王 劭

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所,福建 福州 350013)

自噬的研究歷史可以追溯到20世紀60年代初,比利時科學(xué)家DUVE等[1]在1963年溶酶體國際專題討論會議(CIBA Foundation Symposium on Lysosomes)上在描述溶酶體時首先引入了“自噬”一詞。自此,自噬的生理和病理生理作用被廣泛研究。自噬(作為程序性細胞死亡Ⅱ型)現(xiàn)在被認為是一種溶酶體依賴的受控降解過程,用于清除無用的生物大分子或受損的細胞器[2-4],能夠分解和再循環(huán)細胞成分,實現(xiàn)胞內(nèi)物質(zhì)自我更新,是真核細胞的一個關(guān)鍵特征與特有的普遍生命現(xiàn)象[5]。雖然自噬最初被認為是一種原始的降解機制,被激活以保護細胞免受饑餓,但很明顯,自噬也有助于非饑餓細胞的內(nèi)環(huán)境平衡[8]。此外,自噬流量影響正常的衰老與病理性的衰老,以及不同類型傳染病與非傳染病的致病過程[6]。

自噬是一種嚴格調(diào)控且進化上保守的機制,通過靶向細胞內(nèi)成分隔離、溶酶體降解和回收,不僅可以維持細胞穩(wěn)態(tài),還能夠抵消外部刺激的影響[7]。這一過程的調(diào)節(jié)劑包括在細胞生長過程中抑制自噬的激素和生長因子,以及細胞內(nèi)營養(yǎng)、氧氣和能量的水平,從而使該途徑成為對抗細胞應(yīng)激誘導(dǎo)物的防御機制,有助于去除通常不會被泛素-蛋白酶體途徑降解的物質(zhì),包括入侵的病原體[8]。在各種病原微生物中,病毒已被廣泛證明可誘導(dǎo)自噬以有利于病毒在感染細胞中的生長并調(diào)節(jié)宿主防御反應(yīng),例如先天抗病毒免疫[9]。自噬可能通過靶向病毒顆粒或病毒成分進行降解來對抗病毒感染,還可以促進病原體相關(guān)分子模式與專門激活先天免疫途徑的模式識別受體之間的相互作用,或促進抗病毒適應(yīng)性免疫的激活[10]。為了應(yīng)對這種免疫壓力,病毒進化出各種復(fù)雜策略來減弱自噬降解和/或拮抗先天抗病毒免疫,促進病毒-宿主細胞相互作用的平衡,從而避免抗病毒自噬反應(yīng)或操縱自噬機制以促進自身復(fù)制增殖[11]。自噬已被證明在病毒感染的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用,并被認為是針對細胞內(nèi)病原體(包括病毒)的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)劑和效應(yīng)劑[12]。鑒于細胞自噬是調(diào)控病毒生命周期的關(guān)鍵動態(tài)生物過程,本文簡要概述了細胞自噬,以及自噬和病毒之間的相互作用,重點介紹了病毒感染過程中細小病毒與自噬之間的相互作用,以期為進一步理解細小病毒的致病機制理提供新思路及理論依據(jù)。

1 細胞自噬概述

1.1 細胞自噬過程和方式自噬在維持細胞內(nèi)環(huán)境平衡方面發(fā)揮了重要作用。作為一個保守的關(guān)鍵降解過程,自噬針對異常的細胞細胞質(zhì)成分和受損的細胞器、蛋白質(zhì)聚集以及入侵的病原體隔離在雙層膜自噬體中,然后將其運輸?shù)饺苊阁w中進行分解和再循環(huán)[13]。自噬誘導(dǎo)始于由自噬相關(guān)(autophagy-related genes,ATG)蛋白調(diào)節(jié)的吞噬細胞形成,這些蛋白招募到許多細胞器的膜上以啟動自噬[14]。隨后,受損的細胞器、錯誤折疊的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體被吞噬細胞包圍,導(dǎo)致自噬前結(jié)構(gòu)(pre-autophagosomal structure/phagophore assembly site,PAS)的成核和形成,其延伸通過招募其他膜結(jié)構(gòu)形成自噬體。隨后,自噬體與溶酶體融合形成自溶酶體,通過溶酶體蛋白酶降解捕獲的內(nèi)容物[15]。

