袁盛林,湯德元,陳閶崢,羅 柳,陳 旭,廖正波

(貴州大學 動物科學學院, 貴州 貴陽 550025)

日本腦炎(JE)是由蚊媒傳播的日本腦炎病毒(JEV)引起的,為單股正鏈RNA病毒,屬于黃病毒科黃病毒屬人畜共患病病原[1-2]。是亞洲病毒性腦炎的主要原因,其RNA基因組約有11 kb,編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白:衣殼蛋白(C)、膜蛋白(pr M/M)和包膜蛋白(E),以及7種非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白:NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5,它們被翻譯為前體多蛋白[3]。JE是人類最常見的地方性腦炎之一,在動物中也時常發(fā)生,尤其是在整個南亞地區(qū)、東南亞地區(qū)、俄羅斯東部地區(qū)、澳大利亞的一些地區(qū)、西太平洋島嶼(塞班島)和巴布亞新幾內(nèi)亞[4]。嚴重乙腦的臨床特征是高燒、頭痛、頸部肌肉僵硬、定向障礙、癲癇、癱瘓、昏迷,最終死亡。任何年齡的人群均能感染JE,但兒童更易感[5-6]。目前認為對于JE最有效的方法是免疫預防,現(xiàn)在有4種類型的JEV疫苗已被批準用于大規(guī)模免疫:分別是減毒活疫苗SA14-14-2、滅活小鼠腦源性疫苗、滅活Vero細胞培養(yǎng)疫苗和減毒嵌合疫苗[7]。盡管這些疫苗非常有效,但乙腦病例的發(fā)病率仍在增加[8],這表明需要建立治療乙腦感染的新療法。在病毒感染過程中,宿主蛋白和病毒的蛋白相互作用對病毒的吸附、穿入、復制及病毒感染等有著密切的相關(guān)性,了解這些作用對于JEV的防制具有十分重要的作用。本文將近年來有關(guān)JEV蛋白和宿主蛋白之間的相互作用機制進行綜述,為后續(xù)相關(guān)領域研究提供參考。

1 JEV結(jié)構(gòu)蛋白與宿主蛋白的相互作用

1.1 衣殼蛋白C與宿主蛋白的相互作用JEV C蛋白包含100個氨基酸殘基,具有富含螺旋的結(jié)構(gòu),并與其他黃病毒形成相似的穩(wěn)定同源二聚體[9],在黃病毒生物學中起著至關(guān)重要的作用,這種多功能蛋白可能會成為新的抗病毒藥物開發(fā)的目標。在病毒生命周期中,C蛋白亞基組裝形成核衣殼,而病毒核酸是由衣殼包裹。除了這種經(jīng)典的結(jié)構(gòu)作用之外,C蛋白與病毒復制周期中的其他重要功能也密切相關(guān)[10]。宿主對C蛋白的酶活性也可能影響毒力,根據(jù)對JEV的研究,宿主蛋白酶組織蛋白酶L在高度保守的殘基Lys18、Arg19和C蛋白之間相互作用,切割C蛋白才能使病毒正常復制。另外衣殼C蛋白與幾種宿主蛋白相互作用,包括和相關(guān)蛋白6 (DAXX)誘導細胞凋亡,以及與核心組蛋白作用后通過破壞核小體介導轉(zhuǎn)錄[11]。除存在于細胞質(zhì)中外,JEV C蛋白還可被核定位序列引導轉(zhuǎn)運到細胞核中并指導病毒復制。C蛋白的核定位與核仁磷蛋白B23密切相關(guān),它們相互作用的關(guān)鍵位點是C蛋白的核定位基序。該基序突變導致C蛋白無法與B23結(jié)合,最終C蛋白定位不準確導致病毒復制受到抑制。另外Jab1是COP9信號體(CSN)復合體的第5個亞基,Jab1可通過結(jié)合病毒C蛋白并調(diào)節(jié)C蛋白的降解來參與病毒的復制。JEV C蛋白還通過與Caprin-1蛋白結(jié)合來抑制應激顆粒SG的形成,促進病毒復制和翻譯[12]。

