基于簡化基因組測序揭示水角的瀕危機(jī)制

吳欣儀 王蒙 鄭希龍 張銳 何松 嚴(yán)岳鴻

摘要：物種的遺傳多樣性是決定物種適應(yīng)性和生存能力的關(guān)鍵因素。生境片段化是造成生物多樣性喪失的重要因素之一，對植物種群的遺傳多樣性有著重要影響。水角（Hydrocera triflora）作為一種瀕危植物，其遺傳多樣性狀況和瀕危機(jī)制尚未有報道。該文收集了水角7個種群共計34個樣本，利用簡化基因組測序技術(shù)（RAD-seq）獲得了單核苷酸變異位點(diǎn)（SNP）。通過種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)的分析，并結(jié)合種群歷史動態(tài)分析和不同氣候情景下物種潛在分布區(qū)預(yù)測，探討了水角的瀕危機(jī)制。結(jié)果表明：（1）水角遺傳多樣性較低（Ho=0.156 9、He=0.165 4、π=0.186 5），遺傳分化系數(shù)較高；AMOVA分析表明，遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)。（2）Mantel檢測表明環(huán)境距離與遺傳距離、地理距離均呈顯著正相關(guān)，分別為P=0.041 2和P=0.008 2。（3）水角的有效種群大小從全新世中期開始持續(xù)下降，與瓊北火山群的噴發(fā)時間一致。（4）與當(dāng)代氣候相比，雖然在未來氣候變化下水角的潛在分布區(qū)總面積變動不大，但在高CO2排放的情景下，大量的高適生區(qū)將會喪失并轉(zhuǎn)化為低適生區(qū)，特別是位于馬來群島的適生區(qū)幾乎完全消失。該研究結(jié)果表明，生境片段化導(dǎo)致了水角較低的遺傳多樣性和有效種群大小的持續(xù)下降。因此，自身更新能力低以及人為活動干擾、城市化等不利的環(huán)境條件是導(dǎo)致其瀕危的主要原因。建議加強(qiáng)對水角的就地保護(hù)，采用人工授粉等方法提高其基因流以增加其種群的遺傳多樣性，同時，要著重保護(hù)濕地免遭破壞。

關(guān)鍵詞： 生境片段化， 簡化基因組測序， 遺傳多樣性， 遺傳結(jié)構(gòu)， 物種分布模型， 種群歷史動態(tài)

中圖分類號：Q943? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? 文章編號：1000-3142（2023）08-1414-14

RAD-seq revealed the endangered mechanism of Hydrocera triflora （Balsaminaceae）

WU Xinyi1， WANG Meng1， ZHENG Xilong2， ZHANG Rui3， HE Song4， YAN Yuehong1*

（ 1. Orchid Conservation & Research Center of Shenzhen / National Orchid Conservation Center of China， Shenzhen Key Laboratory for Orchid Conservation and Utilization， Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration for Orchid Conservation and Utilization， Shenzhen 518114， Guangdong， China; 2. School of Traditional Chinese Medicine Resources， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006， China; 3. Shanghai Chenshan Plant Science Research Center， Chinese Academy of Sciences， Shanghai 201602， China; 4. Haikou Wetland Protection and Management Center， Haikou 570135， China ）

Abstract：The genetic diversity of species is a key factor in their adaptability and survival capability. Habitat fragmentation is recognized as one of the key factors causing biodiversity loss， and it has significant impacts on the genetic diversity of plant populations. Hydrocera triflora is an endangered species. Its genetic diversity is unclear and endangered mechanism has not been reported. In this study， 34 samples of H. triflora from seven populations were used to obtain single-nucleotide polymorphisms （SNP） by Restriction-site Associated DNA sequencing （RAD-seq）. We discussed the endangered mechanisms of H. triflora by analyzing population genetic diversity and structure. Additionally， we combined these results with historical population dynamics analysis and predictions of potential species distribution in different climate scenarios. The results were as follows： （1） H. triflora had low genetic diversity （Ho=0.156 9， He=0.165 4， π=0.186 5） and high genetic differentiation coefficient; AMOVA analysis showed that genetic variation mainly occurred within populations. （2） The Mantel test indicated that there was a significant positive correlation between environmental distance and genetic distance， as well as geographical distance， with respective P-values of 0.041 2 and 0.008 2. （3） The effective population size of H. triflora had been continuously declining since the mid-Holocene.（4） The total potential distribution area of H. triflora change slightly in the future compared to that in the modern climate. However， in scenarios of high CO2 emissions， the high suitable area decreased significantly and changed into low suitable area， especially in the Malay Islands where the suitable habitat was almost to extinction. The results indicate that habitat fragmentation caused a sustaineddecrease in the genetic diversity and effective population size of H. triflora. Therefore， the low self-renewal capacity， as well as detrimental environmental conditions such as human disturbance and urbanization， are the primary factors contributing to its endangered state. It is recommended to strengthen the in-situ protection of H. triflora， employing techniques such as artificial pollination to enhance gene flow among populations and thereby increase genetic diversity， and at the same time， we should focus on protecting wetlands from destruction.

Key words： habitat fragmentation， Restriction-site Associated DNA sequencing （RAD-seq）， genetic diversity， genetic structure， species distribution models， demographic history

保護(hù)基因組學(xué)（conservation genomics）廣義上是指將基因組技術(shù)和方法應(yīng)用于保護(hù)生物多樣性和物種保護(hù)工作中的一門學(xué)科（Allendorf et al.， 2010），主要聚焦于物種的瀕危機(jī)制與保護(hù)策略研究。評估物種的遺傳多樣性水平及其在個體和群體中的分布格局是對該物種保護(hù)遺傳研究的重要內(nèi)容（Hamrick & Godt，1996）。分子遺傳標(biāo)記是評價種質(zhì)資源遺傳多樣性的重要工具，推動保護(hù)遺傳學(xué)的發(fā)展。雖然遺傳信息早已運(yùn)用在瀕危物種的研究中，但是全基因組范圍的大量信息標(biāo)記卻是最近20年才開始使用（Supple & Shapiro， 2018），最初也只是應(yīng)用在少數(shù)的模式植物中。

