孫藝學(xué),于海英,張鵬舉,叢彥龍*

(1.長春大學(xué) 吉林省生物醫(yī)學(xué)工程研發(fā)中心,吉林 長春 130022;2.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130062;3.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物生物技術(shù)研究所,吉林 長春130033)

自20世紀(jì)90年代以來,H9N2亞型禽流感逐漸發(fā)展成為我國的一種地方性傳染病,其不僅宿主感染譜廣泛,而且具有感染率高、隱蔽性強(qiáng)和分布廣泛等特點(diǎn)。H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的致病力雖然不及高致病性AIV,但其危害持久,給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。自2007年以來,G57基因型H9N2 AIV異軍突起,其分離率逐漸增加,在禽群中的流行優(yōu)勢(shì)日益凸顯,并最終成為了具有絕對(duì)流行優(yōu)勢(shì)的基因型病毒[3]。我國自1998年開始實(shí)施H9N2禽流感疫苗的免疫接種計(jì)劃,疫苗的使用起到了一定的防控作用。然而,關(guān)于G57基因型AIV免疫逃逸的原因尚未得到充分的科學(xué)評(píng)估。

作為逃逸免疫壓力的一種重要進(jìn)化手段,甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)的主要保護(hù)性抗原——血凝素(HA)在進(jìn)化過程中獲得了糖基化修飾的能力[4]。糖基化修飾出現(xiàn)在HA胞外域的莖區(qū)和球狀頭部的N-糖基化位點(diǎn)(N-linked glycosylation site,NGS)。其中,莖區(qū)糖鏈主要負(fù)責(zé)HA分子的正確折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、定位和構(gòu)象穩(wěn)定[5],而頭部糖鏈會(huì)影響抗體與HA抗原表位的結(jié)合,從而產(chǎn)生免疫逃逸株[6-7]。本研究以HA糖基化模式所呈現(xiàn)的多態(tài)性作為研究對(duì)象,探討了HA糖基化模式對(duì)G57基因型H9N2 AIV抗原性的影響,以期為揭示H9N2 AIV免疫逃逸的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑293T細(xì)胞(ATCC?CRL-11268)、MDCK細(xì)胞(ATCC?CCL34)、pHW2000載體由本實(shí)驗(yàn)室保存;Tripure Isolation Reagent購自Roche公司;M-MLV Reverse Transcriptase、La Taq DNA Polymerase、DNA Marker購自TaKaRa公司;T4DNA連接酶購自Promega公司;DMEM High Glucose購自Gibco公司;Fetal Bovine Serum(FBS)購自BI公司;InvitrogenTMLipofectamine 3000、TPCK-Treated胰蛋白酶購自Sigma公司。

1.2 病毒拯救以G57基因型H9N2 AIV的HA基因(GISAID號(hào):EPIISL 330737)為基礎(chǔ),利用定點(diǎn)突變技術(shù)構(gòu)建5種具有不同糖基化模式的HA基因。將HA基因與pHW2000連接后,通過反向遺傳技術(shù)[8]拯救具有不同HA糖基化模式的AIV。提取病毒RNA,RT-PCR擴(kuò)增HA基因后,送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 抗血清的制備對(duì)3周齡SPF白來航雞(北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)免疫0.5 mL 0.1%多聚甲醛滅活的AIV,每種HA糖基化模式AIV各免疫3只雞。免疫后21 d,將收集的血清于56℃滅活30 min后,-20℃保存?zhèn)溆?。本試?yàn)在吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心開展(SYXK(吉)2016-0001),遵守吉林大學(xué)及國家對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理福利的要求,飼養(yǎng)條件嚴(yán)格依照GB14925進(jìn)行。