根據(jù)捕獲待降解底物(cargo)的不同方式,至少有3種不同類型的自噬,包括巨自噬(macroautophagy)、分子伴侶介導(dǎo)的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)和微自噬(microautophagy)[16]。巨自噬,通常簡稱為自噬,即真核細胞用來降解長壽蛋白和細胞器的主要調(diào)節(jié)分解代謝機制,涉及將隔離在雙膜囊泡內(nèi)的胞內(nèi)物質(zhì)輸送到溶酶體,最初的步驟包括隔離膜的形成,即囊泡成核(vesicle nucleation)和囊泡伸長(vesicle elongation),隔離膜也稱為吞噬細胞。然后,吞噬體囊泡的邊緣融合(vesicle completion)形成一種隔離細胞質(zhì)物質(zhì)的雙層膜囊泡樣自噬體(autophagosome)[17]。自噬體也可以與內(nèi)質(zhì)體或多泡體以及主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-Ⅱ類分子融合,對自噬體內(nèi)的底物進行處理。隨著更多自噬體和溶酶體相融合,自噬溶酶體變得更大,但在終止階段,自噬溶酶體會發(fā)生管化,回收并生成新的溶酶體[18]。越來越多的證據(jù)表明,自噬途徑的每一步都受到大量細胞因子或信號傳導(dǎo)通路的嚴格調(diào)控[19]。自噬通過與模式識別受體信號傳導(dǎo)協(xié)同誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生來啟動先天免疫反應(yīng),還可以選擇性地降解與病毒顆粒相關(guān)的免疫成分,并將病毒抗原呈遞給 T 淋巴細胞來協(xié)調(diào)適應(yīng)性免疫[20]。