高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing）的飛速發(fā)展催生了簡化基因組測序技術(shù)。簡化基因組測序（Restriction-site Associated DNA sequencing，RAD-seq）是一種常見的簡化基因組技術(shù)，通過測序限制性酶切位點(diǎn)附近的短片段，具有覆蓋度較高、測序成本低等優(yōu)點(diǎn)。它不受參考基因組的限制，能獲得大量的高質(zhì)量信息位點(diǎn)（single-nucleotide polymorphisms， SNP）（Davey et al.， 2011；Narum et al.， 2013）。目前，RAD-seq已廣泛應(yīng)用于群體研究與分子育種等領(lǐng)域，包括分子標(biāo)記開發(fā)、群體遺傳分析、遺傳圖譜構(gòu)建和全基因組關(guān)聯(lián)分析等。孫維悅等（2022）通過簡化基因組測序?qū)l危植物荷葉鐵線蕨（Adiantum nelumboides）的保護(hù)基因組學(xué)研究，揭示了其瀕危機(jī)制。Cai等（2021）對具有重要經(jīng)濟(jì)價值的熱帶雨林樹種滇南風(fēng)吹楠（Horsfieldia tetratepala）進(jìn)行RAD-seq測序，制定了更有效的保護(hù)策略。曹毓蓉等（2022）利用RAD-seq對極危物種波葉杜鵑（Rhododendron hemsleyanum）的遺傳特征進(jìn)行無參考基因組分析，證明對于無參考基因組的極小種群野生植物（plant species with extremely small populations， PSESP）也可用簡化基因組測序手段獲取SNP分子標(biāo)記。因此，相信針對無參考基因組的瀕危物種，簡化基因組測序可以獲得充足的遺傳信息，為保護(hù)基因組學(xué)研究提供有效工具。此外，有效種群大小的估計對于保護(hù)和管理瀕危物種、了解種群動態(tài)以及預(yù)測遺傳演化的方向和速度非常重要。種群歷史動態(tài)是保護(hù)基因組學(xué)的重要研究內(nèi)容（Girod et al.， 2011）。在種群的演化過程中，氣候變化和地質(zhì)事件作為重要的外部作用力對種群的動態(tài)變化起著關(guān)鍵作用。

除了物種的自身特征、氣候歷史等因素影響遺傳多樣性以外，生境片段化也是造成生物多樣性喪失的重要因素之一（Wilcove et al.，1998）。生境片段化不僅會導(dǎo)致遺傳多樣性降低、近交自交衰退、基因流減少和種群規(guī)模減小等（Young et al.， 1996；陳小勇，2000；Honnay & Jacquemyn， 2007），還會造成物種棲息地減少，影響傳粉者數(shù)量，降低傳粉率和繁殖成功率，從而影響物種的多樣性（Aguilar et al.， 2006；González-Varo et al.， 2009）。生境片段化是指原先連續(xù)的生境被分割成不同規(guī)模和形狀的片段而形成的新的生境格局（Wilcove & Mclellan， 1986）。目前，大部分的研究表明生境片段化對遺傳多樣性產(chǎn)生的負(fù)效應(yīng)多于正效應(yīng)（武晶和劉志民，2014）。在以專性傳粉的石竹（Dianthus deltoides）研究中，發(fā)現(xiàn)片段化生境的石竹其種子結(jié)實(shí)率低并可能產(chǎn)生自交種子而進(jìn)一步降低其種群的遺傳多樣性（Jennersten， 1988）。瀕危植物Bankia goodii受生境片段化影響，其路邊的物種個體繁殖力降低（Lamont et al.， 1993）。因此，當(dāng)瀕危物種遭受生境片段化影響時，應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)研究，以更好地理解生境片段化如何影響植物遺傳多樣性，揭示其瀕危機(jī)制并提出有效的保護(hù)策略。

水角（Hydrocera triflora）系鳳仙花科（Balsaminaceae）水角屬（Hydrocera）多年生水生草本植物，產(chǎn)自中國（海南）、印度、斯里蘭卡、泰國、越南、老撾、柬埔寨、馬來西亞及印度尼西亞。喜生于湖邊、沼澤濕地或水稻田中。對海南省水角資源現(xiàn)狀的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，隨著農(nóng)村旅游的開發(fā)建設(shè)，水體被改造，濕地被大量開發(fā)利用，水角生境受到不同程度的破壞，該種分布范圍越來越狹窄，十分罕見（王景飛等，2017）。在《中國生物多樣性紅色名錄——高等植物卷（2020）》評估報告中，水角處于瀕危（EN）等級。有關(guān)水角的相關(guān)研究較少，2014年中國科學(xué)院昆明植物研究所在?？诘貐^(qū)重新發(fā)現(xiàn)了該種植物，這是30多年來該物種在國內(nèi)再次被發(fā)現(xiàn)。水角屬和鳳仙花屬（Impatiens）的花發(fā)育揭示了鳳仙花科最早期分化譜系的進(jìn)化趨勢，花序從簡單的軸生花序漸進(jìn)轉(zhuǎn)變成更復(fù)雜的腋生花序以及花被片的分化是一個漸進(jìn)的過程（Janssens et al.， 2012）。水角屬作為鳳仙花科的單種屬，研究其遺傳多樣性不僅可以評估生境片段化對遺傳多樣性的影響，同時也為鳳仙花科的進(jìn)化和系統(tǒng)分類提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本研究以來自海口地區(qū)7個種群的34個水角個體為實(shí)驗(yàn)材料，通過RAD-seq簡化基因組測序技術(shù)，進(jìn)行群體遺傳分析，以探明以下內(nèi)容：（1）基因組水平下水角的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)；（2）水角有效種群大小的歷史變化；（3）不同氣候情景下水角的潛在分布區(qū)變化。以期為水角種質(zhì)資源的保護(hù)利用、育種策略的實(shí)施提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

對分布在海口市的水角進(jìn)行野外采集（圖1），共收集到7個種群合計34個樣本。每個種群均有一份憑證標(biāo)本，存放于深圳市蘭科植物保護(hù)研究中心標(biāo)本館（CNOCC）。每個種群具體信息見表1。

1.2 DNA提取和RAD文庫構(gòu)建

本研究利用天根植物基因組DNA提取試劑盒（DP305）進(jìn)行適當(dāng)改良后對所有樣品的基因組DNA進(jìn)行提取。通過瓊脂糖凝膠電泳和Qubit濃度檢測后，送至上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司測序。采用EcoR I限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后構(gòu)建長度范圍在300～500 bp的雙端測序文庫。純化后的文庫在Illumina Novoseq 6000測序平臺完成該物種簡化基因組測序。

1.3 獲取單核苷酸多態(tài)性（SNP）

在測序數(shù)據(jù)下機(jī)后，利用FastQC軟件進(jìn)行質(zhì)控，包括去除接頭、poly_A和低質(zhì)量的數(shù)據(jù)，最后得到高質(zhì)量的數(shù)據(jù)（clean data），用于后續(xù)的分析。本研究利用Stacks v2.54軟件（Catchen et al.， 2013）對水角的RAD-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行無參De Novo組裝和變異檢測。分別運(yùn)行Stacks軟件內(nèi)的process_radtags對樣本進(jìn)行過濾，除去不含RAD標(biāo)簽的序列。使用ustacks對每個樣本建立位點(diǎn)，設(shè)置控制錯配數(shù)的參數(shù)M為3，每個等位基因所需的最小片段數(shù)m為3；運(yùn)行cstacks程序構(gòu)建包含所有位點(diǎn)信息的catalog目錄文件，設(shè)置位點(diǎn)間允許的錯配數(shù)n為3；運(yùn)行sstacks程序把每個樣本比對到創(chuàng)建的目錄上；通過tsv2bam、gstacks以及population程序得到包含75 209個SNPs位點(diǎn)的vcf文件。為保證下游分析的可靠性，使用VCFtools v0.1.13軟件（Danecek et al.， 2011）對Stacks軟件中檢測出的SNPs進(jìn)一步過濾。設(shè)置--max-missing 0.9，即最大缺失率為90%；--maf 0.05，將最小等位基因頻率設(shè)置為0.05；--minDP 5，確?；蛐妥钚∩疃葹?。過濾后剩下高質(zhì)量的38 667個SNPs用于后續(xù)群體遺傳結(jié)構(gòu)的分析。