1.4 交叉血凝抑制試驗(yàn)在96孔血凝板中,利用血凝抑制(HI)試驗(yàn)測(cè)定一種HA糖基化模式AIV的抗血清完全抑制另一種HA糖基化模式AIV凝集紅細(xì)胞時(shí)的血清HI滴度。將血清進(jìn)行連續(xù)2倍倍比稀釋,然后加入50 μL配制好的含有8個(gè)血凝單位的病毒液。37℃孵育30 min后,加入50 μL的1%雞紅細(xì)胞,冰上孵育并記錄血清的HI滴度。

1.5 抗原圖譜的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行抗原圖譜的構(gòu)建。交叉HI試驗(yàn)數(shù)據(jù)集包括針對(duì)5種不同HA糖基化模式AIV的抗血清。結(jié)果以15×5的矩陣表示,其中每行描述了針對(duì)每種抗血清的5種AIV之間的HI滴度差異。將15×5數(shù)據(jù)集標(biāo)準(zhǔn)化,即針對(duì)15種抗血清的每種病毒的平均值為0,SD為1。通過公式計(jì)算變量之間的距離,并得到一個(gè)對(duì)稱的5×5距離矩陣。從獲得的對(duì)稱5×5距離矩陣中,通過提取這些毒株的3×3距離子矩陣并求解距離方程來比較任意3個(gè)毒株之間的距離,從而得到每個(gè)毒株的x、y坐標(biāo),以繪制抗原圖譜。

2 結(jié)果

2.1 G57基因型H9N2 AIV流行優(yōu)勢(shì)分析從GenBank和GISAID數(shù)據(jù)庫中下載分離自我國的H9N2 AIV的HA基因序列(n=6 167),利用最大似然法構(gòu)建HA的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,然后對(duì)不同分支或基因型內(nèi)的毒株數(shù)量和流行時(shí)間跨度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。由表1可知,在我國禽群中極少出現(xiàn)以Ty66分支為代表的北美譜系A(chǔ)IV,主要流行的是以Y439、G1、BJ94分支為代表的歐亞譜系。但是,Y439和G1分支的毒株數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于BJ94分支,表明不同分支AIV的適應(yīng)性不同,BJ94分支是目前的優(yōu)勢(shì)流行分支。對(duì)BJ94分支的基因型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),不同基因型AIV的流行能力存在明顯差異。在2007年以后,BJ94分支中的G57基因型迅速取代了其他基因型,成為具有明顯流行優(yōu)勢(shì)的基因型,其毒株數(shù)量占據(jù)了自1976年以來我國H9N2 AIV毒株總數(shù)的85.47%(5 271/6 167)。

表1 我國H9N2 AIV的流行優(yōu)勢(shì)分析

2.2 G57基因型H9N2 AIV HA糖基化模式與流行優(yōu)勢(shì)分析通過進(jìn)一步分析G57基因型AIV HA基因(n=5 271)的NGS,探究G57基因型AIV的流行優(yōu)勢(shì)與其蛋白表型的關(guān)系。序列分析顯示,于2007年分離的首株G57基因型AIV含有7個(gè)NGS,在2010年以后又陸續(xù)出現(xiàn)了含有6～3個(gè)NGS的毒株(表2)。在這些NGS中,第128,296,483位NGS(H3計(jì)數(shù))嚴(yán)格保守。值得關(guān)注的是,這5種糖基化模式AIV的流行能力存在明顯差異,其中含有6個(gè)NGS的AIV是G57基因型AIV中具有絕對(duì)流行優(yōu)勢(shì)的糖基化表型。

表2 G57基因型H9N2 AIV HA基因的糖基化模式與流行優(yōu)勢(shì)分析

2.3 不同HA糖基化模式AIV的拯救與鑒定利用病毒反向遺傳技術(shù)拯救具有不同HA糖基化模式的AIV。待病毒接種于9～10日齡SPF雞胚3 d后收集尿囊液,以1%雞紅細(xì)胞測(cè)定其血凝滴度。如圖1可知,拯救的5種糖基化模式AIV均具有血凝活性。提取病毒的RNA,經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后進(jìn)行基因測(cè)序,結(jié)果顯示所有HA突變位點(diǎn)均與預(yù)期相符(圖2)。將拯救出的5株AIV分別命名為reHA7、reHA6、reHA5、reHA4、reHA3。