1.2 細胞自噬的分子機制自噬是一種在所有真核生物中高度保守的細胞降解和再循環(huán)過程。ATG相關(guān)基因最初發(fā)現(xiàn)的功能是協(xié)調(diào)和介導(dǎo)形成胞內(nèi)雙膜分子結(jié)構(gòu),將胞質(zhì)內(nèi)的內(nèi)容物輸送到溶酶體進行降解。這個過程在所有真核生物中都是保守的,幾乎在所有細胞類型中都發(fā)生在基礎(chǔ)水平,并且通過不同的細胞內(nèi)和細胞外信號而增加。它對于細胞穩(wěn)態(tài)、細胞蛋白質(zhì)和細胞器質(zhì)量控制以及有機體對環(huán)境壓力的適應(yīng)至關(guān)重要[21]。進一步的分子和生化研究表明,一組16～20個核心保守的ATG基因涉及這種由溶酶體介導(dǎo)的胞內(nèi)降解途徑,這些基因編碼的ATG蛋白傳統(tǒng)上被劃分為不同的生化和功能組,在自噬體啟動或形成的特定階段發(fā)揮作用[22]。unc51樣自噬激活激酶1(ULK1)絲氨酸-蘇氨酸激酶復(fù)合物(涉及ULK1、FIP200、ATG13和ATG101)在自噬啟動、磷酸化多個下游因子中起主要作用[23]。自噬相關(guān)基因Beclin 1/Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(PI3KC3)復(fù)合物會在自噬啟動早期被激活,生成磷脂酰肌醇3-磷酸(PI3P),在自噬體成核(PI3KC3-C1涉及Beclin 1、VPS34、VPS15和ATG14)或內(nèi)溶體和自噬體成熟(PI3KC3-C2涉及Beclin 1、VPS34、VPS15和UVRAG)中發(fā)揮作用,而含有ATG9A(唯一的跨膜核心ATG蛋白)的囊泡為自噬體提供膜結(jié)構(gòu)[24]。WIPI蛋白(WD重復(fù)結(jié)構(gòu)域磷脂酰肌醇相互作用蛋白)及其結(jié)合伴侶ATG2A或ATG2B在PI3P生成位點的早期自噬體膜延伸中發(fā)揮作用[25]。自噬體膜擴展和完成涉及兩個泛素樣蛋白質(zhì)結(jié)合系統(tǒng),ATG12結(jié)合對前自噬體的形成至關(guān)重要,而微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 (microtubule- associated protein1 light chain 3,MAP1LC3,或簡稱LC3)修飾是形成自噬體的關(guān)鍵步驟。因此,自噬體的形成需要一組保守的蛋白質(zhì)復(fù)合物:ULK1/2激酶復(fù)合物,PIK3C3/VPS34激酶復(fù)合物,ATG9A膜循環(huán)系統(tǒng)和兩個聯(lián)級順次作用的泛素樣結(jié)合系統(tǒng)ATG12-ATG5-ATG16L1復(fù)合物和LC3與脂質(zhì)雙層膜上磷脂酰乙醇胺(PE)結(jié)合[26]:1)ATG12-ATG5-ATG16L系統(tǒng):ATG12通過ATG7(E1樣酶)和ATG10(E2樣酶)結(jié)合成ATG5,然后結(jié)合的ATG12-ATG5復(fù)合物與ATG16結(jié)合。這個ATG12-ATG5-ATG16復(fù)合物定位于伸長的自噬體的外膜,作為E3連接酶復(fù)合物發(fā)揮作用,介導(dǎo)LC3(酵母ATG8的自噬體同源體)與PE連接。一旦自噬體形成后,Atg5-Atg12-Atg16復(fù)合物就從膜上解離下來。最近的一項研究表明,在某些應(yīng)激條件下,自噬可以獨立于ATG5/ATG7發(fā)生,這表明存在形成自噬體的替代途徑;2)膜脂質(zhì)PE-LC3系統(tǒng):LC3與PE結(jié)合。LC3通過其多聚作用促進自噬細胞之間的膜栓系和半融合。ATG4切割早期合成的pro-LC3暴露C端甘氨酸形成胞漿可溶形式的LC3-Ⅰ,并由ATG7和ATG3進一步加工以與PE結(jié)合,生成脂質(zhì)化形式的 LC3,也稱作 LC3-Ⅱ。LC3-Ⅱ與自噬體膜特異性相關(guān),定位于前自噬體和自噬體,使該蛋白成為自噬體標記物。自噬體與溶酶體融合后,自噬體內(nèi)LC3-Ⅱ即被溶酶體水解酶降解。

根據(jù)Cargo的選擇性,自噬可分為非選擇性自噬(non-selective autophagy,又稱bulk autophagy)和選擇性自噬(selective autophagy)[27]。非選擇性自噬是細胞對饑餓或應(yīng)激的一種應(yīng)激反應(yīng)機制。它隨機吞噬和消化細胞質(zhì)中的物質(zhì),以便快速循環(huán),補充從環(huán)境中吸收的營養(yǎng)不足,以維持細胞最基本的生存需要。選擇性自噬是一種細胞自我質(zhì)控機制,可選擇性降解蛋白質(zhì)聚集物、受損細胞器、過量過氧化物酶體和入侵病原體,以維持營養(yǎng)豐富細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。自噬主要通過選擇性自噬受體特異性結(jié)合降解底物表面的SQSTM1/p62、NBR1、OPTN、NDP52和TAX1BP1和自噬體表面的LC3分子來實現(xiàn)其選擇性降解。當自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體時,溶酶體中的許多酶,例如溶酶體水解酶可以將自噬體的內(nèi)膜和自噬體中的細胞質(zhì)衍生大分子,例如蛋白質(zhì)和細胞器降解為氨基酸或肽,供細胞重復(fù)使用。

