胡啟蒙,張?jiān)魄?黃 琴,高智清

(廊坊師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 河北省動(dòng)物多樣性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 廊坊 065000)

人工授精技術(shù)通常用于畜牧業(yè)生產(chǎn)[1],人工授精所需要的精源通常使用17℃液體保存,其具有成本低、便于運(yùn)輸以及不易污染等優(yōu)點(diǎn)。但保存精子 會受到氧化應(yīng)激和細(xì)菌感染損傷[2],特別是豬精子,因具有低膽固醇/磷脂比,對低溫和氧化刺激較敏感,更容易在保存中受到損傷[3],通常采用研發(fā)稀釋劑解決精子保存技術(shù)的瓶頸。目前,研究主要集中在外源添加抗氧化劑和抑菌劑,以減少精子損傷和維持精子正常功能。

納米技術(shù)是生物技術(shù)的一個(gè)新興領(lǐng)域,納米氧化鋅顆粒(ZnO NPs)是一種粒徑為1～100 nm的氧化顆粒,其具有抗氧化性、殺菌性和安全性等優(yōu)異性能且在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域已得到證實(shí)[4],并廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)[5],用于精子保存時(shí)可緩解精子在冷凍和解凍過程中造成的損傷。冷凍保存牛、雞精子添加納米氧化鋅(ZnO)可提高解凍后精子質(zhì)量[6]。已知鋅在睪丸發(fā)育、精子發(fā)生、獲能和精子運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用[7]。

哺乳動(dòng)物成熟精子是一種高度分化的細(xì)胞[8],成熟后幾乎無新蛋白質(zhì)生成,因此翻譯后修飾成為精子功能的重要調(diào)控機(jī)制,其中蛋白磷酸化修飾是最重要的調(diào)節(jié)方式,在精子運(yùn)動(dòng)和能量代謝等過程中發(fā)揮重要作用[9]。線粒體是精子成熟后極少數(shù)被保留下來的細(xì)胞器之一,是產(chǎn)生ATP的主要場所,為精子運(yùn)動(dòng)提供能量保障[10]。

ZnO在豬精子保存過程中的效果和作用機(jī)理還未完全了解,本研究擬從精子質(zhì)量(活力和膜完整性)、抗氧化層面分析ZnO NPs對保存豬精子全蛋白和亞組分(骨架和膜)蛋白的磷酸化修飾,探討ZnO NPs對保存豬精子氧化應(yīng)激緩解作用機(jī)理及對精子質(zhì)量和蛋白磷酸化保護(hù)效果。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料供試精子取自成年健康雄性杜洛克豬,精子活力良好(>70%)。用Androstar Plus稀釋液按1∶2的比例稀釋精液,700×g離心5 min,去掉1/3的上清液后,將剩余的精液重懸于Androstar Plus稀釋液中,得到總體積為50 mL、精子終濃度為1×107個(gè)/mL的稀釋精液。

1.2 主要試劑PKA底物磷酸化檢測抗體購自CST公司,對應(yīng)的二抗、熒光二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。ZnO NPs(30～80 nm)購自南京先豐納米材料科技有限公司?？偝趸锲缁?SOD)和微量丙二醛(MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 溶液配制精子未獲能培養(yǎng)液(pH7.4)配方為 2.7 mmol/L KCl、1.5 mmol/L KH2PO4、8.1 mmol/L NaH2PO4、137 mmol/L NaCl、5.55 mmol/L葡萄糖溶液和2 mmol/L丙酮酸鈉溶液。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1試驗(yàn)一 在5 mL稀釋精液中添加不同質(zhì)量濃度(0,20,50,100,200 mg/L)的ZnO NPs,在17℃恒溫箱中保存,每12 h輕輕搖動(dòng)溶液,避免精子沉淀。分別于保存1,3,5,7 d后檢測0,50 mg/L處理組精子總抗氧化能力(T-AOC)和MDA含量;保存7 d后,收集各處理精子加入適量未獲能培養(yǎng)液,在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,用于檢測各處理組(0,20,50,100,200 mg/L)精子質(zhì)量(活力、膜完整性)和蛋白磷酸化。