圖1 不同HA糖基化模式AIV的血凝結(jié)果

2.4 HA糖基化模式影響G57基因型H9N2 AIV的抗原性利用自制的雞多抗血清與不同HA糖基化模式毒株進(jìn)行交叉HI反應(yīng),分析了HA的糖基化模式差異對(duì)AIV抗原性的影響。由表3可知,總體上,各血清均與其自身病毒的反應(yīng)性最佳(HI滴度最高),而在與其他HA糖基化模式AIV進(jìn)行交叉反應(yīng)時(shí)的HI滴度要低2 log2±1 log2。根據(jù)交叉HI結(jié)果,計(jì)算了各AIV之間的抗原距離。由表4可知,reHA7與reHA6、reHA5、reHA3、reHA4之間的抗原距離逐漸增大?；诳乖嚯x結(jié)果,繪制了相應(yīng)的抗原圖譜(圖3),該圖譜可以在二維平面圖上更加直觀地反映不同HA糖基化模式AIV之間的抗原距離。

圖2 HA定點(diǎn)突變測(cè)序結(jié)果

表3 不同HA糖基化模式AIV的交叉HI試驗(yàn)結(jié)果(log2)

表4 不同HA糖基化模式AIV之間的抗原距離矩陣

2.5 H9N2疫苗株的NGS分析將從GenBank或GISAID數(shù)據(jù)庫中下載的H9N2禽流感疫苗株的HA基因序列保存為FASTA格式,利用BioEdit軟件進(jìn)行序列比對(duì),分析毒株HA的潛在NGS。如表5所示,在已知的11株H9N2疫苗株中,除了A/chicken/Shandong/S2/2005、A/chicken/Guangxi/55/2005的HA糖基化模式與G57基因型AIV中的P7模式相同,A/chicken/Jiangsu/WJ57/2012、A/chicken/Anhui/LH99/2017的HA糖基化模式與P6模式相同以外,其他疫苗株的糖基化模式與該基因型AIV的糖基化模式均不相同。

圖3 不同HA糖基化模式AIV的抗原圖譜

3 討論

流感疫苗的效力取決于流感病毒在保持適應(yīng)性的同時(shí)逃避預(yù)存免疫的能力[10]。盡管評(píng)估商業(yè)化H9N2疫苗效力的田間數(shù)據(jù)有限,但是有研究顯示,即使在接種了疫苗的地區(qū),H9N2 AIV仍然作為地方性疾病持續(xù)存在[11]。利用現(xiàn)有H9N2疫苗制備的抗血清對(duì)近來分離的雞源H9N2 AIV分離株的中和作用減弱,病毒在免疫雞體內(nèi)的復(fù)制水平增加,暗示目前流行的H9N2 AIV存在抗原漂移現(xiàn)象,具有免疫逃逸的能力[12]。

表5 H9N2疫苗株HA基因的糖基化模式

HA的糖基化修飾變化是IAV逃逸抗體免疫壓力的一種重要手段[13]。然而,IAV糖基化修飾的前提是需要在免疫逃逸和受體親和性之間尋求一種最佳的功能平衡狀態(tài),才有利于病毒的傳播與疾病的流行[14]。在IAV的進(jìn)化過程中,HA的NGS數(shù)量有逐漸增加的趨勢(shì),這種變化被認(rèn)為是病毒進(jìn)化的一種選擇優(yōu)勢(shì)。但是,HA的糖基化修飾也必須考慮由此帶來的適應(yīng)性成本,并不會(huì)不加節(jié)制地發(fā)生。當(dāng)HA糖基化達(dá)到臨界水平時(shí),IAV會(huì)對(duì)自身的糖基化程度設(shè)置一個(gè)適宜的阻力,并且通過轉(zhuǎn)換NGS的位置,不斷調(diào)節(jié)自身的功能平衡狀態(tài),從而保持病毒的適應(yīng)性[15]。研究結(jié)果顯示,2007年G57基因型H9N2 AIV首次出現(xiàn)時(shí)具有7個(gè)潛在的NGS,糖基化水平隨后也發(fā)生了變化,最終確立6個(gè)NGS是最有利于該病毒流行的模式。通過探討NGS數(shù)量的變化對(duì)G57基因型H9N2 AIV抗原性的影響,從而揭示HA糖基化修飾的潛在生物學(xué)效應(yīng),為今后創(chuàng)建以糖基化修飾為靶點(diǎn)的新型流感疫苗奠定基礎(chǔ)。