1.4 群體結(jié)構(gòu)分析

基于34個水角樣品的SNPs位點(diǎn)，運(yùn)行vcf2phylip腳本構(gòu)建個體間的遺傳距離矩陣，利用IQ_TREE v1.6.9軟件（Nguyen et al.， 2015）使用最大似然法（maximum likelihood， ML）進(jìn)行系統(tǒng)樹的構(gòu)建。根據(jù)1 000次重復(fù)的快速自展（ultrafast bootstrap， UFBoot）（Minh et al.， 2013）和SH-aLRT（Guindon et al.， 2010）測試進(jìn)化枝，得到最終的系統(tǒng)發(fā)育樹。利用FigTree v1.4.3軟件（http：//tree.bio.ed.ac.uk/software/gtree/）可視化和編輯生成的樹文件。

將之前獲得的高質(zhì)量的SNP數(shù)據(jù)集使用VCFtools軟件轉(zhuǎn)換成ped和map文件后進(jìn)行過濾生成bed文件，用Admixture（Alexander et al.， 2009）基于每個個體的基因型推斷個體祖先成分，模擬在亞群數(shù)K值為2到7情況下的分群情況，根據(jù)不同K值模擬下的最小交叉驗(yàn)證（cross validation， CV）獲得最佳分群數(shù)。

使用GCTA v1.26.0軟件（https：//yanglab.westlake.edu.cn/software/gcta/）生成用于PCA分析的矩陣，用R語言中的ggplot2軟件包繪制主成分分析的結(jié)果圖。

1.5 群體遺傳多樣性分析

通過Stacks軟件中的Populations子程序計算物種水平的近交系數(shù)（inbreeding coefficient，F(xiàn)IS），觀察雜合度（observed heterozygosity， Ho），期望雜合度（expected heterozygosity， He）。同時基于所有（變異和非變異）位點(diǎn)計算核苷酸多態(tài)性（nucleotide diversity， π）等遺傳參數(shù)。再用R語言的GroupGenome v2.6.1程序包（Pfeifer et al.， 2014）計算種群間遺傳分化系數(shù)（genetic differentiation among populations， FST），衡量群體間遺傳分化水平。

1.6 Mantel相關(guān)性檢驗(yàn)和分子方差分析

為了評估7個水角種群的遺傳距離、地理距離以及環(huán)境距離之間的相關(guān)性，利用R軟件中的“raster”和“rgdal”提取每個種群點(diǎn)的氣候信息，構(gòu)建19個環(huán)境因子的環(huán)境距離矩陣，用“geosphere”構(gòu)建地理距離的矩陣，利用“ape”讀取遺傳距離矩陣，用“ade4”對兩兩矩陣進(jìn)行9 999次的Mantel重復(fù)檢驗(yàn)，利用“ggplot”進(jìn)行Mantel檢驗(yàn)結(jié)果的繪圖。此外，利用Arlequin 3.5軟件（Excoffier & Lischer， 2010）進(jìn)行分子方差分析（analysis of molecular variance， AMOVA）。AMOVA 基于進(jìn)化距離（evolutionary distance）來度量并計算單倍型（含等位基因）或基因型間的方差（δ2），計算組間遺傳分化系數(shù)（genetic differentiation among groups， FCT），推斷群體不同遺傳組分之間的變異水平。

1.7 種群歷史動態(tài)分析

基于SMC模擬種群歷史動態(tài)的方法是高度依賴于完整基因組上的重組圖譜，并不適用于無參考基因組的物種（Li & Durbin， 2011）。而基于點(diǎn)位頻譜（site frequency spectum，SFS）的方法不依賴于位點(diǎn)之間的連鎖或連續(xù)性（Gutenkunst et al.， 2009），并且對近期的種群歷史大小變化有較高的分辨率（Liu & Fu， 2015; Lapierre et al.， 2017）。因此，將所獲得的SNP數(shù)據(jù)使用基于SFS的Stairway Plot v2（Liu & Fu， 2020）推測水角在100 kya～1 kya（thousand years ago）間的Ne變化。生成無缺失且無連鎖不平衡（linkage disequilibrium， LD）的SNP數(shù)據(jù)集，將VCF文件用python腳本easySFS（https：//github.com/isaacovercast/easySFS）建立一維（one-dimensional， 1D）SFS。將SFS狀態(tài)指定為folded，以統(tǒng)計次等位基因的SFS。選擇使位點(diǎn)數(shù)盡量多的projection值輸出SFS信息，將SFS信息輸入Stairway Plot v2運(yùn)行所需的blueprint文件中。突變率設(shè)置為1.0×10-8，2年為一代，200次自展檢驗(yàn)用于計算Ne中位數(shù)及95%置信區(qū)間。結(jié)果在R語言中可視化。

1.8 潛在分布區(qū)預(yù)測

根據(jù)材料采集，分布點(diǎn)通過GPS實(shí)地定位以及中國數(shù)字植物標(biāo)本館（http：//www.cvh.org.cn/）和全球生物多樣性信息網(wǎng)絡(luò)（https：//www.gbif.org/）等相關(guān)數(shù)據(jù)庫獲取標(biāo)本采集地經(jīng)緯度信息，共收集到東南亞水角坐標(biāo)信息200余個。對所有數(shù)據(jù)按照MaxEnt模型（http：//biodiversity informatics.amnh.org/open_source/maxent）要求進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理， 并且為了防止在進(jìn)行最大熵模型分析時出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，將水角的分布數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，在50 km2內(nèi)的分布點(diǎn)僅保留1個，共計得到29個具有經(jīng)緯度信息的水角分布點(diǎn)并整理生成CSV文件。

從全球氣候數(shù)據(jù)庫WorldClim 2.1（http：//www.worldclim.org）分別下載全新世中期（mid-Holocene， MID; 約6 000年前）、當(dāng)代（1970—2000年）和未來（2081—2100年）的19個生物氣候變量，數(shù)據(jù)空間分辨率為2.5 min（5 k分辨率）。未來氣候情景選擇CMIP6中SSP1-2.6和SSP5-8.5（shared socioeconomic pathway，SSP）的兩組數(shù)據(jù)，分別表示年平均溫度上升1.4～1.8 ℃和4.4～4.8 ℃。

