桂福星,仲崇華,黃 歡,楊萍瑞,林育霖,黃 月,李依然,柳 碩,畢師誠,4,曹立亭,4*

(1.西南大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院,重慶 榮昌402460;2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南 昆明650201;3.西南大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,重慶 榮昌402460;4.西南大學(xué) 中獸醫(yī)藥研究所,重慶 榮昌402460)

來航雞原產(chǎn)于意大利,是世界分布甚廣的著名蛋用型標(biāo)準(zhǔn)品種,其性成熟早、產(chǎn)蛋量高、飼料消耗少,是優(yōu)質(zhì)種公雞之一。繁殖性能是家禽業(yè)最重要的經(jīng)濟(jì)特征之一,精液品質(zhì)是家禽業(yè)發(fā)展的重要保證,公雞精液品質(zhì)下降對孵蛋產(chǎn)生較大的負(fù)面影響,給雞養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。研究證實(shí),微量元素硒、維生素、植物油、植物化合物和氨基酸及其衍生物等生物活性物質(zhì)可提高種公雞精液品質(zhì)[1-2]。中草藥具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)、作用溫和等特點(diǎn),同時含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、揮發(fā)油、生物堿、多糖等物質(zhì)[3],對減緩動物應(yīng)激、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌與生殖機(jī)能有顯著作用[4-5],譚千洪等[6]研究表明,中藥復(fù)方添加劑能顯著改善冷凍前后種公雞的精液品質(zhì)。JIANG等[7]研究也表明,中草藥可改善精子活力和質(zhì)量,增加精子數(shù)量并恢復(fù)正常激素水平,從而增加生育能力。根據(jù)中獸醫(yī)基礎(chǔ)理論及辨證論治法則,動物精液品質(zhì)的下降,應(yīng)屬于腎陽虧虛、腎精不足,治宜補(bǔ)腎益精、益氣補(bǔ)血[8]。本研究選取金元四大家之一的朱丹溪編著的《丹溪心法》中記載的“五子衍宗丸”為基礎(chǔ)方進(jìn)行加減化裁組方,探究其通過日糧添加對來航公雞精液品質(zhì)的影響,以期為中獸醫(yī)藥在提高公雞精液品質(zhì)的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物所用中藥材均購自重慶市榮昌區(qū)步美松大藥房。試驗(yàn)中藥干燥后粉碎,過120目篩,按不同復(fù)方配伍混勻裝袋密封,置于干燥處貯藏備用。

中藥復(fù)方Ⅰ:五味子135 g,車前子135 g,覆盆子135 g,當(dāng)歸67 g,鎖陽67 g,白術(shù)67 g,肉桂34 g。

中藥復(fù)方Ⅱ:五味子116 g,枸杞子116 g,覆盆子116 g,肉蓯蓉58 g,鎖陽58 g,黨參58 g,山藥58 g,蘆巴子58 g。

1.2 主要試劑總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒(A015-2-1)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(A001-3-1)、丙二醇(MDA)檢測試劑盒(A003-1-1)、谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒(A006-2-1)均購自南京建成生物工程研究所;RNAiso Plus(9109)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(RR047A)、TB Green?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(RR820A)試劑盒均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物清潔級來航公雞購自重慶市長水禽業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司。本研究經(jīng)過西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理審查委員會審查批準(zhǔn)(倫理審查號:IACUC-20211020-01)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)24只34周齡體況基本一致、健康狀況良好的來航公雞,平均體質(zhì)量為(2.72±0.16) kg,隨機(jī)分為3組,每組8只。空白對照組按常規(guī)飼養(yǎng)方式飼喂,中藥復(fù)方Ⅰ,Ⅱ組在日糧中分別按每千克體質(zhì)量添加10 g的中藥復(fù)方Ⅰ,Ⅱ。預(yù)試期7 d,正式試驗(yàn)期70 d。試驗(yàn)雞分籠飼養(yǎng),飼喂全價(jià)飼料,自由采食和飲水。

1.5 生長性能指標(biāo)檢測分別于試驗(yàn)前和試驗(yàn)結(jié)束時稱取雞的體質(zhì)量,同時記錄每日采食量,計(jì)算平均日采食量和平均日增質(zhì)量。

1.6 血清生化指標(biāo)檢測試驗(yàn)期末,采集試驗(yàn)雞翅下靜脈血1 mL,室溫靜置1 h后,3 000 r/min離心10 min分離血清,全自動血液生化分析儀檢測血清生化指標(biāo)。