2 細胞自噬與病毒感染

2.1 自噬介導(dǎo)抗病毒免疫應(yīng)答自噬通常被認為是一種先天性免疫反應(yīng),用于控制病毒感染的早期階段,并在先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)之間形成橋梁,其中抗原處理需要降解過程[28]。病毒自噬(virophagy)是一種直接降解完整病毒粒子或特定病毒蛋白(那些對病毒生命周期至關(guān)重要的成分)的吞噬過程[29]。辛德比病毒(Sindbis virus,SINV)感染神經(jīng)元細胞時,p62蛋白結(jié)合到病毒衣殼上激活病毒自噬。p62介導(dǎo)的神經(jīng)元中SINV清除是一種宿主抗病毒反應(yīng),p62或Atg5自噬基因敲除將增加SINV衣殼的積累,加速病毒誘導(dǎo)的細胞死亡,而不影響病毒的復(fù)制。丙型肝炎病毒(HCV)感染人肝癌HUH-7以及人胚胎腎HEK293細胞時,細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白SHISA5與病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A相互作用,將病毒粒子轉(zhuǎn)運到自噬體中進行降解從而抑制病毒復(fù)制增殖。水泡性口炎病毒(VSV)感染可以抑制細胞PI3K-Akt信號通路,促進細胞自噬從而限制病毒復(fù)制起始以及子代病毒顆粒組裝。人類免疫缺陷病毒1 (HIV-1)復(fù)制晚期,宿主細胞的自噬狀態(tài)可以抑制HIV-1的感染,自噬前體雙層膜上骨髓基質(zhì)抗原2(bone marrow stromal antigen 2,BST-2)物理性將正在出芽的HIV-1拴在細胞膜上,顯著抑制表達HIV-1 gag和gag-pol兩種蛋白的病毒樣顆粒從細胞表面釋放出來限制病毒基因組。諾如病毒感染小鼠成纖維細胞后,IFN-γ分泌增加并激活自噬途徑,招募Atg5-Atg12-Atg16L1復(fù)合體定位于自噬體的外膜上,限制感染細胞膜重排后形成病毒復(fù)制復(fù)合物體從而抑制病毒子代復(fù)制。對于某些病毒(如VSV、仙臺病毒、流感病毒、HIV-1和單純皰疹病毒(HSV))而言,感染能誘導(dǎo)多種宿主細胞發(fā)生自噬,其中漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)可以通過識別自噬溶酶體中的病毒基因組來檢測病毒的存在,當這些宿主細胞的自噬被抑制時,干擾素-α(IFN-α)的產(chǎn)生也被抑制[30],表明自噬是感知病毒和啟動抗病毒反應(yīng)的關(guān)鍵過程。