本研究基于G57基因型H9N2 AIV HA基因的糖基化模式差異,利用反向遺傳技術(shù)拯救了5株具有不同HA糖基化模式的AIV,探究了HA糖基化模式差異對(duì)G57基因型AIV抗原性的影響。基于交叉HI試驗(yàn)繪制的抗原圖譜顯示,不同HA糖基化模式的G57基因型H9N2 AIV的抗原性存在差異。這種差異與HA上的第21,210,289,304位NGS直接相關(guān),對(duì)AIV抗原性的影響程度由大到小依次是304,210,289,21位。盡管有研究表明,IAV的抗原漂移主要是由HA球狀頭部新出現(xiàn)的糖鏈所致[10],但本研究發(fā)現(xiàn),位于HA莖區(qū)的糖鏈同樣可以影響AIV的抗原性?？傊?位于HA不同區(qū)域的糖鏈均可能影響AIV周圍的抗原表位的暴露程度,進(jìn)而影響抗體與HA的結(jié)合程度,致使具有不同HA糖基化模式的AIV的抗原性出現(xiàn)差異。由此暗示,疫苗株與流行株的HA糖基化模式應(yīng)該保持一致。

對(duì)H9N2疫苗株的糖基化模式的分析結(jié)果顯示,各有2株疫苗株與G57基因型AIV的糖基化模式P7和P6相同。相比于其他糖基化模式不匹配的疫苗株,這些與G57基因型AIV糖基化模式相同的疫苗株的使用應(yīng)該具有更好的免疫保護(hù)效果。然而,由于不同的疫苗廠家使用的疫苗株存在差異,以及疫苗的推廣使用地區(qū)不同等因素,導(dǎo)致目前G57基因型H9N2 AIV在我國的流行形式仍然沒有得到完全控制。此外,需要強(qiáng)調(diào)的是,用雞胚或不同的細(xì)胞進(jìn)行病毒擴(kuò)繁時(shí),由于宿主細(xì)胞的翻譯機(jī)制不同,可能導(dǎo)致IAV的糖基化程度以及糖鏈的類型發(fā)生改變,這同樣會(huì)使疫苗種毒發(fā)生抗原漂移,影響免疫保護(hù)性。由此提示我們,在繁育疫苗株后,需要對(duì)毒株的糖基化進(jìn)行鑒定?？傊?有效認(rèn)識(shí)IAV位點(diǎn)特異性的糖基化,包括識(shí)別每個(gè)位點(diǎn)上存在的糖鏈類型,有助于更加準(zhǔn)確地辨析HA糖基化與病毒抗原距離之間的關(guān)系,對(duì)預(yù)測(cè)特定毒株的免疫逃逸能力以及疫苗的設(shè)計(jì)都大有裨益。盡管本研究初步探究了HA糖基化模式對(duì)G57基因型AIV抗原性的影響,但不同HA糖基化模式AIV的出現(xiàn),是否伴隨著其他位點(diǎn)變異而出現(xiàn)的“代償效應(yīng)”,這些效應(yīng)對(duì)HA的受體親和性和抗原性等生物學(xué)特性,以及病毒的適應(yīng)性進(jìn)化產(chǎn)生了哪些影響,有待進(jìn)一步深入探討。