1.4.2試驗(yàn)二 在100 mg/L ZnO NPs處理下添加1 mmol/L dbcAMP或0.1 mmol/L H-89,17℃恒溫箱中保存7 d后,收集精子加入適量培養(yǎng)液,在37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后檢測蛋白磷酸化。

1.5 精子質(zhì)量檢測

1.5.1精子活力 在光學(xué)顯微鏡下,使用37℃預(yù)熱的精子計(jì)數(shù)板,觀察各組200個(gè)精子的運(yùn)動(dòng)情況,統(tǒng)計(jì)前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子的數(shù)量,前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子率=(前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子數(shù)量/200)×100%。

1.5.2質(zhì)膜完整性 采用考馬斯亮藍(lán)染色法檢測精子膜的完整性。質(zhì)膜完整的精子頂體中含蛋白質(zhì)成分可被考馬斯亮藍(lán)染液染成藍(lán)色,質(zhì)膜不完整的精子頭部則不會被染色。用光學(xué)顯微鏡觀察200個(gè)精子的染色情況,膜完整率=(染色精子數(shù)/200)×100%。

1.6 T-AOC活性測定使用T-AOC檢測試劑盒,通過比色法測定,保存豬精液T-AOC活性,比色波長為520 nm,相關(guān)操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.7 MDA含量測定使用MDA含量檢測試劑盒,通過比色法測定,保存豬精液MDA含量,比色波長為532 nm,相關(guān)操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡

1.8.1蛋白的分離和定量 全蛋白提取:每組樣品4℃、12 500×g離心5 min,用4℃ PBS清洗細(xì)胞沉淀,離心收集精子細(xì)胞,加入200 μL的蛋白裂解液,煮沸4 min。收集上清液后加入10% β-巰基乙醇沸水浴3 min,收集上清液即為蛋白樣品。Triton溶解性和非溶解性蛋白提取:在精子樣品中添加0.1% TritonX-100緩沖液,采用渦旋(5 min)和冰浴(5 min)循環(huán)30 min充分混合樣品,低溫高速離心,分離出Triton溶解性蛋白(上清)和Trtion非溶解性蛋白(沉淀),再加蛋白質(zhì)裂解液得到蛋白樣品,裂解方法與全蛋白相同。

1.8.2SDS-PAGE和免疫印跡法 蛋白質(zhì)樣品經(jīng)12%丙烯酰胺凝膠電泳分離,使用轉(zhuǎn)移電槽(10 V,12 h)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用1% BSA的TBST溶液封閉1 h后,將PVDF膜與一抗PKA底物磷酸化(1∶10 000)在4℃下孵育4 h,然后用T-TBS緩沖液洗滌。將PVDF膜與相應(yīng)的二抗在4℃下孵育2 h,再將PVDF膜用ECL孵育1 min,隨后于暗室中曝光,用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.9 免疫熒光檢測將300 μL精子樣品懸浮于10%甲醛溶液中,4℃固定至少12 h。將樣品洗滌3次后均勻涂于載玻片上,在室溫下風(fēng)干2 h。用3.7%甲醛固定20 min,用滲透液滲透10 min,再用封閉液封閉2 h,每步驟間用洗脫液洗滌5次,每次3 min。精子樣本用p-PKA抗體(1∶5 000)在4℃下孵育過夜。洗脫液洗滌一抗后,使用對應(yīng)的熒光二抗(1∶2 000)在4℃下孵育2 h。通過熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.10 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Image J圖像分析軟件檢測蛋白免疫印跡的灰度值,用Excel錄入數(shù)據(jù),采用SPSS 20軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析并對組間差異進(jìn)行多重比較,差異顯著水平設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 ZnO NPs對保存精子活力和膜完整性的影響由表1可以看出,ZnO組的精子活力與對照組無顯著性差異,而50,100,200 mg/L ZnO NPs處理組精子膜的完整性顯著高于對照組(P<0.05)。

表1 不同質(zhì)量濃度ZnO NPs對17℃保存豬精子活力和膜完整性的影響 %

2.2 ZnO NPs對保存精子抗氧化能力的影響如表2所示,與對照組相比,50,100,200 mg/L ZnO NPs處理組精子的T-AOC活性顯著提高(P<0.05)。ZnO NPs處理組的精子MDA均顯著低于對照組(P<0.05)。在保存期間,以50 mg/L ZnO NPs處理為例進(jìn)行選擇天數(shù)檢測發(fā)現(xiàn),3 d后,ZnO NPs處理組的T-AOC活性顯著高于對照組(表3),MDA含量顯著低于對照組(表4)。