2.2 病毒介導(dǎo)的自噬抑制如前所述,自噬可以限制病毒感染。然而,宿主和病原體之間的持續(xù)協(xié)同進化導(dǎo)致一些病毒形成了逃避選擇性自噬降解的機制,甚至利用自噬相關(guān)信號通路中的特定細胞結(jié)構(gòu)或部分調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來促進它們在細胞內(nèi)的生存、侵染和增殖[29]。HCV感染細胞產(chǎn)生自噬體,利用小穴蛋白1(caveolin 1)、小穴蛋白2(caveolin 2)和膜聯(lián)蛋白A2(annexin A2)為其復(fù)制產(chǎn)生能量并促進病毒粒子組裝,并借助胞吐途徑釋放子代病毒粒子。HCV感染激活細胞自噬,抑制這一過程導(dǎo)致病毒產(chǎn)生減少。小核糖核酸病毒促進自噬體的形成以促進病毒復(fù)制,但它們阻斷溶酶體與這些自噬體的結(jié)合,在脊髓灰質(zhì)炎病毒感染期間,使用自噬激活劑雷帕霉素會導(dǎo)致病毒復(fù)制增加。腦心肌炎病毒(EMCV)通過其非結(jié)構(gòu)蛋白2C和3D產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,誘導(dǎo)自噬并促進其復(fù)制。登革熱病毒(DENV)通過腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路激活自噬,最終誘導(dǎo)形成包圍脂滴的雙膜囊泡,這種形式的自噬被稱為脂滴自噬(lipophagy),并通過β-氧化導(dǎo)致脂滴降解,生成ATP滿足病毒復(fù)制所需的能量要求。甲型流感病毒(IAV) 使用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用來抑制抗病毒自噬并促進其復(fù)制,通過其基質(zhì)2 (M2)蛋白規(guī)避細胞自噬,病毒M2的細胞質(zhì)尾部具有一個相互作用基序-LC3相互作用區(qū)(LIR),通過該基序蛋白與LC3結(jié)合導(dǎo)致LC3重新定位到質(zhì)膜上,穩(wěn)定流感病毒囊膜結(jié)構(gòu)并促進病毒粒子的絲狀出芽。單純皰疹病毒1型(HSV-1)抑制 Beclin-1(自噬機制的一個組成部分)以阻斷自噬誘導(dǎo)。HSV-1 蛋白 ICP34.5 包含一個 Beclin-1 結(jié)合域 (BBD),這對于抑制自噬至關(guān)重要。ICP34.5 對自噬的抑制導(dǎo)致 HSV-1 腦炎的發(fā)展。 HCMV 有兩個 ICP34.5 同源物,稱為 TRS1 和 IRS1,它們都具有抑制細胞自噬和逃避抗病毒過程的BBD[31]。苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)感染宿主昆蟲細胞后,細胞肌動蛋白(actin)和V-ATPase的過表達可能會干擾AcMNPV誘導(dǎo)的自噬過程,阻滯病毒多角體蛋白合成與裝配,從而抑制病毒復(fù)制和包裝[32]。

3 細小病毒復(fù)制特點

細小病毒的基因組是長約5 100 bp的單鏈DNA分子。病毒序列的5′與3′末端均有1個復(fù)雜的回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)(inverted terminal repeats,ITRs),類似于“Y”或“T”形,作為病毒DNA復(fù)制過程的引物,在保持病毒基因組完整性上起到重要作用。在細小病毒基因組中含有2～3個基因編碼區(qū),主要編碼兩種類型病毒,一種是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白,即病毒衣殼蛋白(VP1、VP2、VP3);另一種是非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2、NP1)[33]。NS蛋白具有解旋酶和切割酶的功能,負責病毒的復(fù)制和加工,VP蛋白通過可變剪接形成不同的翻譯模板,參與病毒感染細胞和病毒衣殼蛋白組裝,其N端與病毒基因組的3′端結(jié)合,有助于穩(wěn)定病毒基因和引導(dǎo)病毒基因入核復(fù)制[34]。病毒聚集體完全依賴于低pH值誘導(dǎo)的內(nèi)吞體-溶酶體途徑,VP1衣殼蛋白由于低pH值等酸化環(huán)境暴露出其獨特區(qū)中的核定位信號(nuclear localization signal,NLS),介導(dǎo)細小病毒粒子由早期胞內(nèi)體/晚期胞內(nèi)體/溶酶體逐步移位至細胞質(zhì)核周區(qū),這是細小病毒進入細胞核啟動復(fù)制增殖前不可或缺的病毒生命周期[35]。