1.2 膜蛋白pr M/M與宿主蛋白的相互作用JEV pr M蛋白主要存在于不成熟的病毒中,是M蛋白的前體蛋白。研究表明pr M/M和E蛋白在黃病毒的進入、組裝和分泌中發(fā)揮重要作用[13],并且pr M蛋白可能與E蛋白的裝配、折疊以及定位等有關(guān)。病毒中的pr M/M蛋白保守區(qū)域主要參與病毒顆粒的組裝和分泌,DE WISPELAERE等[14]研究發(fā)現(xiàn)該區(qū)域被取代后會導致病毒的分泌減少。病毒在感染宿主時pr M蛋白會被細胞的furin蛋白酶切割成非糖基化的M蛋白和糖基化的pr蛋白肽,M蛋白僅與pr M的C末端有關(guān),參與病毒感染過程。被furin蛋白酶切割的pr M會產(chǎn)生感染性顆粒,含有未切割pr M的未成熟顆粒不能進行膜融合并釋放到細胞外環(huán)境。但是furin蛋白酶介導的pr M蛋白裂解通常是不完全的,可以檢測到未成熟、部分成熟和成熟的細胞外顆粒的混合物,平衡的分解會影響病毒的復制或毒力[15]。目前為止對于pr M/M蛋白與宿主蛋白相互作用的了解僅有被furin蛋白酶切割,要了解得更深入尚需進一步研究。

1.3 E蛋白與宿主蛋白的相互作用JEV是通過內(nèi)吞作用進入宿主細胞,所以病毒粒子的表面包膜(E)蛋白在介導病毒包膜與內(nèi)體膜在低pH值下融合的過程中起核心作用[16]。研究表明E蛋白與黃病毒進入、組裝和釋放密切相關(guān)。硫酸乙酰肝素、非整聯(lián)蛋白 DC-SIGN(CD209)和非整聯(lián)蛋白 L-SIGN(CD209L)作為病毒黏附因子,可以通過與病毒E蛋白相互作用介導病毒的入侵和感染[17]。在進入和釋放宿主細胞期間,E蛋白要經(jīng)歷廣泛的構(gòu)象變化。在JEV中,E蛋白有3個結(jié)構(gòu)域DⅠ、DⅡ和DⅢ,DⅠ和DⅢ之間的保守組氨酸(His323)是關(guān)鍵的pH傳感器,His323的質(zhì)子化能引發(fā)E蛋白的大規(guī)模構(gòu)象重排以及病毒和內(nèi)體膜的融合。包膜E蛋白是一種典型的Ⅱ類膜融合蛋白,與M蛋白一起通過跨膜螺旋錨定到脂質(zhì)雙層包膜上形成病毒顆粒的外殼,通過其構(gòu)象的重排融合病毒和內(nèi)體膜從而形成一組蛋白質(zhì)三聚體,其中融合肽(FP)與內(nèi)體膜相互作用引發(fā)融合[18]。已經(jīng)有研究表明,E蛋白與JEV等黃病毒的毒力密切相關(guān),當JEV中的E蛋白發(fā)生突變會減弱病毒毒力。在BHK細胞中,JEV E蛋白被證實可與糖胺聚糖相互作用,而糖胺聚糖與蛋白的結(jié)合可促進病毒吸附和感染。另外葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78 (GRP78)是已被確定為與哺乳動物細胞中JEV E蛋白DⅢ區(qū)域(ED3)相互作用的宿主蛋白,在病毒感染細胞后兩者相互作用共同調(diào)節(jié)病毒復制,還參與其向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運,但確切的機制尚不清楚[19]。另外DAS等[20]用生物信息學軟件預測E蛋白的RGD區(qū)與Neuro2A 細胞上熱激蛋白Hsp70的539位的亮氨酸可形成穩(wěn)定的相互作用狀態(tài),表明Hsp70可以作為Neuro2A細胞上JEV的受體,由此可見E蛋白與宿主蛋白相互作用在病毒感染過程中扮演了重要角色。