表2 不同質(zhì)量濃度ZnO NPs對17℃保存豬精子T-AOC活性和MDA含量的影響

表3 不同保存時(shí)間下ZnO NPs對17℃保存豬精子T-AOC活性的影響 U/mg

表4 不同保存時(shí)間下ZnO NPs對17℃保存豬精子MDA含量的影響 μmol/L

2.3 ZnO NPs對保存精子PKA底物磷酸化的影響全蛋白可分為Triton溶解性蛋白(膜蛋白)和Triton非溶解蛋白(骨架蛋白)。由圖1可以看出,100,200 mg/L ZnO NPs處理組精子全蛋白磷酸化灰度值顯著高于對照組(P<0.05),其他處理與對照差異不顯著。豬精子蛋白磷酸化免疫定位顯示,ZnO NPs處理組的精子鞭毛中段和主段蛋白質(zhì)磷酸化修飾增強(qiáng)(圖2),這與蛋白免疫印跡結(jié)果一致。膜蛋白和骨架蛋白的磷酸化修飾變化趨勢與全蛋白質(zhì)相同,且ZnO NPs處理組的灰度值均顯著高于對照組(P<0.05,圖3,4)。

圖1 不同質(zhì)量濃度ZnO NPs對17℃保存豬精子全蛋白磷酸化影響的免疫印跡分析

A～E.ZnO NPs質(zhì)量濃度分別為0,20,50,100,200 mg/L

圖3 不同質(zhì)量濃度ZnO NPs對17℃保存豬精子Triton不溶性蛋白磷酸化影響的免疫印跡分析

2.4 ZnO NPs對cAMP/PKA通路的影響由圖5可知,ZnO NPs+H-89處理組的蛋白磷酸化水平顯著低于ZnO NPs組(P<0.05);ZnO NPs+dbcAMP處理組的蛋白磷酸化水平顯著高于ZnO NPs組(P<0.05)。添加ZnO NPs不影響dbcAMP或H-89調(diào)節(jié)精子的磷酸化,表明ZnO NPs并不干擾cAMP/PKA通路,而cAMP/PKA通路是蛋白磷酸化最重要的信號通路。p-PKAs在豬精子中的免疫定位進(jìn)一步證實(shí)了免疫蛋白印跡結(jié)果(圖6)。

圖4 不同質(zhì)量濃度ZnO NPs對Triton溶解性蛋白磷酸化影響的免疫印跡分析

1.100 mg/L ZnO NPs;2.100 mg/L ZnO NPs+1 mmol/L dbcAMP;3.對照;4.100 mg/L ZnO NPs+0.1 mmol/L H-89

A.100 mg/L ZnO NPs;B.100 mg/L ZnO NPs+1 mmol/L dbcAMP;C.對照;D.100 mg/L ZnO NPs+0.1 mmol/L H-89

3 討論

17℃保存動(dòng)物精子是一種簡單、經(jīng)濟(jì)、有效的方法,廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。但此技術(shù)由于細(xì)菌感染和氧化損傷的制約,只能有效儲存約3 d[2]。在豬精子的保存過程中會產(chǎn)生活性氧(ROS)的積累,對精子功能造成損害[2]。研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激是多種雄性生殖障礙的誘導(dǎo)因素,可通過抑制線粒體活性、降低精子活力或增加豬精子細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化的方式影響精子功能的正常發(fā)揮[11]。在精子保存稀釋液中添加抗氧化物質(zhì)可以消除精子中的MDA,減輕線粒體氧化磷酸化電子傳遞鏈的氧化損傷。ZnO NPs被證明可以保護(hù)精子膜和線粒體免受氧化應(yīng)激,而抗氧化能力的提升可以明顯改善精子在保存過程中的進(jìn)行性活力和質(zhì)膜完整性。