1.7 臟器指數(shù)檢測試驗(yàn)期末,處死所有試驗(yàn)雞并精確摘取脾臟、肝臟、睪丸,計(jì)算臟器指數(shù)。

計(jì)算公式:臟器指數(shù) = 臟器質(zhì)量(g)/公雞體質(zhì)量(kg)。

1.8 精液品質(zhì)的測定

1.8.1精液采集 采用背腹式按摩采精法[9]采集試驗(yàn)雞精液,正常公雞精液顏色為乳白色,比較濃稠,1次射精量為0.1～1.2 mL。采精前對公雞尾部泄殖腔周圍的羽毛進(jìn)行修剪,以免污染精液。

1.8.2精子活力 參照文獻(xiàn)[10]的目測法對采集的精液進(jìn)行精子活力判定。

1.8.3精子密度 將采集的精液樣品用3%NaCl溶液稀釋200倍,吸取1 μL精液稀釋液于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上,在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)。

計(jì)算公式:精子密度/(個·mL-1) = 5個中方格精子總數(shù)×5×10×1 000×稀釋倍數(shù)。

1.8.4精子畸形率 采用伊紅染液進(jìn)行染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察,計(jì)200個以上精子數(shù)并統(tǒng)計(jì)畸形的精子數(shù)量。

計(jì)算公式:精子畸形率=畸形精子數(shù)/精子總數(shù)×100%。

1.9 精漿抗氧化性能將采集的精液樣本1 500 r/min離心5 min,取上清,-20℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說明進(jìn)行抗氧化指標(biāo)的檢測。

1.10 睪丸組織的基因表達(dá)睪丸組織液氮速凍后于-80℃保存?zhèn)溆?使用TRIzol法從睪丸組織中提取總RNA,按照PrimeScript RT試劑盒(TaKaRa)說明合成cDNA模板。qRT-PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性30 s;95℃ 5 s,60℃ 31 s,40個循環(huán);60℃ 1 min。以β-actin作為內(nèi)參基因,結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算。引物序列如表1所示。

表1 引物信息

2 結(jié)果

2.1 中藥復(fù)方對公雞生產(chǎn)性能的影響如表2所示,與對照組相比,中藥復(fù)方Ⅰ,Ⅱ組平均日采食量、平均日增質(zhì)量均無顯著性差異(P>0.05)。

2.2 中藥復(fù)方對公雞血清生化指標(biāo)的影響如表3所示,與空白對照組相比,中藥復(fù)方Ⅰ組甘油三酯(TG)和血清乳酸脫氫酶(LDH)均顯著降低(P<0.05),其余各項(xiàng)指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;中藥復(fù)方Ⅱ組各項(xiàng)指標(biāo)均無顯著性差異。

表2 中藥復(fù)方對公雞體質(zhì)量和采食量的影響 g/d

2.3 中藥復(fù)方對公雞臟器指數(shù)的影響如圖1所示,與對照組相比,中藥復(fù)方Ⅱ組脾臟指數(shù)顯著升高(P<0.05),肝臟指數(shù)和睪丸指數(shù)無顯著性差異(P>0.05);復(fù)方Ⅰ組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和睪丸指數(shù)相較于對照組均有升高趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。

表3 中藥復(fù)方對公雞血清生化指標(biāo)的影響

不同字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同

2.4 中藥復(fù)方對公雞精液品質(zhì)的影響如圖2所示,與對照組相比,中藥復(fù)方Ⅰ,Ⅱ組精子密度分別提高了31.7%,33.9%,差異顯著(P<0.05);中藥復(fù)方Ⅱ組精子活力提高了10.5%,差異極顯著(P<0.01)。各試驗(yàn)組公雞精子畸形率無顯著性差異(P>0.05)。

圖2 中藥復(fù)方對公雞精液品質(zhì)的影響

2.5 中藥復(fù)方對公雞精漿抗氧化性能的影響如圖3所示,與對照組相比,中藥復(fù)方Ⅰ組GSH極顯著升高(P<0.01),中藥復(fù)方Ⅱ組有上升的趨勢,但差異不顯著(P>0.05);各組間T-AOC、SOD和MDA含量均差異不顯著,但中藥復(fù)方Ⅰ,Ⅱ組SOD相較于對照組有升高趨勢,MDA含量有降低趨勢,差異不顯著(P>0.05)。

圖3 中藥復(fù)方對公雞精漿抗氧化性能的影響

2.6 中藥復(fù)方對公雞睪丸相關(guān)基因表達(dá)的影響如圖4所示,與對照組相比,中藥復(fù)方Ⅰ組公雞睪丸AR基因表達(dá)水平極顯著升高(P<0.01),Bcl-2/Bax比值顯著升高(P<0.05),Bcl-2基因表達(dá)水平有升高趨勢,差異不顯著(P>0.05);中藥復(fù)方Ⅱ組睪丸Bcl-2基因表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),Bcl-2/Bax比值有升高趨勢,但差異不顯著(P>0.05);各組間Bax基因表達(dá)水平差異不顯著(P>0.05)。