運(yùn)行MaxEnt軟件模擬水角在不同氣候情景下的潛在分布格局，設(shè)置訓(xùn)練集為75%，測試集為25%進(jìn)行模擬分析。將物種分布數(shù)據(jù)與氣候環(huán)境數(shù)據(jù)一起導(dǎo)入MaxEnt中，選擇刀切法（Jackknife）模型迭代500次，計算各環(huán)境變量對物種分布格局的貢獻(xiàn)率，繪制響應(yīng)曲線并制作預(yù)測圖。加載到ArcGIS 10.2中，提取東南亞區(qū)域，根據(jù)生境適宜度指數(shù)（habitat suitability index， HSI），劃分為四個等級。其中，HSI≤0.1為非適生區(qū)；0.1<HSI≤0.3為低適生區(qū)；0.3<HSI≤0.5中適生區(qū)；HSI>0.5為高適生區(qū)。采用ROC曲線評價預(yù)測模型的準(zhǔn)確性，同時根據(jù)氣候因子的貢獻(xiàn)率判斷影響物種分布的主導(dǎo)環(huán)境因子。

2結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)概況

本研究利用RAD簡化基因組技術(shù)對34個水角樣本進(jìn)行測序，測序結(jié)果以FASTQ（簡稱fq）格式儲存，包含了測序的序列信息和其對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。經(jīng)過質(zhì)量評估和過濾后，共獲得37.91 Gb的clean data數(shù)據(jù)，平均每個樣本為1.12 Gb。每個樣本的reads讀長在2 512 919到55 093 740，其中GC含量均值為36.2%，所有樣本的Q30均值為92.9%，表明測序質(zhì)量較高，達(dá)到后續(xù)分析的要求。使用Stacks進(jìn)行無參考基因組分析后，得到水角34個樣本的平均位點(diǎn)數(shù)為68 226，平均片段覆蓋深度為8.61 X。經(jīng)過VCFtools再次過濾后，最終獲得38 667個高密度的SNP位點(diǎn)。

2.2 群體遺傳結(jié)果分析

進(jìn)行Structure分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)K=3時，CV值最小（圖2：A），說明34個個體可分為3個遺傳聚類（圖2：B）。利用最大似然法（ML）基于38 667個SNPs位點(diǎn)對34個樣本構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明（圖2：C），每個種群的個體都能聚在同一個遺傳分支上，并具有100%的支持率。昌旺溪（CWC）、卜茂村（BMC）、東興村（DXC）的遺傳結(jié)構(gòu)更相似為一組（Cluster 1）；卜壁村（BBC）、卜史村（BSC）、文選村2（WXC2）的遺傳結(jié)構(gòu)顯示出更近的親緣關(guān)系，傾向于另一組（Cluster 2）；文選村1（WXC1）表現(xiàn)出與其他種群不一樣的遺傳結(jié)構(gòu)，為Cluster 3。主成分分析（PCA）是根據(jù)群體的原始數(shù)據(jù)矩陣計算出單個個體的特征向量，再繪制特征向量的散點(diǎn)圖來獲得群體分類情況。34個樣品基于主成分1和主成分2繪制PCA圖（圖3）?？梢?，每個種群都分布得很集中，這與系統(tǒng)樹結(jié)果一致。其中DXC、CWC、BMC、BBC和WXC2分布相對集中。在PC2維度上，WXC1與其他種群相隔得較遠(yuǎn)，這與structure分析的結(jié)果一致。

2.3 群體遺傳多樣性分析

對7個種群的遺傳多樣性信息進(jìn)行的統(tǒng)計分析表明（表2），34份材料的平均Ho、He和π分別為0.156 9、0.165 4和0.186 5，各種群中均具有特有等位基因，平均值為828.29，其中BSC的特有等位基因最高（1 445），同時其Ho最低（0.079 1）。核苷酸多樣性（π）分析表明，π=0.015 02～0.239 9，在采樣地東部的Cluster 1種群（BMC、CWC和DXC）具有更高的遺傳多樣性。FIS =-0.006 1～0.168 3，種群內(nèi)FIS平均值為0.061 67，其中CWC和WXC2略為負(fù)值，說明這兩個種群存在雜合子過?，F(xiàn)象。

基于38 667個SNPs位點(diǎn)的34個水角樣本種群間成對的FST值計算結(jié)果（表3）表明：FST為0.203 5～0.584 6，其中CWC與BMC之間的FST值最?。?.203 5），表明兩個種群間的遺傳交流在所有種群間最為頻繁。其他成對FST均大于0.25表明水角7個種群間的遺傳分化程度較高。其中，WXC1種群分化最大，與其他6個種群間的遺傳分化系數(shù)均值為0.528 1。

2.4 AMOVA分子方差分析和Mantel檢測

AMOVA分子方差分析的結(jié)果（表4）顯示，當(dāng)把7個水角種群分成上述3個群組時， 9.35%的遺傳變異發(fā)生在組間，群組間的遺傳分化系數(shù)為FCT=0.093 53，說明群組間的遺傳分化不顯著。種群內(nèi)的遺傳變異占總變異的52.65%，種群間的遺傳變異率為38%?；谶z傳距離和環(huán)境距離的Mantel檢測，結(jié)果表明兩者之間存在顯著正相關(guān)（R=0.434 6，P=0.041 2）（圖4：A）；基于遺傳距離和地理距離的Mantel檢測， 結(jié)果證明兩者之間不存在顯著的聯(lián)系（P=0.339 3）（圖4：B）；基于環(huán)境距離與地理距離的Mantel檢測結(jié)果表明環(huán)境距離與地理距離呈顯著正相關(guān)，意味兩者之間存在很強(qiáng)的聯(lián)系（R=0.643 2，P=0.008 2）（圖4：C）。

2.5 群體大小歷史分析

為在Stairway Plot中對水角的群體大小隨時間變化進(jìn)行推測，首先篩選到不連鎖的SNP數(shù)量38 667個。Stairway Plot推測該種群100 kya～1 kya的有效群體大小變化（圖5）。由圖5可知，在11.7 kya的末次冰期（last glacial period， LGP）以后，種群有收縮趨勢。在MID時期，特別是在4 kya～2 kya，水角有效種群大小出現(xiàn)明顯的下降。

2.6 不同情景下的潛在分布格局

根據(jù)MaxEnt模型AUC值均大于0.952，表明該模型預(yù)測物種適宜分布區(qū)的結(jié)果比較可靠。在環(huán)境變量中，溫度季節(jié)性、最冷月份的最低溫度、年平均溫度和海拔所占貢獻(xiàn)率較大，表明它們是影響水角分布的主要環(huán)境因子。

結(jié)果表明從MID時期到當(dāng)代 （圖6：A，B和表5），水角的總適生面積大幅度的減少，主要表現(xiàn)在高適生面積減少29%，中適生面積減少34%。未來在SSP1-2.6情景下（圖6：C和表5），水角的潛在分布總適生面積較當(dāng)代增加了4.74%，主要表現(xiàn)在低適生面積較當(dāng)代增加了33.40%。在SSP5-8.5情景下 （圖6：D和表5）， 水角的總適生面積變動不大，但是高適生面積大幅減少， 高適生面積較當(dāng)代減少了23.34%，中適生面積較現(xiàn)在減少了4.91%，而低適生面積增加了72.94%。由此可見，在未來隨著CO2濃度的升高，全球平均溫度的升高，海平面的上升，生境破碎化嚴(yán)重，對水角的高適生區(qū)有很大的影響，大量的高適生區(qū)將會喪失或轉(zhuǎn)化為低適生區(qū)。