細小病毒基因組DNA復(fù)制發(fā)生在細胞核內(nèi),其復(fù)制過程出現(xiàn)于細胞周期的S期,病毒利用宿主DNA聚合酶和其他細胞成分,隨著細胞增殖進行子代病毒復(fù)制[36]。細小病毒DNA合成機制很可能是以“滾動發(fā)夾”模式進行復(fù)制,基因組回文3′末端的發(fā)夾作為一種自引物,用于啟動正鏈DNA的合成,從而形成共價閉合的雙鏈分子。病毒NS蛋白隨后進行“發(fā)夾轉(zhuǎn)移驅(qū)動”(hairpin transfer)通過切割其中1條單鏈,完成ITR退火延伸并連接形成“兔耳”(rabbit’s ear)結(jié)構(gòu)反應(yīng),之后子代負鏈依次從新合成的正鏈轉(zhuǎn)錄而來,并再次使用發(fā)夾結(jié)構(gòu)作為引物,隨后的幾輪DNA復(fù)制導(dǎo)致雙鏈二聚體和四聚體的形成,通過核酸內(nèi)切酶水解復(fù)制中間多聯(lián)體釋放病毒基因組單鏈[37]。

4 自噬與細小病毒感染的研究進展

4.1 人博卡病毒1型(human bocavirus 1,HBoV1)誘導(dǎo)細胞自噬HBoV1是單鏈無包膜DNA病毒[38],與牛細小病毒 (BPV)、犬 細 小 病 毒及新發(fā)現(xiàn)的豬博卡病毒(PBoV),歸屬于細小病毒科的 Bocaparvovirus 屬,NP1基因為博卡病毒屬成員所特有的保守序列,其編碼蛋白氨基酸序列同源性達 47%[39]。HBoV1 NP1 蛋白在病毒復(fù)制及避免宿主天然免疫過程中起到重要作用,ZHU等[40]通過表達 NP1 蛋白來研究 NP1 蛋白對人非小細胞肺癌細胞(A549)自噬和生存能力的影響,將含有HBoV1 NP1 基因的陽性質(zhì)粒CMV-NP1轉(zhuǎn)染A549 細胞,發(fā)現(xiàn) NP1 蛋白可上調(diào) A549 細胞中自噬因子Beclin1 和 LC3-Ⅱ蛋白表達并表現(xiàn)出時間依賴性和濃度依賴性,同時可以下調(diào) p62 和高遷移率族蛋白 B1(high mobility group protein 1,HMGB1)的表達并抑制了細胞克隆形成、增殖和遷移。HBoV1 NP1表達蛋白可以通過磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3(phosphorylated signal transducer and activator of transcription-3,P-STAT3)誘導(dǎo) A549 細胞自噬。另外,HBoV1重組病毒質(zhì)粒pWHL-1轉(zhuǎn)染人支氣管上皮細胞(HBEC)后,借助透射電鏡可以觀察到感染細胞內(nèi)細胞器細胞膜(包括線粒體)受損,細胞質(zhì)中存在大量自噬空泡和自噬小體,而正常對照組細胞核排列正常,細胞器細胞膜豐富完整,如線粒體,細胞質(zhì)中自噬空泡和自噬體數(shù)量較少,同時熒光定量RT-PCR檢測表明,pWHL-1轉(zhuǎn)染HBEC細胞內(nèi)LC3-Ⅱ和ATG5的mRNA表達水平顯著升高,LC3-Ⅰ和SQSTM1的mRNA表達水平顯著降低[41]。

