閆帥帥，晉程妮，武穎，徐建國，張亮亮

（山西師范大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030031）

枸杞作為一種藥食同源類物質(zhì)，被《中華人民共和國藥典》2020版收錄，具有較高的藥用價值和營養(yǎng)保健功效[1-3]?！侗静菥V目》中曾記載，枸杞葉又名天精草，是指枸杞嫩莖部位在春天長出的新鮮芽葉[4]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，枸杞葉具有與枸杞相近的化學(xué)組成，不僅含有大量的蛋白質(zhì)、膳食纖維、多種氨基酸等營養(yǎng)成分，還包括黃酮、多酚、多糖和萜類等多種生物活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、降血糖、改善精神疾病等生理功效[5-8]。因此，枸杞葉的潛在醫(yī)食利用價值和開發(fā)應(yīng)用前景值得關(guān)注。

枸杞葉作為枸杞栽培過程中主要的副產(chǎn)物，除被少量的用于茶飲和新鮮食用外，每年造成近百萬噸的廢棄，提升對枸杞葉副產(chǎn)品的精深加工至關(guān)重要[9]。廣泛存在于植物原料中的多酚類物質(zhì)作為開發(fā)功能性產(chǎn)品的熱點之一，在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域得到應(yīng)用[10-11]。閆亞美等[12]研究表明，不同品種枸杞葉中黃酮、多酚、氨基酸含量差異較大，且多酚類物質(zhì)含量最高。并且植物多酚提取物的生物活性、提取效率與提取方法密切相關(guān)，常用的提取方法有溶劑萃取法、超臨界流體萃取法、超聲波輔助浸提法、微波輔助提取法、酶工程技術(shù)等。研究表明，多技術(shù)協(xié)同提取法在多酚提取效率、純度等方面均優(yōu)于單一提取技術(shù)[13-14]。何若男等[15]運用響應(yīng)面法優(yōu)化了微波-超聲波協(xié)同技術(shù)提取黑枸杞葉多酚的試驗參數(shù)，提高了枸杞葉中多酚的提取效率。具有綠色、高效、操作簡單等特點的超聲輔助酶法作為一種新興的提取技術(shù)，廣泛應(yīng)用于植物材料中多酚的獲取[16-17]，但鮮有采用超聲輔助酶法提取枸杞葉多酚的報道。

本試驗以枸杞葉為原料，通過超聲波輔助酶法優(yōu)化枸杞葉多酚的提取工藝，并對枸杞葉多酚清除自由基能力進(jìn)行探究，旨在為開發(fā)枸杞葉精深加工利用，豐富副產(chǎn)品種類提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與試劑

供試枸杞葉為市售，產(chǎn)于寧夏。

沒食子酸、福林酚、無水碳酸鈉、纖維素酶，上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)；DPPH、ABTS（純度＞99%），美國Sigma公司生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

真空冷凍干燥機(jī)（LGJ-30F型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；紫外可見分光光度計（LN-1800PC型，上海美譜達(dá)儀器有限公司）；超聲波清洗機(jī)（CQ-250A-DST型，上海恒悅醫(yī)療器械有限公司）；粉碎機(jī)（SS-1022型，永康市紅太陽機(jī)電有限公司）；低速臺式離心機(jī)（TDL-60C型，上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 枸杞葉多酚提取 在真空冷凍干燥機(jī)中將枸杞葉進(jìn)行干燥，粉碎過篩后樣品粉末保存于4 ℃冰箱。

取0.10 g粉末樣品，設(shè)置超聲波清洗機(jī)的工作條件（溫度60 ℃、功率100 W），加入已知量的纖維素酶、乙醇溶液，提取適當(dāng)時間，懸浮液離心（3 000 r/min、10 min）后，收集上清液并定容至100 mL，得到枸杞葉多酚提取液[18]。

1.3.2 多酚含量測定 采用福林酚比色法[19]測定枸杞葉多酚的含量。配制0.10 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于6個試管中，向各管中加入0.1 mL福林酚試劑和2.8 mL蒸餾水，混勻后再加入7.5%碳酸鈉溶液2.0 mL，避光靜置1 h，于765 nm波長處測定吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為：y=76.917x+0.016（R2=0.998 3），其中，y表示吸光度；x表示沒食子酸質(zhì)量濃度（mg/mL）。吸取枸杞葉多酚提取液0.1 mL，按照沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方法步驟操作，根據(jù)公式（1）計算多酚含量。