圖4 中藥復(fù)方對公雞相關(guān)基因表達(dá)的影響

3 討論

有研究表明,中藥及中藥復(fù)方可顯著提高公雞精液品質(zhì),且安全性相對較高[2,6,11]。本試驗(yàn)中,與對照組相比,各組生產(chǎn)性能差異不顯著,表明本研究所用中藥復(fù)方不會影響公雞健康生產(chǎn)。血清生化指標(biāo)能客觀反映機(jī)體臟器的健康狀態(tài)、營養(yǎng)物質(zhì)代謝正常與否以及動物的免疫水平等,TG與代謝相關(guān),血清中LDH是檢測動物機(jī)體肝臟和實(shí)質(zhì)性內(nèi)臟器官損傷的指標(biāo)。鄧翀等[12]研究表明,五味子可調(diào)節(jié)大鼠血脂代謝,減少血清TG水平。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,添加復(fù)方Ⅰ后公雞血清中TG、LDH含量降低可能與五味子有關(guān)。據(jù)報(bào)道,中藥復(fù)方可以促進(jìn)小鼠器官發(fā)育,提高脾臟指數(shù)[13],本試驗(yàn)中復(fù)方Ⅱ組公雞脾臟指數(shù)顯著提高,說明中藥復(fù)方對機(jī)體代謝有一定增強(qiáng)作用且不會對臟器造成損傷。

隨著人工授精技術(shù)在家禽業(yè)的廣泛應(yīng)用,對精液優(yōu)質(zhì)程度的要求不斷提高。精液品質(zhì)的優(yōu)劣主要從精子活力、精子密度和精子畸形率等方面綜合判斷,本試驗(yàn)中藥復(fù)方Ⅰ,Ⅱ均能提高精子密度和活力,可顯著提高來航公雞的精液品質(zhì)。研究證實(shí),具有滋腎陰、補(bǔ)腎精、益精髓、壯陽作用的中藥可提高動物精液的品質(zhì)[14-15]。相關(guān)研究證實(shí),五味子、車前子、覆盆子中富含鋅(Zn)、硒(Se)等微量元素[16],Zn在生殖細(xì)胞發(fā)育和精子發(fā)生、精子細(xì)胞發(fā)育和成熟、射精、液化、精子和前列腺小體的結(jié)合、獲能和受精的初始階段起關(guān)鍵作用[17];Se對哺乳動物的正常精子發(fā)生至關(guān)重要[18]。

脂質(zhì)過氧化是一種自然現(xiàn)象,對精子活力有顯著影響,精子易受到氧化應(yīng)激,對其運(yùn)動性、膜完整性和受精能力等功能造成損害。精子和精漿含有許多具有抗氧化特性的化學(xué)成分,如SOD,谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和過氧化氫酶(CAT),可以保護(hù)精子免受氧化損傷[19],MDA作為脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物,可反映發(fā)生氧化應(yīng)激的水平;研究表明SOD、GSH活性增加和MDA含量降低,間接反映精子的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)減弱,可提高公雞精液抗氧化性能,從而提高公雞精液品質(zhì)[15],本試驗(yàn)選用的中藥復(fù)方顯著提高了精漿GSH含量和SOD活性,同時降低了MDA含量,增強(qiáng)了精漿抗氧化性能,提高了精液品質(zhì),與相關(guān)研究報(bào)道相一致[20-21]。

公雞睪丸雄激素受體(AR)是雄激素作用的中介物質(zhì),雄激素通過與AR結(jié)合而發(fā)揮其功能,AR基因的表達(dá)與睪酮生物合成和代謝相關(guān),其表達(dá)上調(diào)可以間接反映公雞的生精能力,AMEVOR等[11]研究發(fā)現(xiàn),公雞睪丸AR基因表達(dá)上調(diào)可提升公雞精子形成能力,與本試驗(yàn)結(jié)果一致;Bcl-2與Bax是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因,Bcl-2抑制細(xì)胞的凋亡,Bax與其作用相反,Bcl-2/Bax比值的變化可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的平衡[22],當(dāng)Bcl-2/Bax比值小于1時,生精細(xì)胞凋亡明顯增加[23]。在本試驗(yàn)中,中藥復(fù)方均提高了睪丸Bcl-2基因表達(dá)水平,復(fù)方Ⅰ組Bcl-2/Bax比值顯著增加,可以使生精能力得到提升,結(jié)果與中藥復(fù)方組精液品質(zhì)檢測中精子密度增加一致,提示中藥復(fù)方可能通過調(diào)控生殖和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因來提高公雞精液品質(zhì)。

綜上,中藥復(fù)方可通過提高臟器指數(shù)、精液密度、精子活力、精漿抗氧化能力以及睪丸AR和Bcl-2基因的表達(dá)水平,提高來航公雞的精液品質(zhì)。