4.2 豬細小病毒(porcine parvovirus,PPV)誘導(dǎo)細胞自噬PPV屬于細小病毒科、細小病毒亞科、細小病毒屬1型有蹄類原細小病毒種,為單股非囊膜線性DNA病毒,其基因組大小為4～6.3 kb,由5′端與3′端非翻譯區(qū)、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)、結(jié)構(gòu)蛋白(VP)組成[42]。VP2是PPV主要免疫原性蛋白,能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體,在決定病毒的組織嗜性和致病性上起到重要作用[43]。PPV感染豬睪丸細胞(ST)后,Western blot試驗表明,雷帕霉素處理組和PPV感染組與正常對照組相比,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)化增加,p62的水平顯著降低。另外,免疫熒光共聚焦顯微鏡觀察分析顯示,通過內(nèi)源性 LC3 染色判斷,PPV感染ST細胞中出現(xiàn)大量陽性熒光斑點狀GFP-LC3蛋白,與雷帕霉素處理組相似,而在正常對照組細胞中GFP-LC3陽性熒光為彌散分布,表明細胞自噬可能參與了PPV的感染過程。為了進一步證實以上推測,使用透射電子顯微鏡觀察PPV感染ST細胞內(nèi)組織,PPV感染和雷帕霉素處理ST細胞中有自噬體樣囊泡結(jié)構(gòu)出現(xiàn),上述結(jié)果表明PPV感染可以誘導(dǎo)ST細胞發(fā)生自噬。在自噬是否能夠促進PPV復(fù)制試驗中,Western blot檢測表明雷帕霉素可顯著增加PPV VP2的表達,而當添加自噬抑制劑渥曼青霉素時PPV VP2的表達極顯著減少,實時熒光定量PCR與PPV TCID50檢測中,PPV感染后雷帕霉素處理組較PPV感染組以及渥曼青霉素抑制組病毒拷貝數(shù)與滴度均顯著增加,并且細胞自噬具有劑量依賴性,說明PPV在ST細胞中誘導(dǎo)的自噬可有利于病毒的復(fù)制[44]。另外,還有研究表明,PPV 感染可以誘導(dǎo)豬胎盤滋養(yǎng)層細胞(PTCs)發(fā)生自噬,通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)直接磷酸化接頭蛋白Raptor,阻斷mTORC1激酶復(fù)合物磷酸化其底物進而啟動細胞自噬,在感染的早期(24,48 h)主要誘導(dǎo)自噬體的形成,細胞發(fā)生了不完全自噬,在感染的后期(72 h)進一步誘導(dǎo)了自噬流的形成,激活了AMPK-Raptor-mTOR-ULK1-Beclin1 依賴性自噬途徑,促進了PPV復(fù)制增殖[45]。

4.3 小鼠微小病毒(murine minute virus,MVM)誘導(dǎo)細胞自噬MVM為單鏈 DNA 病毒,無囊膜,有極強的穩(wěn)定性,易感染嚙齒類動物細胞,如 CHO、NS0、BHK21 細胞等[46]。MVM感染宿主細胞后,通過3條途徑影響細胞自噬,促進病毒復(fù)制增殖[47-50]:(1)誘使被感染細胞的胞質(zhì)溶膠中酸性自噬空泡積聚,隨著自噬空泡中組織蛋白酶的濃度升高,半胱氨酸組織蛋白酶B的釋放量明顯增加,活化細胞漿中激活蛋白激酶B/Akt,激活PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路,蛋白激酶B通過對下游的哺乳動物西羅莫司(雷帕霉素)靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of sirolimns(rapamycin)complex 1,mTORC1)的活化調(diào)控ULK1抑制細胞自噬的發(fā)生,進而延緩宿主細胞的死亡,保證病毒的復(fù)制和釋放;(2)由于半胱氨酸組織蛋白酶B的持續(xù)釋放,降解多種細胞外基質(zhì)成分,破壞感染宿主體內(nèi)一系列組織屏障,導(dǎo)致細胞骨架發(fā)生顯著變化,細胞膜通透性增加,促進子代病毒被動釋放;(3)酸性空泡中酪蛋白激酶2特異性識別并磷酸化選擇性自噬接頭蛋白p62。當感染細胞自噬活性減弱時,p62蛋白會聚集在細胞質(zhì)中,提高mTORC1的表達水平,繼而進一步抑制細胞自噬,使自噬囊泡成為病毒復(fù)制的有利場所。