2 JEV非結(jié)構(gòu)蛋白與宿主蛋白的相互作用

2.1 NS1蛋白與宿主蛋白的相互作用JEV NS1蛋白是病毒復制中的關(guān)鍵蛋白,NS1作為單體或膜結(jié)合蛋白位于細胞膜中,在細胞質(zhì)中或作為六聚體(分泌蛋白)位于細胞外。細胞內(nèi)NS1是病毒復制中的關(guān)鍵保守蛋白,是合成正鏈和負鏈病毒RNA以及形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)復制復合體所必需的,在誘導宿主免疫應答中也具有重要作用。病毒復制過程中與多種宿主分子相互作用,從而幫助病毒復制、翻譯和病毒粒子增殖等[21- 22]。WANG等[23]研究表明,在JEV感染時NS1主要與波形蛋白、異質(zhì)核核糖核蛋白K(hnRNP K)相互作用后促進病毒復制,并且NS1與細胞波形蛋白和hnRNP K共定位,在病毒生命周期中有重要的作用。NS1發(fā)生核糖體-1移碼時會產(chǎn)生NS1′,對病毒增殖也有重要作用。HAX1蛋白即造血和淋巴細胞限制性細胞內(nèi)蛋白HS1相關(guān)蛋白X1,是一種具有多種功能泛素化表達的蛋白。其功能與細胞生存力,細胞遷移和控制癌癥進展有關(guān),病毒感染時NS1可與HAX1的203～279aa區(qū)域發(fā)生互作,在病毒的生命過程中發(fā)揮作用,但具體的作用機制還有待進一步研究[24]。

2.2 NS2A蛋白與宿主蛋白的相互作用JEV NS2A為疏水跨膜蛋白,主要參與JEV復制,還與病毒組裝密切相關(guān)[25]。NS2A 166位氨基酸對JEV的體外增殖和組織嗜性有重要作用[26]。三基序(TRIM)蛋白通過其E3連接酶活性直接降解病毒蛋白或通過促進宿主先天免疫間接發(fā)揮其抗病毒活性,參與各種細胞過程并在宿主抗病毒功能中發(fā)揮重要作用。TRIM52是一種新型抵抗JEV感染的TRIM蛋白。FAN等[27]研究表明TRIM52可通過與JEV NS2A 直接的物理相互作用并誘導NS2A泛素化,通過蛋白酶途徑導致NS2A降解從而抑制病毒增殖。目前和NS2A相互主要的宿主蛋白研究較少,但TRIM52和NS2A相互作用能抑制病毒增殖,可見NS2A有可能成為降低JEV感染的新方向。

2.3 NS2B蛋白與宿主蛋白的相互作用JEV NS2B蛋白是一種跨膜蛋白,與翻譯后蛋白質(zhì)加工和病毒組裝密切相關(guān)。NS2B作為NS3蛋白功能的輔助因子,通過促進蛋白酶活性來加工基因組編碼的多蛋白,可與自身和包括NS2A、NS4A、NS4B、NS3蛋白,以及和其他膜蛋白相互作用[28]。信號肽酶復合物亞基1 (SPCS 1)是微粒體信號肽酶復合物的一個組成部分,負責切割許多分泌蛋白和膜相關(guān)蛋白的信號肽,對翻譯后蛋白質(zhì)加工和病毒組裝十分重要,之前有報道SPCS 1對于JEV的復制是必不可少的[29]。MA等[30]首次證明宿主因子SPCS 1與JEV NS2B蛋白的兩個跨膜結(jié)構(gòu)域NS2B(1～49)和NS2B(84～131)相互作用影響病毒復制。參與黃病毒的病毒粒子組裝出芽和釋放到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)腔,從而影響JEV蛋白的翻譯后加工和病毒粒子的組裝。但病毒組裝過程的細節(jié)復雜,要完全了解還需要更多的研究。

