陳 鈺,任偉綺,劉仲明,王 捷*

(1.中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州510010;2.廣東省第二人民醫(yī)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部,廣東 廣州510317)

人乳頭瘤病毒(HPV)是人類最常見的性傳播疾病病原體[1],高危亞型HPV 16是全球分布最廣的基因型。HPV DNA檢測是臨床HPV常用的檢測方法,包括核酸雜交檢測[2]、實(shí)時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)[3]、測序系統(tǒng)[4-5]等技術(shù),其中RT-PCR是當(dāng)前HPV DNA檢測運(yùn)用最廣泛的技術(shù),但需要多個溫度控制且易受背景光影響,依賴專業(yè)的設(shè)備和專業(yè)的操作人員[6]。

重組聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)降低了核酸擴(kuò)增對于溫度控制的要求,可在25～42℃恒溫條件下快速完成核酸擴(kuò)增,通過瓊脂糖凝膠電泳[7]、熒光探針法[8]、側(cè)流層析法[9]等方法進(jìn)行結(jié)果判讀,但這些方法普遍靈敏度不高。電化學(xué)發(fā)光(ECL)技術(shù)光學(xué)背景低、靈敏度高、檢測迅速、線性范圍寬[10-11],可以改善RPA方法結(jié)果分析靈敏度不高的問題[12-14]。本研究前期構(gòu)建的紙基電極-ECL檢測平臺,可以有效避免傳統(tǒng)檢測池樣本殘留導(dǎo)致的交叉污染的問題,具有成本低、易攜帶、檢測用量小、易操作等優(yōu)點(diǎn)[15-16],將RPA技術(shù)與紙基電極-ECL技術(shù)結(jié)合,初步建立了一種氣溶膠病原體的RPA-ECL檢測方法[17],敏感、特異、快捷,可檢出1.2 pg/mL乙型肝炎病毒DNA。

本研究通過對HPV 16 型DNA RPA上游引物進(jìn)行酯化釕標(biāo)記,下游引物標(biāo)記生物素,利用前期構(gòu)建的試紙條法[18]提取宮頸脫落細(xì)胞樣本HPV DNA,將模板直接洗脫在RPA反應(yīng)液中,進(jìn)行RPA等溫擴(kuò)增,經(jīng)磁分離純化后進(jìn)行紙基電化學(xué)發(fā)光檢測[15-16],獲得待測物的濃度信息。通過評估該法的特異性、準(zhǔn)確性和適用性,確認(rèn)該法檢測臨床宮頸脫落細(xì)胞樣本HPV DNA的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

含HPV 16型基因片段的質(zhì)粒、HPV核酸提取試劑盒和人乳頭瘤病毒核酸檢測試劑盒(PCR-熒光法)購自港龍生物公司;臨床宮頸脫落細(xì)胞樣本11例由南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科提供;KH2PO4、NaOH、KCl、Na2HPO4·12H2O、NaCl購自廣州化學(xué)試劑廠;硼酸購自阿拉丁;氨基修飾的RPA上游引物、生物素修飾的RPA下游引物由蘇州泓訊生物科技公司合成;鏈霉親和素偶聯(lián)磁珠(濃度為0.72 mg/mL)購自羅氏公司; TPA、酯化釕(Ru-NHS ester)購自sigma-Aldrich公司;TwistAmpTM-Basic RPA試劑盒購自TwistDx Inc公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF)購自上海麥克林公司;定性濾紙浸蠟試紙條(核酸結(jié)合區(qū)面積為2 mm×10 mm)自制;HPV裂解液(50 mmol/L Tris pH 8.0,800 mmol/L鹽酸胍,0.5% Triton X100,1% Tween-20)、HPV洗滌液(10 mmol/L Tris,pH8.0)為實(shí)驗(yàn)室自制;50 bp Ladder Marker購自東盛生物科技有限公司;瓊脂糖購自Biowest公司。MJ Mini梯度PCR儀購自BIO-RAD公司;Nanodrop 2000超微量紫外分光光度計購自Thermo Fisher Scientific公司;恒溫金屬浴、渦旋振蕩器購自CORNING公司;Whatman No.1色譜紙購自Whatman公司;SIGMA-1K5高速離心機(jī)購自Sigma-Aldrich公司;XQT-152型紙芯片電化學(xué)發(fā)光檢測儀為我單位與西安新啟特儀表儀器有限公司聯(lián)合研制;8孔磁分離架、3KD 0.5 mL Amicon Ultra 超濾管購自德國Millipore公司;TE100印刷碳電極購自臺灣禪譜科技股份有限公司;電泳儀購自BIO-RAD公司;一體化紫外凝膠成像儀購自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1RPA引物的設(shè)計 從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載HPV高危型基因組序列,通過序列比對分析,找到HPV 16型特有序列,針對L1區(qū)保守基因及RPA引物設(shè)計原則進(jìn)行引物設(shè)計;使用NCBI Blast比對引物同源性;對上游引物5’端進(jìn)行氨基(Amino C6)修飾,下游引物5’端進(jìn)行生物素(Biotin)修飾,引物序列如下:

F:NH2-GGCTCTGGGTCTACTGCAAATTTAGCCAGT;