3討論與結(jié)論

3.1 水角的遺傳多樣性：生境片段化降低了水角的遺傳多樣性

自20世紀(jì)90年代以來，生境片段化問題在國內(nèi)逐漸受到關(guān)注，一直是保護(hù)生物學(xué)和生態(tài)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。起初集中在熱帶雨林中開展（朱華等，2001；王喜龍等，2016），亞熱帶森林次之（李銘紅等，2008）。在不同生境類型中，島嶼的研究僅占2%（吳倩倩等，2017）。研究物種的遺傳多樣性，不但可以反映物種適應(yīng)環(huán)境變化的潛力，而且還可以為物種資源特別是瀕危物種現(xiàn)有的生存方式及狀態(tài)進(jìn)行有效的評估（Mable， 2019）。研究發(fā)現(xiàn)，由于遺傳漂變和近交的原因，地理分布廣泛的物種遺傳多樣性高于地理分布狹窄的稀有和瀕危物種（Cole， 2003），遺傳多樣性水平較低是一個物種瀕危或分布狹窄的普遍特征（Gitzendanner & Soltis， 2000；景昭陽等，2023）。核苷酸多樣性是衡量群體遺傳多樣性的整體指標(biāo)（Catchen et al.， 2013b）。本研究利用SNP分子標(biāo)記對水角7個種群進(jìn)行群體遺傳學(xué)分析，結(jié)果顯示水角具有較低的遺傳多樣性（π=0.186 5，Ho=0.156 9，He=0.165 4）。在瀕危植物荷葉鐵線蕨的群體遺傳分析中也有類似的發(fā)現(xiàn)，其不同居群的平均π、Ho和He分別為0.373、0.106和0.135（孫維悅等，2022）。與木本植物相比，草本植物具有更低的遺傳多樣性（Chung et al.， 2020）。利用RAD-seq技術(shù)研究的極危樹種波葉杜鵑的遺傳多樣性為（π=0.241 0，He=0.226 7）（曹毓蓉等，2022）。與同科的物種相比，水角的平均He為0.165 4，略低于大旗瓣鳳仙花（Impatiens macrovexilla）的He（0.018 6）（Zhou et al.， 2020）。同時本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，水角的平均Ho小于平均He，盡管結(jié)果在統(tǒng)計上不顯著，但這也暗示著水角種群中存在雜合子缺失和一定程度的近交，是生境片段化的遺傳效應(yīng)的表現(xiàn)。Dixo等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，巴西大西洋沿岸森林中蟾蜍（Rhinella ornata）種群遺傳多樣性與破碎化面積呈正相關(guān)，生境片段化對剩余棲息地之間的基因流也產(chǎn)生負(fù)面影響。生境片段化導(dǎo)致種群之間的遺傳流動受到限制，從而導(dǎo)致種群內(nèi)部的近親交配增加，雜合子缺失的發(fā)生，進(jìn)而降低其遺傳多樣性。

不同種群間的遺傳距離有助于對不同種群的遺傳多樣性進(jìn)行研究， 也可用來表述群體遺傳結(jié)構(gòu)差異。不同種群之間的群體遺傳多樣性可通過FST進(jìn)行研究。當(dāng)FST為0.25以上，表示種群間有很大的遺傳分化（Wright， 1978）。在水角7個種群兩兩之間的21對FST中有20個FST大于0.25，表明7個種群間的遺傳分化水平較高。AMOVA分析表明，水角38%的遺傳變異發(fā)生在組內(nèi)群體間，而群體內(nèi)的遺傳變異更高，為52.65%。當(dāng)前并未見有對水角遺傳多樣性的研究，鳳仙花科僅僅包括水角屬和鳳仙花屬，這些植物在分類學(xué)上密切相關(guān)。因此，對鳳仙花科的研究結(jié)果可以為水角的遺傳多樣性研究提供一些初步的參考。鐘云芳等（2014）利用ISSR對鳳仙花科的研究中發(fā)現(xiàn)，海南鳳仙花（Impatiens hainanensis）自然種群的主要變異來自種群內(nèi)（92%），種群間變異較少（8%），水角也有與之一致的結(jié)果，即種群內(nèi)的遺傳變異較大。同時在對大旗瓣鳳仙花的研究中也發(fā)現(xiàn)，無論是利用ISSR分析（李祥軍，2013），還是使用基于“跳躍基因”或基于逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的引物間結(jié)合位點(diǎn)（inter-primer binding site， iPBS）標(biāo)記系統(tǒng)來評估（Zhou et al.， 2020），其種群內(nèi)的遺傳多樣性大于種群間的，即主要的遺傳多樣性存在于種群內(nèi)，表明該種在收集種質(zhì)的每個地點(diǎn)都有廣泛的基因型。在聚類分析、遺傳結(jié)構(gòu)分析和PCA分析中，本研究收集到的海南水角群體可分為3個具有不同遺傳組分的組。盡管存在這些不同的遺傳組分，但其組間的遺傳分化較低（FCT=0.093 53）。考慮到水角的生境特征以及人類建筑、農(nóng)田等人為屏障的存在，我們推測亞居群的形成可能是生境隔離所致。

對水角的環(huán)境距離、遺傳距離和地理距離的Mantel相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果表明：水角環(huán)境距離與地理距離具有顯著的正相關(guān)（P=0.008 2），同時環(huán)境距離和遺傳距離也存在顯著的正相關(guān)（P=0.041 2），意味著水角種群之間的遺傳分化與它們之間的環(huán)境差異有關(guān)，并且這種環(huán)境差異與地理距離的變化密切相關(guān)。但是其地理距離與遺傳距離沒有顯著相關(guān)性（P=0.339 3），即水角種群的遺傳距離沒有隨著隔離距離的增加而增加。這與海南鳳仙花自然種群的遺傳距離和地理距離呈顯著的高度相關(guān)性（r=0.952，P<0.01）有差異（鐘云芳等，2014）。這可能是水角不同于廣泛的水生植物，其具有肉質(zhì)假漿果，裸露于水面或沉入水中，可供鳥類或魚類等動物取食，因此其地理距離不能反映其種群的遺傳距離。也可能與水角的狹窄分布，不同種群間其地理距離過近有關(guān)。總體而言，水角種群遺傳分化水平高，遺傳距離與環(huán)境距離相關(guān)但與地理距離不相關(guān)，這說明水角種群間的遺傳分化主要受到生境片段化所引起的環(huán)境距離的影響，而不是地理距離的影響。