2.4 NS3蛋白與宿主蛋白的相互作用JEV的非結(jié)構(gòu)蛋白3 (NS3) 是一種具有619個氨基酸殘基的多功能蛋白,在病毒前體多蛋白的加工和病毒基因組RNA的復制中起重要作用。在JEV感染的細胞中NS3與微管和腫瘤易感基因101蛋白相關(guān),在病毒RNA包裝、病毒成分的細胞內(nèi)運輸和病毒組裝中起重要作用[31]。 NS3蛋白與核受體結(jié)合蛋白(NRBP)特異性作用,在核內(nèi)共定位并影響病毒復制。白細胞介素增強子結(jié)合因子2 (ILF2)是一種組成型表達并定位于細胞核的染色質(zhì)相互作用蛋白。ILF2與白細胞介素增強子結(jié)合因子3 (ILF3)形成穩(wěn)定的異二聚體,并在細胞核中T細胞活化期間調(diào)節(jié)IL-2基因的轉(zhuǎn)錄,ILF2和ILF2/ILF3復合體是參與microRNA生物合成、RNA轉(zhuǎn)錄、剪接、mRNA翻譯、DNA斷裂修復、細胞增殖和凋亡的重要調(diào)節(jié)因子[32-36]。ILF2也是一種重要的參與病毒復制過程的宿主細胞蛋白[37-38]。CUI等[39]研究表明在JEV感染過程中,NS3蛋白與ILF2相互作用,并且這種相互作用不是由DNA或者RNA介導的,共同參與JEV生命周期并抑制JEV復制。另外JEV NS3是一種多功能蛋白,也能與JEV NS2B和NS4A相互作用,起解旋酶、蛋白酶和核苷三磷酸酶的作用,與NS5和dsRNA一起形成病毒復制酶復合物,并在病毒復制和病毒組裝中發(fā)揮重要作用[40-42]。

2.5 NS4A蛋白與宿主蛋白的相互作用JEV NS4A蛋白是一種高度疏水的16 kDa跨膜蛋白,在病毒復制中起著至關(guān)重要的作用,其與病毒復制復合物定位有關(guān),可誘導宿主膜改變[43]。NS4A和細胞波形蛋白中間絲之間的相互作用促進復制復合物(RC)的形成。NS4A也可與兩種定位在線粒體中的宿主蛋白相互作用,其中一種蛋白質(zhì)是PTEN誘導的激酶1(PINK 1),另一種是以其在線粒體自噬中的作用而聞名的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。病毒感染會導致PINK 1表達下調(diào),有絲分裂吞噬通量增加同時線粒體質(zhì)量下降,干擾JEV誘導的線粒體片段化和有絲分裂限制病毒繁殖[44]。病毒感染哺乳動物細胞期間,JEV非結(jié)構(gòu)蛋白NS4A在線粒體動力學中發(fā)揮重要作用。JEV NS4A和PINK 1相互作用可能在JE相關(guān)的神經(jīng)病理學中發(fā)揮重要作用,然而這種相互作用對乙腦疾病表現(xiàn)的確切影響需要進一步的研究來闡明。

2.6 NS4B蛋白與宿主蛋白的相互作用JEV NS4B是一種小的完整膜蛋白(約27 kDa),ER應激傳感器蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)在急性或長期ER應激下誘導細胞凋亡,主要與PERK發(fā)生互作。NS4B具有的基序包括LIG-SH2(氨基酸(aa)64～67)、LIG-FHA(aa 162～168和aa 192～198)、LIG-WD40(aa 7～12、aa 31～36、aa 197～216和aa 249～253),可分別結(jié)合PERK內(nèi)的SH2結(jié)構(gòu)域、FHA結(jié)構(gòu)域和WW結(jié)構(gòu)域。且NS4B中的LIG-FHA和LIG-WD40結(jié)構(gòu)域都需要誘導PERK二聚化,說明JEV NS4B是通過不同的基序同時與它們相互作用將兩個PERK分子拉到一起,PERK失活可減少JEV感染期間的腦細胞損傷和腦炎。此外,在小鼠Neuro-2a細胞中JEV NS4B的表達會使PERK誘導腦炎,表明JEV主要通過其NS4B激活PERK引起腦炎[45]?？梢妼τ贘EV引起的腦炎可通過誘導PERK失活從而得到緩解,這將有可能成為治療JEV引起腦炎的一種新型治療方法。

