王士龍,朱景煥,孫曉波,賓彩艷

(廣西科技師范學(xué)院,廣西來賓 546199)

甘蔗(Saccharumofficinarum),甘蔗屬,多年生高大實心草本,屬C4作物,為喜溫、喜光作物,廣泛分布于熱帶及亞熱帶地區(qū)。土壤是甘蔗生產(chǎn)的基礎(chǔ),根系土壤中存在的物質(zhì)與甘蔗產(chǎn)量和質(zhì)量的形成密切相關(guān)。由于耕地面積有限,甘蔗種植單一連作現(xiàn)象比較普遍,連作障礙是常見問題,根際土壤中化感物質(zhì)積累是引起連作障礙的主要原因之一[1]。張愛加等[2]研究表明,甘蔗幼苗期宿根根際土壤甲醇浸提液中與化感作用相關(guān)的物質(zhì)主要有5大類54個,這些物質(zhì)的積累抑制了宿根甘蔗的生長,同時也破壞了根際微生態(tài),使得病原菌富集、土壤營養(yǎng)元素循環(huán)受阻,從而影響了甘蔗的產(chǎn)量和質(zhì)量。李賢宇[3]研究也表明,宿根甘蔗根際土壤中積累的化感物質(zhì)較多。

化感物質(zhì)是植物分泌的次生代謝產(chǎn)物或植物凋落物的分解產(chǎn)物[4]。植物釋放化感物質(zhì)的途徑大體上分為雨霧淋溶、自然揮發(fā)、殘體分解和根系分泌4種,Rice等[5-11]將化感物質(zhì)分為14種,有酚類、萜類、黃酮類、有機(jī)酸、脂族醛和酮等。化感物質(zhì)具有選擇性和專一性、復(fù)合效應(yīng)和構(gòu)效關(guān)系,其中的構(gòu)效關(guān)系是指化感物質(zhì)的性能很大程度上取決于化感物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu),進(jìn)而決定其化感作用的性質(zhì)和強(qiáng)度[12]。錢敏[13]利用化感物質(zhì)的生物活性,合成了兩大類共64個結(jié)構(gòu)新穎的芳氧乙酰氧基異黃酮衍生物和芳氧乙酰氧基查爾酮衍生物,這兩大類目標(biāo)化感物質(zhì)均表現(xiàn)出較高的除草活性。另外,化感物質(zhì)也可開發(fā)成殺蟲劑[14]?；形镔|(zhì)鑒定需要先對樣品進(jìn)行預(yù)處理,因此需要對甘蔗根系土壤中化感物質(zhì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

有研究表明,植物地上部和土壤中的化感物質(zhì)可以用溶劑提取法提取[15]。常用的有機(jī)浸提溶劑有甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、石油醚、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等[15-21]。劉賢文等[1]研究馬鈴薯、玉米土壤中化感物質(zhì)時采用甲醇溶劑輔助超聲波處理,陳冬梅等[22]對連作煙草根際土壤化感物質(zhì)提取和鑒定采用甲醇溶劑浸提,宋宇加[23]對人參根際土壤中化感物質(zhì)的分離和鑒定采用甲醇提取。該試驗采用甲醇試劑浸提并輔助超聲波預(yù)處理方法,以質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索出的化感物質(zhì)種類數(shù)量為評價指標(biāo),并通過單因素和正交試驗對預(yù)處理工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1儀器。電子天平(上海越平科學(xué)儀器公司,FA2004);鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司,GZX-GF101-3BS);箱式電阻爐(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司,SX2-5-12);數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司,KQ-300DB);臺式高速離心機(jī)(湖南湘儀公司,H1850);漩渦混合器(上海醫(yī)大儀器公司,XW-80A);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠,RE-52AA);氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent,7890B/5977A GCMSD)。