使用弱酸性環(huán)境保存精液可以抑制精子的運(yùn)動(dòng),使其處于可逆的靜止?fàn)顟B(tài),減少能量消耗,不失去受精的能力[12]。添加ZnO NPs后,精子活力保持穩(wěn)定狀態(tài),未誘導(dǎo)精子運(yùn)動(dòng)加速,這有利于精子的有效保存。哺乳動(dòng)物的精子必須通過糖酵解和/或氧化磷酸化途徑來產(chǎn)生ATP,以維持鞭毛的運(yùn)動(dòng)[10]。氧化磷酸化主要發(fā)生在精子中段的線粒體,糖酵解主要發(fā)生在精子的鞭毛主段。糖酵解所需的關(guān)鍵酶多集中于纖維鞘上。ZnO NPs可提高保存精子的膜完整性,對維持線粒體正常功能和糖酵解功能具有重要意義。該功能可能與ZnO NPs具有大的表面積、能夠清除ROS、降低MDA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激有關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn),ZnO NPs提高了保存精子的T-AOC,T-AOC的提高可能與精子膜的完整性有關(guān)。

通過分析精子磷酸化發(fā)現(xiàn),ZnO NPs可以保護(hù)細(xì)胞膜蛋白或細(xì)胞骨架蛋白的功能蛋白磷酸化。成熟精子是一種高度分化的細(xì)胞,其功能的調(diào)控主要通過蛋白翻譯后修飾,其中蛋白質(zhì)磷酸化是重要方式之一,蛋白磷酸化也成為反應(yīng)精子功能的重要指標(biāo)[14]。通過分析蛋白磷酸化修飾程度和位置,可為了解外源ZnO NPs對精子保護(hù)作用的分子機(jī)制及其在生殖技術(shù)中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。據(jù)報(bào)道,精子在低溫保存后細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)變化[15]。研究發(fā)現(xiàn),冷凍保存后精子的總肌動(dòng)蛋白的表達(dá)顯著下降,肌動(dòng)蛋白的位置改變,精子的體積和結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變[16]。受精前,精子需在雌性生殖道中獲能,肌動(dòng)蛋白聚合是參與哺乳動(dòng)物精子獲能的重要過程。肌動(dòng)蛋白通常在尾部區(qū)域聚合,然后發(fā)展到頭部區(qū)域,蛋白磷酸化可以調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合[17]。同時(shí),肌動(dòng)蛋白在哺乳動(dòng)物精子質(zhì)膜和頂體外膜間的定位,在精子獲能和頂體反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用[18]。

本研究發(fā)現(xiàn),ZnO NPs可以保護(hù)豬精子膜的完整性。精子頂體含有多種水解酶,當(dāng)與卵細(xì)胞融合時(shí)溶解卵細(xì)胞的保護(hù)層,促進(jìn)精子的融合和受精[19]。保持精子頂體的完整性是確保精子完成復(fù)雜的受精過程的關(guān)鍵步驟。精子的長期儲存需要考慮到豬精子具有脆弱和敏感的結(jié)構(gòu),具有低膽固醇/磷脂比,精子的結(jié)構(gòu)完整性決定精子功能的完整性[20]。通過分析精子膜蛋白的磷酸化狀態(tài)發(fā)現(xiàn),添加ZnO NPs對精子膜有較強(qiáng)的保護(hù)作用。

本研究分析了蛋白磷酸化和cAMP/PKA調(diào)控。調(diào)控精子蛋白磷酸化的信號通路是復(fù)雜而多樣的,研究最廣泛的途徑是cAMP/PKA信號通路[9]。在保存稀釋液中添加ZnO NPs并不影響cAMP/PKA調(diào)控精子蛋白磷酸化的能力。精液保存中補(bǔ)充抗氧化劑保護(hù)精子是一個(gè)重要的研究內(nèi)容。本試驗(yàn)利用精子評估了ZnO NPs作為一種替代型抗氧化劑的安全性,ZnO NPs其特有的物理和化學(xué)特性,使得外源性添加ZnO NPs可有效提高保存精子抗氧化能力,提升保存精子的膜完整性,保證了精子蛋白磷酸化正常修飾作用。

通過外源添加抗氧化劑來保護(hù)精子免受氧化應(yīng)激是當(dāng)前輔助生殖技術(shù)的重要研究課題。本研究結(jié)果表明,ZnO NPs作為公豬精液稀釋劑的補(bǔ)充物是安全可行的,有助于更全面地了解ZnO NPs對精子保護(hù)作用的分子機(jī)制。