式中，W表示多酚含量（mg/g）；c表示提取液中多酚的質(zhì)量濃度（mg/mL）；V表示多酚提取液的體積（mL）；n表示稀釋倍數(shù)；m表示干燥粉末樣品的質(zhì)量（g）。

1.3.3 單因素試驗 分別稱取枸杞葉粉末0.10 g，設(shè)置料液比1∶50（g/mL），超聲時間50 min，纖維素酶添加量2 mg/g，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為10%、30%、50%、70%、90%時對多酚得率的影響；設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲時間50 min，纖維素酶添加量2 mg/g，考察料液比分別為1∶10、1∶30、1∶50、1∶70、1∶90（g/mL）時對多酚得率的影響；設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶70（g/mL），纖維素酶添加量2 mg/g，考察超聲時間分別為10、20、30、40、50 min時對多酚得率的影響；設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1∶70（g/mL），超聲時間40 min，考察纖維素酶添加量分別為0、1、2、3、4 mg/g時對多酚得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)曲面設(shè)計 基于1.3.3單因素試驗，遵循Box-Behnken效應(yīng)面法，對4個因素（表1）進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面分析，以多酚得率作為響應(yīng)值，探究枸杞葉多酚的最佳提取工藝條件[20-21]。響應(yīng)面試驗因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Tab.1 Response surface test factor and levels

1.3.5 抗氧化指標(biāo)測定

1.3.5.1 檢測清除DPPH自由基能力 用無水乙醇配制60 μmol/L DPPH工作液，測定時在517 nm波長下，調(diào)節(jié)其吸光度為0.70±0.02。將枸杞葉多酚提取液稀釋成不同濃度，分別取0.5 mL提取液置于4 mL比色皿中，加入2.5 mL DPPH溶液，充分反應(yīng)后，于517 nm處測定吸光度，并用Vc作為陽性對照[22]。根據(jù)公式（2）計算DPPH自由基清除率。

式中，A0為空白樣品吸光值；A1為提取液溶液的吸光值；A2為樣品溶液陰性對照吸光值。

1.3.5.2 檢測清除ABTS自由基能力 配制7 mmol/L的ABTS溶液和4.9 mmol/L的過硫酸鉀溶液，等體積混勻后4 ℃避光放置12 h，得到ABTS母液。在734 nm波長下，用無水乙醇稀釋母液吸光值至0.70±0.02，得到ABTS測定溶液。在3.8 mL ABTS測定溶液中，加入0.1 mL不同濃度的枸杞葉多酚提取液，于734 nm處測定吸光度[23]，根據(jù)公式（3）計算ABTS自由基清除率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

處理數(shù)據(jù)、繪圖、響應(yīng)面分析由Origin 8.6、Design-Expert V 8.0.6軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對枸杞葉多酚得率的影響 由圖1可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在10%～70%時，多酚得率呈上升趨勢，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時多酚得率最高，隨后逐步下降。這可能是遵循與溶液極性相似相溶性原則，70%乙醇溶液和提取的多酚相溶[24]，表明在溶劑中適當(dāng)加水以增加萃取溶劑的極性是必要的，有利于多酚的提取。綜合考慮，響應(yīng)面優(yōu)化試驗的乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇50%、70%、90%。

圖1 4個單因素對枸杞葉多酚得率的影響Fig.1 Effect of four single factors on the yield of polyphenols from Lycium barbarum leaves

2.1.2 料液比對枸杞葉多酚得率的影響 由圖1可知，當(dāng)料液比在1∶10（g/mL）～1∶70（g/mL）時，多酚得率隨著料液比的增加而增加，在料液比為1∶70（g/mL）時達(dá)到最大值，這可能是由于溶劑用量的增加使得其與枸杞葉粉末的接觸面積加大，從而促進(jìn)了多酚的提取[25]；當(dāng)料液比大于1∶70（g/mL）時，多酚得率開始降低，這可能是因為溶劑用量過大，超聲波與枸杞葉粉末之間的作用降低，不利于多酚物質(zhì)溶出。因此，響應(yīng)面優(yōu)化試驗的料液比選擇1∶50、1∶70、1∶90（g/mL）。