1.1.2試劑。甲醇(色譜純);MgSO4(分析純),在使用MgSO4前用馬弗爐以500 ℃烘6 h,180 ℃取出,置于干燥器內(nèi)冷卻備用。

1.2 GC-MS條件

1.2.1氣相色譜條件。色譜柱為HP-5MS UI(30 m×0.25 mm,0.25 μm);進(jìn)口溫度220 ℃,載氣為氦(He),流量1 mL/min,進(jìn)樣量1 μL。氣相色譜程序升溫條件如表1所示,總運行時間41.33 min。

表1 氣相色譜程序升溫條件

1.2.2質(zhì)譜條件。電離方式為EI;電子能量70 eV;阱溫200 ℃,阱外套溫度50 ℃,傳輸線溫度280 ℃;掃描范圍50～1 000 amu。應(yīng)用計算機(jī)檢索系統(tǒng)NIST MS將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行匹配確定化感物質(zhì)。

1.3 試驗方法

1.3.1預(yù)處理方法。稱取烘干的甘蔗根系土壤4.00 g(精確至0.01 g),置于50 mL具塞離心管中,加入甲醇(色譜純)進(jìn)行超聲波處理,超聲波處理后取上清液于圓底燒瓶中,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行蒸發(fā)濃縮,濃縮后用甲醇溶解并定容至10 mL具塞刻度試管中,將定容后的樣液倒入50 mL具塞離心管中并加入0.5 g無水硫酸鎂,混合2 min,再置于離心機(jī)進(jìn)行離心,4 000 r/min條件下離心5 min,取上清液過0.22 μm有機(jī)針式濾膜后轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中,等待上機(jī)測定。

1.3.2單因素試驗。

1.3.2.1料液比對檢出化感物質(zhì)種類數(shù)量的影響。分別加入16、20、24、28、32 mL甲醇溶劑進(jìn)行超聲波處理,即料液比為1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8(g∶mL),超聲時間為60 min,超聲功率為210 W,檢測化感物質(zhì)種類數(shù)量,找出最佳料液比。

1.3.2.2超聲波功率對檢出化感物質(zhì)種類數(shù)量的影響。采用試驗中確定的最佳料液比,在超聲波處理時選擇150、180、210、240、270 W不同超聲波功率處理樣品,檢測化感物質(zhì)種類數(shù)量,找出最佳超聲波功率。

1.3.2.3超聲波時間對檢出化感物質(zhì)種類數(shù)量的影響。采用試驗中確定的最佳料液比和最佳超聲波功率,在超聲波處理時選擇20、40、60、80、100 min不同超聲波時間處理樣品,檢測化感物質(zhì)種類數(shù)量,找出最佳超聲波時間。

1.3.3正交試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果,各取3個水平,以檢測出的化感物質(zhì)種類數(shù)量為指標(biāo),采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗設(shè)計,正交試驗因素水平如表2所示。

表2 正交試驗因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1料液比對檢出化感物質(zhì)種類數(shù)量的影響。如圖1所示,經(jīng)GC-MS測試,1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8不同料液比處理后樣品所檢測出的化感物質(zhì)種類數(shù)量分別為12、14、13、12、11個。其中2,5-二叔丁基酚是5個處理中都檢測出的化感物質(zhì),5個料液比中1∶5 處理時檢測出的化感物質(zhì)種類最多。當(dāng)料液比低于1∶5 時檢測出的化感物質(zhì)逐漸減少,原因是甲醇量增大會使化學(xué)物質(zhì)溶出增加,有些化學(xué)成分相互間發(fā)生反應(yīng)生成其他物質(zhì),導(dǎo)致檢測出的化感物質(zhì)數(shù)量減少。因此,選擇1∶5為最佳料液比。

圖1 料液比對檢測出的化感物質(zhì)種類數(shù)量的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the quantity of allelochemicals detected