3.2 水角的群體歷史：萬年前瓊北火山群爆發(fā)后水角種群大小急劇衰退

物種的種群歷史動態(tài)是其所經(jīng)歷的歷史事件和遺傳特性共同作用的結(jié)果（Hewitt， 2000），能預(yù)測物種當(dāng)前和未來的生存力（Hare et al.， 2011）。本研究通過使用大量的SNP標(biāo)記對水角進(jìn)行群體大小歷史分析，發(fā)現(xiàn)水角在100 kya到末次冰期之前，有效種群大小都相對穩(wěn)定，我們推測這與全新世早期，全球性氣候轉(zhuǎn)溫，海南島植物區(qū)系較為興盛發(fā)達(dá)有關(guān)（顏家安，2006）。水角的有效種群大小從末次冰期（LGP：11.2 kya）后開始持續(xù)下降，直至現(xiàn)在。瓊北火山群的噴發(fā)活動可能發(fā)生在距今約1萬年（樊祺誠等，2004），這與水角有效種群大小開始下降時間吻合，推測瓊北火山群的噴發(fā)活動可能引起土地破壞、氣候變化或其他環(huán)境因素的改變，導(dǎo)致水角生境的片段化，限制了水角的基因交流。在MID時期，水角有效種群大小在明顯下降。MID是一個全球范圍內(nèi)人類活動擴(kuò)張的重要時期。在這個時期，人類社會經(jīng)歷了從狩獵采集生活方式向農(nóng)業(yè)和定居生活的轉(zhuǎn)變，這對環(huán)境演化也產(chǎn)生了重要影響。在新石器中晚期，有1萬余人覓食于海南島，與植物爭地，植物生境也逐漸發(fā)生較大的變化（司徒尚紀(jì)，1987）。蔣有緒等（2002）對海南島北部火山口沉積孢粉的研究，發(fā)現(xiàn)海南島的農(nóng)業(yè)活動早在3 000 aBP就開始對地低植物具有較明顯的影響。由此推測，水角的有效種群大小在歷史時期首先受到瓊北火山群爆發(fā)的影響，進(jìn)而又受到人類活動的影響，兩種因素疊加導(dǎo)致生境的持續(xù)變化。這種有效種群大小的減少可能導(dǎo)致了其遺傳多樣性的喪失和種群的遺傳分化，逐漸形成如今的分布格局。

3.3 水角的潛在分布格局：高CO2排放情境下水角的高適生區(qū)轉(zhuǎn)變?yōu)榈瓦m生區(qū)

在環(huán)境因子貢獻(xiàn)率的分析中，本研究分析所得，溫度季節(jié)性、最冷月份的最低溫度和年平均溫度的總貢獻(xiàn)率占比達(dá)67.6%，這與水角喜溫怕寒，溫度低于15 ℃即停止生長的生活習(xí)性相符（王景飛等，2017）。而海拔占了第四高的貢獻(xiàn)率7.4%，表明它是影響水角分布的主要環(huán)境因子之一，也佐證了在海南鳳仙花的研究中低海拔的遺傳多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于高海拔梯度的種群這一結(jié)果，說明海拔是影響群體基因流的重要因素（鐘云芳等，2014）。

對不同氣候情景下東南亞地區(qū)的水角的潛在分布適生區(qū)進(jìn)行模擬分析，結(jié)果表明從MID時期到當(dāng)代，水角的總適生面積大幅度的減少，其中位于海南島的適生區(qū)由高適生區(qū)和中適生區(qū)的分布格局轉(zhuǎn)變?yōu)楫?dāng)代的以低適生區(qū)為主的分布格局。這與種群歷史動態(tài)分析結(jié)果一致，表明從MID時期開始，水角的生存受到威脅直至現(xiàn)在。與當(dāng)代氣候相比，在未來氣候變化下水角的潛在分布區(qū)總面積變動不大，但低適生面積較當(dāng)代增加了33.40%。特別是在SSP5-8.5的氣候環(huán)境情景下，高適生面積較現(xiàn)在減少了23.34%，取而代之的是低適生面積增加了72.94%。其中，位于馬來群島的適生區(qū)幾乎完全消失。根據(jù)政府間氣候變化專門委員會（Intergovernmental Panel on Climate Change， IPCC）發(fā)表的《第六次評估報告》，在SSP5-8.5的氣候環(huán)境下，CO2排放量到2050年將增加一倍，到2100年全球平均氣溫將升高4.4 ℃。我們推測這可能與氣候變暖條件下亞熱帶北界向北推移有很大的關(guān)聯(lián)，未來CO2濃度升高將引起全球變暖，動植物的分布逐漸向高緯度和高海拔地區(qū)移動（Tingley， 2014），從而導(dǎo)致水角在馬來群島的適生區(qū)近乎消失。這些分析結(jié)果表明，未來的氣候變化將進(jìn)一步影響水角的適生區(qū)，特別是高適生區(qū)將面臨喪失和轉(zhuǎn)變的風(fēng)險。這說明水角種群面臨著適生環(huán)境變化的挑戰(zhàn)，其保護(hù)策略也應(yīng)隨之調(diào)整。

人類開荒、伐木、放牧等活動以及交通和水庫建設(shè)等是全球自然生境面臨著生境喪失、片段化威脅和生物多樣性降低的主要原因（Laurance et al.， 2014; Haddad et al.， 2015）。城市化也加劇棲息地的破碎化，特別是對于城市中殘余的小種群本土植物更是如此。

對于水角而言，較低的遺傳多樣性水平，可能削弱了其在遷徙過程中的適應(yīng)潛力，導(dǎo)致其有效種群規(guī)模降低。種群內(nèi)的遺傳分化系數(shù)較高，說明其自然種群之間的基因流動較少。環(huán)境距離與遺傳距離、地理距離之間均呈顯著正相關(guān)，表明環(huán)境因素在水角種群遺傳分化中起到重要的作用，而地理距離則作為間接因素通過影響環(huán)境差異來影響遺傳分化的發(fā)生。因此，限制水角種群發(fā)展的重要原因來自其自身較低的遺傳多樣性和生境因素，具體表現(xiàn)為濕地生境的片段化嚴(yán)重，再加上人為活動干擾、城市化等不利的環(huán)境條件使得其生境進(jìn)一步被破壞，種群規(guī)模進(jìn)一步減小，逐步形成如今瀕危的狀態(tài)。針對水角瀕臨滅絕這一現(xiàn)象，一方面要著重保護(hù)濕地免受人為因素的破壞，其次進(jìn)行就地保護(hù)，更有效地提高其群體的遺傳特性；另一方面采用人工授粉等方法提高其基因流，以促進(jìn)其種群的發(fā)展。

參考文獻(xiàn)：

AGUILAR R， ASHWORTH L， GALETTO L， et al.， 2006. Plant reproductive susceptibility to habitat fragmentation： review and synthesis through a meta-analysis ［J］. Ecol Lett， 9（8）： 968-980.

ALEXANDER DH， NOVEMBRE J， LANGE K， 2009. Fast model-based estimation of ancestry in unrelated individuals ［J］. Genome Res， 19（9）： 1655-1664.

ALLENDORF FW， HOHENLOHE PA， LUIKART G， 2010. Genomics and the future of conservation genetics ［J］. Nat Rev Genet， 11： 697-709.

CAI CN， XIAO JH， CI XQ， et al.， 2021. Genetic diversity of Horsfieldia tetratepala （Myristicaceae）， an endangered plant species with extremely small populations to China： implications for its conservation ［J］. Plant Syst Evol， 307（4）： 1-12.