4.4 其他單鏈DNA細小病毒誘導(dǎo)細胞自噬斑潛蠅濃核病毒感染吉普賽舞蛾細胞株(Ld652Y)后,通過激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶體蛋白(PI3K/AKT/mTOR)信號通路,抑制mTORC1活化繼而誘發(fā)細胞自噬促進自噬溶酶體囊泡生成,為子代病毒復(fù)制提供場所[51]。家蠶核型多角體病毒(bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)感染家蠶后,熱激蛋白(heat shock proteins)HSP70和HSP90家族成員高水平表達,做為協(xié)同病毒增殖的促病毒復(fù)制效應(yīng)(pro-viral)宿主因子,可以識別 BmNPV 并招募其他 HSP 和泛素形成聚集體,最終啟動自噬體的形成[52]。人細小病毒B19V在感染過程均可誘導(dǎo)宿主細胞內(nèi)線粒體自噬,促進病毒在細胞內(nèi)的復(fù)制增殖,用3-甲基腺嘌呤抑制 B19V 感染細胞中的自噬會促進細胞死亡,這表明自噬在感染細胞的存活中起到關(guān)鍵作用[53]。2型腺病毒相關(guān)病毒(AAV-2)感染HeLa細胞后可特異性誘導(dǎo)自噬-溶酶體通路基因表達調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子EB(TFEB)激活,導(dǎo)致溶酶體的數(shù)量增加和效能升高,從而增強溶酶體的分解代謝活性,降解自噬底物并促使細胞內(nèi)代謝廢物排至細胞外[54]。

5 小結(jié)與展望

病毒感染的每個階段幾乎都可以通過自噬來控制或被影響,同時自噬途徑做為調(diào)控病毒增殖效率的分子通路涵蓋了從自噬體雙層膜伸長和關(guān)閉,以及自噬小體與溶酶體融合和再循環(huán)的信號傳導(dǎo)全過程[55]。每種病毒都可能有一種獨特的策略來劫持自噬并避免免疫反應(yīng),自噬受體靶向是病毒調(diào)節(jié)宿主信號通路的重要侵染策略,例如病毒蛋白酶協(xié)同、多聚蛋白水解切割和翻譯后修飾的調(diào)節(jié),以使這些受體在功能上失活,關(guān)閉自噬相關(guān)蛋白依賴性選擇性降解途徑,剖析病毒與宿主細胞內(nèi)途徑相互作用的分子機制對于研究抗病毒固有免疫信號通路非常重要[56]。

自噬作為一種固有的胞質(zhì)降解過程,能調(diào)節(jié)RNA和DNA病毒模式識別受體介導(dǎo)的天然抗病毒反應(yīng),在維持機體內(nèi)環(huán)境免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[57]。研究表明,抗病毒自噬是免疫系統(tǒng)中一個動態(tài)的生理和病理級聯(lián)效應(yīng)過程[58]:一方面,自噬清除病毒,直接包裹降解病原體,誘導(dǎo)機體產(chǎn)生固有免疫應(yīng)答,或者通過調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)來激發(fā)抗原遞呈,激活適應(yīng)性免疫反應(yīng);另一方面,病毒試圖通過破壞或操縱自噬分子機制中相關(guān)信號通路,實現(xiàn)對Ⅰ型和Ⅲ型干擾素反應(yīng)的抑制,進而實現(xiàn)免疫逃逸,完成病毒侵染與復(fù)制。與此同時,病毒還可以通過抑制自噬、與自噬蛋白相互作用,甚至利用自噬體作為復(fù)制位點來促進其持續(xù)感染增殖。盡管關(guān)于自噬在病毒感染中的作用還有許多未解決的問題,但病毒毒力因子靶向特定的自噬蛋白強調(diào)了自噬作為抗病毒免疫的一種基本機制的重要性,有必要進一步確定自噬和其他自噬基因依賴性過程在體外和體內(nèi)影響相關(guān)細胞類型中不同病毒增殖結(jié)果的通路信號級聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。總之,病毒的生命周期與細胞自噬功能密切相關(guān),對病毒與自噬相互調(diào)控分子機制的持續(xù)研究將是未來科學(xué)探索的一個富有成效的前瞻領(lǐng)域,更好地了解不同病毒如何影響和響應(yīng)自噬,將有助于更好地了解病毒致病機理和開發(fā)針對自噬途徑的抗病毒藥物或者新的特異性抗病毒療法。