2.1.3 超聲時間對枸杞葉多酚得率的影響 圖1顯示，超聲時間小于40 min時，多酚得率與超聲處理時間呈正相關(guān)，說明超聲時間的增加可促進(jìn)枸杞葉中生物活性化合物多酚的完全溶出[26]。在超聲時間為40 min時，多酚得率達(dá)到最大值，之后開始降低。這可能是因為細(xì)胞內(nèi)外濃度達(dá)到平衡，待溶出的物質(zhì)較少，提取效率降低。因此，響應(yīng)面試驗的超聲時間選擇30、40、50 min。

2.1.4 纖維素酶添加量對枸杞葉多酚得率的影響 圖1顯示，纖維素酶添加量小于2 mg/g時，多酚得率趨勢相對陡峭，這可能是由于酶水解有助于溶劑滲透，通過增加基質(zhì)孔隙率，使酚類化合物溶出[27]。當(dāng)酶添加量為2～3 mg/g時，多酚得率增長趨于平緩，可能是由于酶量的增加加快了酶解速度，提高了部分多酚溶出量。當(dāng)酶添加量高于3 mg/g時，多酚得率出現(xiàn)下降趨勢，可能與分解的纖維素造成多酚逸出孔隙堵塞有關(guān)[28]。因此，響應(yīng)面試驗的纖維素酶添加量選擇1、2、3 mg/g。

2.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 基于回歸擬合分析（表2），得出4個因素與枸杞葉多酚得率之間的二次回歸擬合方程：Y=5.16－0.19A+0.087B+0.047C+0.12D+0.082AB+0.059AC－0.028AD－0.20BC－0.097BD+0.005 25CD－0.68A2－0.052B2－0.63C2－0.54D2，二次項系數(shù)均小于0，回歸擬合曲線開口向下，多酚得率有最大值。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.2 Response surface test design and results

由表3可知，該回歸模型具有極顯著性（P＜0.01），試驗方法可行；失擬誤差不顯著（P＞0.05），表明試驗值與擬合方程計算值沒有顯著差異；R2=0.882 6，表明該模型擬合度良好。模型中A2、C2和D2對枸杞葉多酚得率的影響極顯著，A對枸杞葉多酚得率的影響顯著?；贔值的大小判斷4個因素對枸杞葉多酚得率的影響從高到低排序為：乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）＞纖維素酶添加量（D）＞料液比（B）＞超聲時間（C）。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析Tab.3 Analysis of variance of response surface regression model

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 圖2～7結(jié)果顯示，任意2個變量交互作用下，枸杞葉多酚得率呈拋物線形變化趨勢（先上升后逐漸下降）。料液比和超聲時間對枸杞葉多酚得率的影響曲線更陡，等高線和坐標(biāo)軸之間形成一定的角度，等高線清晰、緊密集中、排列平均一致，表明二者對多酚得率的協(xié)同交互作用相對較大。當(dāng)超聲時間為40 min時，料液比從1∶50（g/mL）增加到1∶70（g/mL），多酚得率從4.3 mg/g提高至5.0 mg/g；在恒定料液比為1∶70（g/mL）時，超聲時間從30 min增加到40 min，多酚得率從4.5 mg/g提高至5.0 mg/g。因而，料液比大于超聲時間對響應(yīng)值的影響，這與表3的結(jié)果一致。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比對枸杞葉多酚得率的響應(yīng)面和等高線Fig.2 Response surface and contour plots of the effects of ethanol volume fraction and solid-liquid ratio on the yield of polyphenols from Lycium barbarum leaves

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲時間對枸杞葉多酚得率的響應(yīng)面和等高線Fig.3 Response surface and contour plots of the effects of ethanol volume fraction and ultrasonic time on the yield of polyphenols from Lycium barbarum leaves

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)和纖維素酶添加量對枸杞葉多酚得率的響應(yīng)面和等高線Fig.4 Response surface and contour plots of the effects of ethanol volume fraction and amount of cellulase on the yield of polyphenols from Lycium barbarum leaves

圖5 料液比和超聲時間對枸杞葉多酚得率的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots of the effects of solid-liquid ratio and ultrasonic time on the yield of polyphenols from Lycium barbarum leaves