CAO YR， MA YP， ZHANG XJ， et al.，2022. Genetic characteristics of Rhododendron hemsleyanum based on SNP molecular markers ［J］. J Yunnan Univ （Nat Sci Ed）， 44（4）： 859-869.［曹毓蓉， 馬永鵬， 張秀姣， 等， 2022. 基于SNP分子標(biāo)記的波葉杜鵑遺傳特征分析 ［J］. 云南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 44（4）： 859-869.］

CATCHEN J， BASSHAM S， WILSON T， et al.， 2013. The population structure and recent colonization history of Oregon three spine stickleback determined using restriction-site associated DNA-sequencing ［J］. Mol Ecol， 22（11）： 2864-2883.

CATCHEN J， HOHENLOHE PA， BASSHAM S， et al.， 2013. Stacks： an analysis tool set for population genomics ［J］. Mol Ecol， 22（11）： 3124-3140.

CHEN XY， 2000. Effects of habitat fragmentation on genetic structure of plant populations and implications for the biodiversity conservation ［J］. Acta Ecol Sin， 20（5）： 884-892.［陳小勇， 2000. 生境片斷化對植物種群遺傳結(jié)構(gòu)的影響及植物遺傳多樣性保護(hù) ［J］. 生態(tài)學(xué)報， 20（5）： 884-892.］

CHUNG MY， SON SW， HERRANDO-MORAIRA S， et al.， 2020. Incorporating differences between genetic diversity of trees and herbaceous plants in conservation strategies ［J］. Conserv Biol， 34（5）： 1142-1151.

COLE CT， 2003. Genetic variation in rare and common plants ［J］. Ann Rev Ecol Evol Syst， 34（1）： 213-237.

DANECEK P， AUTON A， ABECASIS G， et al.， 2011. The variant call format and VCF tools［J］. Bioinform， 27（15）：2156-2158.

DAVEY JW， HOHENLOHE PA， ETTER PD， et al.， 2011. Genome-wide genetic marker discovery and genotyping using next-generation sequencing ［J］. Nat Rev Genet， 12： 499-510.

DIXO M， METZGER JP， MORGANTE JS， et al.， 2009. Habitat fragmentation reduces genetic diversity and connectivity among toad populations in the Brazilian Atlantic Coastal Forest ［J］. Biol Conserv， 142（8）： 1560-1569.

EXCOFFIER L， LISCHER HE， 2010. Arlequin suite ver 3.5： a new series of programs to perform population genetics analyses under Linux and Windows ［J］. Mol Ecol Resour， 10（3）： 564-567.

FAN QC， SUN Q， LI N， et al.， 2004. Periods of volcanic activity and magma evolution of Holocene in North Hainan Island ［J］. Acta Petr Sin， 20（3）： 533-544.［樊祺誠， 孫謙， 李霓， 等， 2004. 瓊北火山活動分期與全新世巖漿演化 ［J］. 巖石學(xué)報， 20（3）： 533-544.］

GIROD C， VITALIS R， LEBLOIS R， et al.， 2011. Inferring population decline and expansion from microsatellite data： a simulation-based evaluation of the Msvar method ［J］. Genetics， 188（1）： 165-179.

GITZENDANNER MA， SOLTIS PS， 2000. Patterns of genetic variation in rare and widespread plant congeners ［J］. Am J Bot， 87： 783-792.

GUINDON S， DUFAYARD JF， LEFORT V， et al.， 2010. New algorithms and methods to estimate maximum-likelihood phylogenies： assessing the performance of PhyML 3.0 ［J］. Syst Biol， 59（3）： 307-321.

GUTENKUNST RN， HERNANDEZ RD， WILLIAMSON SH， et al.， 2009. Inferring the joint demographic history of multiple populations from multidimensional SNP frequency data ［J］. PLoS Genet， 5（10）： e1000695.

HADDAD NM， BRUDVIG LA， CLOBERT J， et al.， 2015. Habitat fragmentation and its lasting impact on Earth’s ecosystems ［J］. Sci Adv， 1（2）： e1500052.

HAMRICK JL， GODT MJW， 1996. Effects of life history traits on genetic diversity in plants ［J］. Philosophical Transac Royal Soc London.Series B： Biol Sci， 351（1345）： 1291-1298.

HARE MP， NUNNEY L， SCHWARTZ MK， et al.， 2011. Understanding and estimating effective population size for practical application in marine species management ［J］. Conserv Biol， 25： 438-449.

HEWITT G， 2000. The genetic legacy of the Quaternary ice ages ［J］. Nature， 405： 907-913.

HOLSINGER KE， WEIR BS， 2009. Genetics in geographically structured populations： Defining， estimating and interpreting ［J］. Nat Rev Genet， 10（9）： 639-650.

HONNAY O， JACQUEMYN H， 2007. Susceptibility of common and rare plant species to the genetic consequences of habitat fragmentation ［J］. Conserv Biol， 21（3）： 823-831.

JANSSENS SB， SMETS EF， ALEXANDER V， 2012. Floral development of Hydrocera and Impatiens reveals evolutionary trends in the most early diverged lineages of the Balsaminaceae ［J］. Ann Bot， （7）： 1285-1296.

JENNERSTEN O， 1988. Pollination in Dianthus deltoides （Caryophyllaceae）： effect of habitat fragmentation on visitation and seed set ［J］. Conserv Biol， 2： 359-366.

JIANG YX， WANG BS， ZANG RG， et al.， 2002. Tropical rainforest biodiversity and its formation mechanism in Hainan Island ［M］. Beijing： Science Press： 30-84.［蔣有緒， 王伯蓀， 藏潤國， 等， 2002. 海南島熱帶雨林生物多樣性及其形成機(jī)制 ［M］. 北京： 科學(xué)出版社： 30-84.］

JING ZY， CHENG KG， SHU H， et al.， 2023. Whole genome resequencing approach for conservation biology of endangered plants ［J］. Biodivers Sci， 31（5）： 22679.［景昭陽， 程可光， 舒恒， 等， 2023. 全基因組重測序方法在瀕危植物保護(hù)中的應(yīng)用 ［J］. 生物多樣性， 31（5）： 22679.］

LAMONT BB， KLINKHAMER PGL， WITKOWSKI ETF， 1993. Population fragmentation may reduce fertility to zero in Banksia goodie — a demonstration of the Allee effect ［J］. Oecologia， 94： 446-450.

LAM-TUNG N， SCHMIDT HA， ARNDT VH， et al.， 2015. IQ-TREE： A fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies ［J］. Mol Biol Evol， （1）： 268-274.

LAPIERRE M， LAMBERT A， ACHAZ G， 2017. Accuracy of demographic inferences from the site frequency spectrum： the case of the Yoruba population ［J］. Genetics， 206（1）： 439-449.

LAURANCE WF， CLEMENTS GR， SLOAN S， et al.， 2014. A global strategy for road building ［J］. Nature， 513： 229-232.

LI H， DURBIN R， 2011. Inference of human population history from individual whole-genome sequences ［J］. Nature， 475（7357）： 493-496.

