提高187%。劉曉丹等[35]利用紫外線-硫酸二乙酯逐級誘變樹舌靈芝菌絲片段;獲得漆酶活性提高63.3%高產突變株。

3 原生質體融合

靈芝原生質體融合育種技術包括種間自發(fā)融合和異種間誘導融合兩種,將單一性狀表現(xiàn)優(yōu)異又互補的菌株進行遺傳重組借以獲得兼有雙親優(yōu)異遺傳性狀的新材料。目前靈芝原生質體融合技術中應用最廣是電融合和化學融合,聚乙二醇(PEG)是最常用的化學融合劑,添加鈣離子有明顯的促進作用。高陳合等[37]通過化學方法和電融合法對白芝和赤芝原生質體融合條件進行了研究,顯示PEG濃度30%、CaCl20.02mol/L、融合時間30min、溫度 30℃,融合率可達0.4%。交變電流頻率 2MHz、電壓 40V、直流脈沖脈幅10kV/cm、脈寬 25lUS、直流電壓為500V,融合率可達40%。高明俠等[38]過電融合方法對生長速度快、產量高、多糖含量低的紫芝和多糖含量高、生長速度慢、產量低的赤芝進行原生質體融合。最佳條件直流脈沖強度10kv,脈沖間隙24 Us,脈沖次數(shù)3次/s時融合率為0.038%,獲得了生物量和多糖產量均高于兩親本的菌株。王淑珍等[39]以獲得弱木栓質化靈芝菌株為目的,在 PEG-Ca2+系統(tǒng)中誘導靈芝和糙皮側耳原生質體融合,篩選到木栓質化程度大于糙皮側耳,小于靈芝的融合菌株。全衛(wèi)豐等[40]在 PEG-Ca2+系統(tǒng)中誘導高產菌株美大靈芝和富曬能力較強的菌株惠州靈芝原生質體融合,到了一株靈芝高產融合菌株RG1108,其靈芝子實體生物轉化率、子實體和孢子粉中的硒含量分別較對照提高了18.48%、21.78%、16.19%。

4 雜交育種

靈芝雜交育種以原生質體單核化技術為基礎,研究發(fā)現(xiàn)兩種交配型單核菌株獲得比例不同,不符合1∶1 的理論,有的親本只找到1種交配型。雜交菌株存在顯著的雜交優(yōu)勢,親本不同對雜交子生物性狀影響很大,親本交配型對靈芝菌絲生長速度方面有一定的影響,但對靈芝液體發(fā)酵相關性狀均無影響。對雜交菌株多糖含量和產量及遺傳距離相關性分析表明,雜交菌株的優(yōu)良性狀與親本的遺傳距離沒有正相關性。叢倩倩等[41]發(fā)現(xiàn)“泰山赤靈芝1號”,獲得了兩種交配型單核菌株,兩種交配型分離比例為16∶5,“靈芝4895”和“野生靈芝2”均只獲得了一種交配型單核菌株,三個靈芝菌株兩種單核體的分離比例均不符合1∶1 的理論值。吳小平等[42]對5個親本進行原生質體單核化,獲得了7種不同交配型的單核菌株,有的親本只找到1種交配型。林俊華等[43]以“廣東赤芝”和“靈芝5.75”為親本的3個雜交菌株研究發(fā)現(xiàn),“雜交 1號”分別比親本提早 22和3d出菇,產量比“廣東赤芝”高 178.5%,比“靈芝 5.75”高 34.9%?！半s交 2號”的菌絲生長速度明顯快于 2個親本菌株,子實體三萜含量比“廣東赤芝”高 198%,比“靈芝5.75”高121.2%。王天嬌等[44]發(fā)現(xiàn)雜交菌株對底物的利用和三萜產物的合成與親本菌體比較有較大的提高。劉方[45]發(fā)現(xiàn)雜交菌株的優(yōu)良性狀與親本的遺傳距離沒有正相關性,雜交菌株30+2-7×24-7在多糖和產量方面存在顯著的雜交優(yōu)勢。李睿等[46]應用RAPD,SRAP兩種標記技術分析了24個靈芝菌株(4個親本,10個雜交子,10個非親本)的遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)4個親本的遺傳關系相對較遠。相同親本產生的雜交子與親本的遺傳距離是不同的。有一個相同親本的不同組合產生的雜交子遺傳距離可能較近,且都接近于相同親本。雜交子表現(xiàn)出一定的雜種優(yōu)勢。在菌絲生長速度方面,9個雜交子表現(xiàn)超雙親。在液體發(fā)酵菌絲生物量方面,12個雜交子表現(xiàn)超雙親。在三萜含量方面,有2個雜交子表現(xiàn)超雙親。在粗多糖含量方面,2個雜交子表現(xiàn)超雙親。未篩選到四項指標都較高的雜交子。親本不同對雜交子生物性狀影響很大,親本交配型對靈芝菌絲生長速度方面有一定的影響,但對靈芝液體發(fā)酵相關性狀均無影響。相同親本產生的雜交子三萜含量方面差異也很顯著,且與親本有一定的關系。這與遺傳多樣性分析結果相對應。

5 基因工程

靈芝常規(guī)基因轉化方法有電擊轉化法,農桿菌轉化法,PEG轉化法,突破了親和因子的限制,獲得了目的基因在靈芝中的過表達,使育種更具有目的性。

朱文靜等[47]以人參大片段DNA通過電擊轉化法轉入靈芝原生質體中,發(fā)現(xiàn)菌絲體整齊且生長速度更快,靈芝酸含量增高的轉化子。孫墨可等[48]通過PEG轉化法,將啟動子 GPD、終止子 NOS和目的基因免疫調節(jié)蛋白基因 LZ-8、潮霉素標記基因HygB構建的雙 T-DNA表達載體 pSB13ONG—Lz8導入靈芝原生質體,獲得了免疫調節(jié)蛋白基因LZ-8在靈芝中的過表達。李瑞勤等[49]利用農桿菌介導法將同源性基因pgm轉化靈芝原生質體,發(fā)現(xiàn)在PGM過表達的重組型靈芝菌株中胞內多糖含量和胞外多糖量最高分別為21.02mg/100mg菌體和0.71g/L,分別比野生型菌株高9.1%和 39.2%。靈芝多糖生物合成途徑中pgm、pgi基因轉錄水平表達量較野生型靈芝菌株處于上調狀態(tài),且多糖合成代謝中相關酶活性有顯著提高。

6 展望

靈芝做為從古至今的養(yǎng)生佳品,2019年11月國家衛(wèi)生健康委員會和國家市場監(jiān)督管理總局頒布了將靈芝等9種物質按照既是食品又是中藥材的物質管理,可以預見未來市場對于靈芝產品的需求也將會更加旺盛。人工栽培的靈芝作為野生靈芝的替代品,優(yōu)良菌種是高產、優(yōu)質的前提。綜觀靈芝各種育種方法,筆者認為每種育種技術都有突出的優(yōu)勢和特點,可根據選育目的和實驗室條件進行選擇。育種工作中會產生了大量待篩選菌株,篩選工作耗資、耗時,后期研究可圍繞建立高通量的篩選方法,科學的育種手段配合高效的篩選技術,獲得更多靈芝優(yōu)質品種材料,促進靈芝產業(yè)進一步壯大,滿足消費者日益增長的需求。