2.2.3 模型驗證 響應(yīng)面模型優(yōu)化的最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)68.33%、料液比1∶89.38（g/mL）、超聲時間38.83 min、纖維素酶添加量2.02 mg/g。為了便于實際應(yīng)用，將最佳工藝條件調(diào)整為：乙醇體積分?jǐn)?shù)68%、料液比1∶89（g/mL）、超聲時間39 min、酶添加量2 mg/g，在此條件下多酚得率為5.09 mg/g，與模型預(yù)測值（5.21 mg/g）的相對誤差為2.3%，表明模型有效，優(yōu)化工藝穩(wěn)定可行。

2.3 枸杞葉多酚提取物抗氧化活性分析

由圖8可知，枸杞葉多酚提取物和Vc對DPPH自由基的清除率均隨各溶液多酚和Vc質(zhì)量濃度的增加而升高。枸杞葉多酚提取物和Vc對DPPH自由基清除率IC50值分別為27.28、13.06 μg/mL，雖然枸杞葉多酚提取物對DPPH自由基清除能力略低于陽性對照Vc，與前人對紅枸杞葉總多酚提取物對DPPH自由基清除能力相當(dāng)[14]。而且，隨著提取物中多酚質(zhì)量濃度的升高，枸杞葉多酚提取物和Vc對ABTS自由基的清除能力呈上升趨勢（圖8），IC50值分別為190、150 μg/mL，二者對ABTS自由基清除能力相近，表明枸杞葉多酚提取物有一定的抗氧化能力。

3 結(jié)論與討論

從食用副產(chǎn)品中獲得具有生物活性的酚類化合物并開發(fā)成新的可利用產(chǎn)品，是新時代落實大食物觀的內(nèi)在要求。高溫水提取酚類化合物的傳統(tǒng)方法，由于作用時間長、溫度高，造成酚類化合物的大量損失。酶輔助提取法可以對植物細(xì)胞壁中的多糖進(jìn)行水解，打破原有的多糖-木質(zhì)素網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)多酚類化合物的釋放。但在單一的酶輔助提取法過程中，長時間的處理造成經(jīng)濟(jì)成本的增加[29]。超聲輔助提取法基于超聲波的振動產(chǎn)生并傳遞較大的能量，可以在液相介質(zhì)中短時間內(nèi)通過空化作用分解細(xì)胞中的固體基質(zhì)，加速所需化合物的提取，此過程對產(chǎn)品的生物活性影響很小[30]。因此，超聲波輔助酶法具有提取時間短、成本低、效率高、保留酚類物質(zhì)原始特性等優(yōu)勢。前人研究表明，超聲波輔助酶法可以提高香蕉皮中多酚類化合物[31]及葡萄皮中白藜蘆醇的提取效率[32]。何若男等[15]基于微波-超聲波協(xié)同的方法對黑枸杞葉多酚提取得率為6.02 mg/g，略高于本試驗的多酚得率，這可能與提取方法、原料種類和采摘季節(jié)等有關(guān)。

多酚類物質(zhì)作為天然的抗氧化劑，對維持體內(nèi)自由基的動態(tài)平衡至關(guān)重要。枸杞葉多酚提取物的抗氧化能力可能與多酚類物質(zhì)中羥基的數(shù)量、位置以及芳香環(huán)的存在有關(guān)[33]。周志陽等[34]研究發(fā)現(xiàn)，寧夏枸杞芽茶、枸杞葉茶的熱水浸提物清除DPPH自由基的IC50值分別為147.63、241.23 μg/mL，且基于各類有機(jī)試劑對枸杞芽茶的萃取物清除DPPH自由基能力[5]均低于本試驗枸杞葉多酚提取物對DPPH自由基的清除能力（IC50為27.28 μg/mL），可能與本研究采用超聲波輔助酶法的提取工藝有關(guān)。

基于超聲波輔助酶法，采用響應(yīng)面分析得到枸杞葉中多酚提取的最優(yōu)參數(shù)∶乙醇體積分?jǐn)?shù)68%、料液比1∶89（g/mL）、超聲時間39 min、纖維素酶添加量2 mg/g，此時枸杞葉提取液中多酚含量為5.09 mg/g，與預(yù)測值（5.21 mg/g）的相對誤差為2.3%。抗氧化試驗結(jié)果表明，枸杞葉多酚具有較好的抗氧化活性，對DPPH和ABTS自由基的清除率隨著提取物中多酚質(zhì)量濃度的增加而升高，IC50值分別為27.28、190 μg/mL，為枸杞葉中多酚化合物的深入開發(fā)利用提供參考基礎(chǔ)。