LI MH， SONG RS， JIANG YF， et al.， 2008. Plant diversity in the six evergreen broad-leaved forest fragments in East China ［J］. Acta Ecol Sin， 28（3）： 1137-1146.［李銘紅， 宋瑞生， 姜云飛， 等， 2008. 片斷化常綠闊葉林的植物多樣性 ［J］. 生態(tài)學(xué)報， 28（3）： 1137-1146.］

LI XJ， TANG WX， HUANG SX， et al.， 2013. ISSR analysis for genetic diversity of Impatiens macrovexilla in Guilin ［J］. Guangdong Agric Sci， 40（13）： 142-144.［李祥軍， 唐文秀， 黃仕訓(xùn)， 等， 2013. 桂林大旗瓣鳳仙花遺傳多樣性的ISSR分析 ［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 40（13）： 142-144.］

LIU XM， FU YX， 2015. Exploring population size changes using SNP frequency spectra ［J］. Nature Genetics， 47（5）： 555-559.

LIU XM， FU YX， 2020. Stairway Plot 2： demographic history inference with folded SNP frequency spectra ［J］. Genome Biol， 21： 280.

MABLE BK， 2019. Conservation of adaptive potential and functional diversity： integrating old and new approaches ［J］. Conserv Genet， 20（1）： 89-100.

MINH BQ， NGUYEN M， HAESELER AV， 2013. Ultrafast approximation for phylogenetic bootstrap ［J］. Mol Biol Evol， 30（5）： 1188-1195.

MORRELL PL， BUCKLER ES， ROSS-IBARRA J， 2012. Crop genomics： advances and applications ［J］. Nat Rev Genet， 13： 85-96.

NARUM SR， BUERKLE CA， DAVEY JW， et al.， 2013. Genotyping-by-sequencing in ecological and conservation genomics ［J］. Mol Ecol， 22： 2841-2847.

NGUYEN LT， SCHMIDT HA， von Haeseler A， et al.， 2015. IQ-TREE： A fast and effective stochastic algorithm for estimating maximum-likelihood phylogenies ［J］. MoL Biol Evol， 32（1）： 268–274.

PFEIFER B， WITTELSBRGER U， RAMOS-ONSINS SE， et al.， 2014. PopGenome： an efficient Swiss army knife for population genomic analyses in R ［J］. Mol Biol Evol， 31（7）： 1929-1936.

SITU SJ， 1987. Historical land development research in Hainan Island［M］. Haikou： Hainan Peoples Publishing House： 9-19. ［司徒尚紀(jì)， 1987.海南島歷史上土地開發(fā)研究 ［M］. 海口： 海南人民出版社： 9-19.］

SUPPLE MA， SHAPIRO B， 2018. Conservation of biodiversity in the genomics era ［J］. Genome Biol， 19： 131.

SUN WY， SHU JP， GU YF， et al.， 2022. Conservation genomics analysis revealed the endangered mechanism of Adiantum nelumboides ［J］. Biodivers Sci， 30（7）： 21508.［孫維悅， 舒江平， 顧鈺峰， 等， 2022. 基于保護(hù)基因組學(xué)揭示荷葉鐵線蕨的瀕危機(jī)制 ［J］. 生物多樣性， 30（7）： 21508.］

TINGLEY R， VALLINOTO M， SEQUEIRA F， et al.， 2014. Realized niche shift during a global biological invasion ［J］. PNAS， 111： 10233-10238.

WANG JF， L DR， HUANG S， et al.， 2017. The resource status and investigation analysis of endangered aquatic plants in Hainan Province［J］. Chin Hortic Abstr， 33（12）： 67-69. ［王景飛， 呂德任， 黃賽， 等， 2017. 海南省瀕危水生植物水角的資源現(xiàn)狀及調(diào)查分析 ［J］. 中國園藝文摘， 33（12）： 67-69.］

WANG XL， LIU Q， YU DL， et al.， 2016. Diversity of epiphytic orchids in fragmental limestone forests in Xishuangbanna， China ［J］. Guihaia， 36（2）： 162-169.［王喜龍， 劉強(qiáng)， 余東莉， 等， 2016. 西雙版納片段化石灰?guī)r森林附生蘭科植物多樣性研究 ［J］. 廣西植物， 36（2）： 162-169.］

WILCOVE DS， MCLELLAN CH， 1986. Habitat fragmentation in the temperate zone ［J］. Conserv Biol， 6： 237-256.

WILCOVE DS， ROTHSTEIN D， DUBOW J， et al.， 1998. Quantifying threats to imperiled species in the United States ［J］. Biol Sci， 48（8）： 607-615.

WRIGHT S， 1978. Evolution and the genetics of populations， Vol. 4： Variability within and among Natural Population ［M］. Chicago： University of Chicago Press.

WU J， LIU ZM， 2014. Effect of habitat fragmentation on biodiversity： A review ［J］. Chin J Ecol， 33（7）： 1946-1952.［武晶， 劉志民， 2014. 生境破碎化對生物多樣性的影響研究綜述 ［J］. 生態(tài)學(xué)雜志， 33（7）： 1946-1952.］

WU QQ， LIANG ZS， LIU JJ， et al.， 2017. Effects of habitat fragmentation on biodiversity in China ［J］. Chin J Ecol， 36（9）： 2605-2614.［吳倩倩， 梁宗鎖， 劉佳佳， 等， 2017. 中國生境片段化對生物多樣性影響研究進(jìn)展 ［J］. 生態(tài)學(xué)雜志， 36（9）： 2605-2614.］

YAN JA， 2006. Paleontology and ecologic environmental evolution of the Quaternary in Hainan Island ［J］.J Palaeogeogr， 8（1）： 103-115. ［顏家安，2006．海南島第四紀(jì)古生物及生態(tài)環(huán)境演變 ［J］. 古地理學(xué)報，8（1）： 103-115.］

YOUNG A， BOYLE T， BROWN T， 1996. The population genetic consequences of habitat fragmentation for plants ［J］. Trend Ecol Evol， 11（10）： 413-418.

ZHONG YF， HU XY， SONG XQ， et al.， 2014. ISSR analysis on population genetic diversity of Impatiens hainanensis （Balsaminaceae）， an endemic species to Hainan Island ［J］. Chin J Trop Crops， 35（6）： 1041-1046.［鐘云芳， 胡翔宇， 宋希強(qiáng)， 等， 2014. 基于ISSR分子標(biāo)記的海南鳳仙花種群遺傳多樣性 ［J］. 熱帶作物學(xué)報， 35（6）： 1041-1046.］

ZHOU JY， GUAN SK， SONG Q， et al.， 2020. Retrotransposon-based genetic variation and population structure of Impatiens macrovexilla Y. L. Chen in natural habitats and the implications for breeding ［J］. Sci Hortic， 276： 109753.

ZHU H， XU ZF， WANG H， et al.， 2001. Over 30-year changes of floristic composition and population structure from an Isolated fragment of tropical rain forest in Xishuangbanna ［J］. Acta Bot Yunnan， 23（4）： 415-427.［朱華， 許再富， 王洪， 等， 2001. 西雙版納片斷熱帶雨林30多年來植物種類組成及種群結(jié)構(gòu)的變化 ［J］. 云南植物研究， 23（4）： 415-427.］