2.1.2超聲波功率對檢出化感物質(zhì)種類數(shù)量的影響。如圖2所示,經(jīng)GC-MS測試,150、180、210、240、270 W不同超聲波功率處理后樣品所檢測出的化感物質(zhì)種類數(shù)量分別為11、13、15、12、11個。其中棕櫚酸甲酯是經(jīng)5個不同超聲波功率處理后都檢測出的化感物質(zhì)。超聲波功率為210 W處理時檢測出的化感物質(zhì)種類數(shù)量最多,當(dāng)超聲波功率高于210 W時檢測出的化感物質(zhì)逐漸減少,原因可能是超聲波功率過高產(chǎn)生的空化效應(yīng)過大,導(dǎo)致部分化學(xué)物質(zhì)降解。因此,選擇210 W為最佳超聲波功率。

圖2 超聲波功率對檢測出的化感物質(zhì)種類數(shù)量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on the quantity of allelochemicals detected

2.1.3超聲波時間對檢出化感物質(zhì)種類數(shù)量的影響。如圖3所示,經(jīng)GC-MS測試,20、40、60、80、100 min不同超聲波時間處理后樣品所檢測出的化感物質(zhì)種類數(shù)量分別為11、13、14、16、16個。其中十一烷、2,5-二叔丁基酚、棕櫚酸甲酯是5個不同超聲波時間處理后都檢測出的化感物質(zhì),超聲波時間為80和100 min處理時檢測出的化感物質(zhì)種類數(shù)量最多。隨著超聲波時間的延長檢測出的化感物質(zhì)種類數(shù)量增加,可能是因為超聲波時間延長會是使化學(xué)物質(zhì)溶出更充分。因此,選擇80 min為最佳超聲波時間。

圖3 超聲波時間對檢測出的化感物質(zhì)種類數(shù)量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the quantity of allelochemicals detected

2.2 正交優(yōu)化試驗由表3可知,3個因素對甘蔗根系土壤中化感物質(zhì)種類數(shù)量的影響由大到小依次為B>C>A,即超聲波功率>超聲波時間>料液比,各因素水平的最優(yōu)組合為A2B2C3,該組合與正交試驗5相同,即最優(yōu)預(yù)處理條件是料液比1∶5、超聲波功率210 W、超聲波時間100 min。最優(yōu)預(yù)處理條件檢測出的化感物質(zhì)如表4所示,共檢測出化感物質(zhì)種類為17個。

表3 正交試驗結(jié)果

表4 最優(yōu)預(yù)處理條件檢測出的化感物質(zhì)

1,3,5,6,7-pentamethylbicyclo[3.2.0]hepta-2,6-diene、2,5-二叔丁基酚、棕櫚酸甲酯3種物質(zhì)是9個正交試驗設(shè)計中檢測出的共有化感物質(zhì)。棕櫚酸甲酯可作為一種有開發(fā)潛力的植物殺螨劑[24],也可制備具有農(nóng)藥增效功能的助劑組合物;棕櫚酸可以作為合成番茄紅素的碳源,也可抑制病原真菌和線蟲的繁殖,有效改善土壤環(huán)境[25]。

3 結(jié)論與討論

為浸提出甘蔗根系土壤中的化感物質(zhì),采用甲醇浸提并輔助超聲波預(yù)處理方法,通過單因素和正交試驗對預(yù)處理工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,預(yù)處理的最優(yōu)條件為料液比1∶5(g∶mL)、超聲波功率210 W、超聲波時間100 min,檢測出來的化感物質(zhì)有17個。從最優(yōu)的預(yù)處理工藝檢測出的化感物質(zhì)種類數(shù)量還比較少,原因可能是在自然條件下,土壤中的非生物和生物等因素會發(fā)生遷移、化學(xué)轉(zhuǎn)化和生物降解,可形成聚合物或降解成小分子物質(zhì),會對檢測出的化感物質(zhì)種類數(shù)量產(chǎn)生影響[26]。因此采集根際土壤樣品應(yīng)按照技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)操作,并及時對樣品進(jìn)行預(yù)處理和上機(jī)檢測。