2.7 NS5蛋白與宿主蛋白的相互作用在非結(jié)構(gòu)蛋白中,黃病毒的NS5在先天免疫逃避中起關(guān)鍵作用。NS5是最大的黃病毒蛋白,含有N端甲基轉(zhuǎn)移酶(MTase)和C端聚合酶RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp),分子內(nèi)NS5具有完整的MTase和RdRp界面,由兩部分組成:六殘基疏水網(wǎng)絡和GTR接頭[46]。MTase-RdRp界面和GTR接頭區(qū)域是RdRp延伸、起始和黃病毒復制所必需的[47]。PRYOR等[48]研究表明輸入蛋白α/β(importin α/β)與NS5在核內(nèi)共定位影響病毒的復制。另外NS5和末端順式作用RNA之間的合作控制線性和環(huán)狀基因組構(gòu)象的平衡,并允許有效的病毒復制[49-51]。WANG等[52]通過酵母雙雜交法篩選小鼠腦cDNA文庫,發(fā)現(xiàn)JEV NS5蛋白可與HSP40的同源蛋白Hdj2相互作用,對病毒復制起到積極的調(diào)控作用。KAO等[53]研究表明JEV NS5與羥酰基輔酶A脫氫酶α(HADHα)和羥?；o酶A脫氫酶β(HADHβ)相互作用,HADHα和HADHβ是參與LCFA β氧化的酶復合物MTP的兩個亞基。這種相互作用損害了LCFAβ氧化,增加了細胞因子的產(chǎn)生,并促進JEV的發(fā)病機制。NS5的M19殘基參與其與MTP的相互作用,與野生型JEV相比,具有NS5-M19A突變的重組JEV更不能阻斷LCFAβ氧化,誘導更低水平的細胞因子產(chǎn)生,并表現(xiàn)出更低的神經(jīng)毒性和神經(jīng)侵襲性。

3 小結(jié)與展望

JE在全球的廣泛傳播已經(jīng)對世界各國的畜牧業(yè)和人類健康造成了嚴重的危害。同時,由于其致病機制十分復雜,具有持續(xù)性感染的典型特征,使其防治極其困難。研究表明,JEV蛋白與宿主細胞蛋白相互作用,對病毒入侵、復制、膠質(zhì)細胞增殖、神經(jīng)元凋亡、炎性反應、IFN抵抗與誘導宿主保護性免疫等均有重要影響。因此,分析JEV與宿主蛋白的相互作用不僅對其致病機制的研究至關(guān)重要,而且為新型抗病毒藥物和新型疫苗的研究提供了新的思路。病毒蛋白與宿主細胞蛋白之間的相互作用是介導病毒進入細胞內(nèi)引起動物機體感染的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)作為生命活動的主要承擔者,各種復雜的生命活動都離不開蛋白質(zhì)的參與,但人體的大部分生命活動不能僅僅依靠單一的蛋白質(zhì)調(diào)節(jié),必須依靠蛋白質(zhì)之間的相互作用才能維持機體正常的生命活動,因此研究蛋白質(zhì)之間的相互作用就顯得尤為重要。對于一些研究背景不明確的蛋白質(zhì),可以研究其相互作用蛋白的功能及其對生物體的影響,分析靶蛋白的相關(guān)作用,為未知蛋白質(zhì)的研究提供思路。目前,雖然國內(nèi)外學者對JEV的研究取得了一定進展,但由于病毒與宿主細胞相互作用的復雜性,對其具體致病機制的了解仍然有限。與同屬病毒相比,仍有巨大的研究空間。本文從蛋白相互作用的角度出發(fā),綜述了與JEV蛋白相互作用的宿主蛋白以及病毒感染宿主的致病機制,可為JE病的診斷、防制提供一定的參考。