R:Biotin-CATTATTGTGGCCCTGTGCTCG-TTGTAACC。

1.2.2酯化釕標(biāo)記氨基修飾引物及表征 用DMF配制10 mmol/L酯化釕溶液,分別以20∶1和40∶1的摩爾比與50 μL 50 μmol/L氨基修飾的RPA上游引物溶液混合,室溫下30 r/min避光顛倒混勻12 h 后轉(zhuǎn)移至超濾管,4℃ 14 000×g下離心30 min,分離游離酯化釕;將超濾管倒置以回收釕標(biāo)引物,1 000×g離心2 min,收集超濾濃縮液,重復(fù)4次。使用Nanodrop 2000紫外分光光度計在200～800 nm波長范圍內(nèi)考察特征吸收峰;在0.2～1.5 V范圍內(nèi)以0.1 V/s的速率進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)掃描,在光電倍增管高壓(PMT)1 000 V下進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測,比較兩種摩爾比釕標(biāo)引物的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。

1.2.4RPA等溫擴(kuò)增 向RPA擴(kuò)增反應(yīng)管的管蓋內(nèi)加入2.5 μL 280 mmol/L 醋酸鎂,混勻、瞬離,在38 ℃恒溫下擴(kuò)增 20 min。

1.2.5擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測 取0.9 g瓊脂糖與30 mL電泳緩沖液(0.5×TBE)混合,加熱至完全溶解,加入3 μL super red核酸染料并搖勻。將溶液一次性倒入插入梳子的凝膠模型中,靜置40 min后拔出,制成3%瓊脂糖凝膠。放入電泳槽中,倒入0.5×TBE直至液面到膠上約5 mm,取10 μL RPA擴(kuò)增產(chǎn)物與2 μL Loading Buffer混勻,小心加入凝膠孔中,并將50 bp DNA marker加入孔中,100 V下電泳1 h。通過凝膠成像儀查看電泳結(jié)果。

1.2.6擴(kuò)增產(chǎn)物磁分離、紙基電極-電化學(xué)發(fā)光檢測 取6 μL RPA 擴(kuò)增產(chǎn)物、24 μL 0.72 mg/mL鏈霉親和素磁珠和60 μL 0.01 mol/L pH 7.4 PBS 混勻;37 ℃下孵育30 min,12000×g離心2 min,通過磁分離架富集酯化釕標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物,棄上清,PBS洗滌磁珠復(fù)合物3次;將洗滌后的磁珠復(fù)合物重懸于15 μL 40 mmol/L TPA溶液中,混勻后取5 μL滴加至紙基電極上,在0.2～1.5 V范圍以0.1 V/s的速率進(jìn)行CV掃描,在PMT 1000 V下進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光檢測。

1.2.7靈敏度分析 將5×105copies/mL HPV 16質(zhì)粒進(jìn)行10倍稀釋,得到5 copies/mL～5×105copies/mL的梯度溶液,按照圖1流程檢測,根據(jù)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度分析其靈敏度。

圖1 檢測流程示意圖

1.2.8特異性及重復(fù)性分析 特異性:設(shè)置空白對照(滅菌水)、HPV陰性對照品(含人基因組DNA)、HPV 18陽性樣本、HPV 52陽性樣本、HPV 16陽性樣本,每份樣本重復(fù)3次。重復(fù)性:選擇5×102copies/mL和5×105copies/mL的HPV 16陽性質(zhì)粒,重復(fù)5次。

1.2.9方法學(xué)比較 RT-PCR方法按照港龍HPV核酸提取、檢測試劑盒說明書操作。臨床樣品檢測比較:對10例HPV臨床宮頸脫落細(xì)胞樣本進(jìn)行檢測,其中8例HPV 16型陽性樣本(5～12#),1例HPV 18型樣本(3#)、1例HPV 52型樣本(4#樣本),設(shè)置健康人宮頸脫落細(xì)胞樣本作為陰性對照(2#),滅菌水為空白對照(1#),分別用本法及RT-PCR方法進(jìn)行3次重復(fù)檢測。靈敏度比較:對已知濃度HPV 16型陽性質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋,分別根據(jù)電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度及Ct值分析檢測靈敏度。檢測時間比較:記錄本法每個步驟(包括核酸提取、RPA等溫擴(kuò)增、磁分離和電化學(xué)發(fā)光檢測)所用時間,與RT-PCR法所用時間比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 酯化釕標(biāo)記引物及表征

使用紫外-可見光吸收光譜考察酯化釕標(biāo)記引物的情況,如圖2所示,在455 nm波長處,酯化釕(100倍稀釋)、20倍摩爾比和40倍摩爾比酯化釕標(biāo)記的引物溶液均出現(xiàn)明顯的特征吸收峰,且20倍摩爾比的釕標(biāo)引物吸光度更高,滅菌水與氨基修飾引物(100倍稀釋)均未出現(xiàn)明顯的信號鋒。

圖2 引物、水、兩種摩爾比的酯化釕標(biāo)記引物和酯化釕紫外-可見光光譜

根據(jù)反應(yīng)方程式及參考相關(guān)文獻(xiàn)[17-20],根據(jù)下列公式,通過計算得到20倍摩爾比和40倍摩爾比的標(biāo)記率分別為87.21%和64.82%。

R(label ratio)=A455·MNH2-Primer·VRu32+-Primer/(ε·d·F·A260·D·VNH2-Primer)×100%。其中A455:在455 nm波長處20倍摩爾比和40倍摩爾比酯化釕標(biāo)記引物的吸光度0.142和0.092,A260:在260 nm波長處稀釋10倍的氨基修飾RPA上游引物的吸光度為2.300,MNH2-Primer=9393.2,A455=εd C,ε=13700 L/mol·cm-1,d=0.1 cm,F=33 ng/μL,VRu32+-Primer:20倍摩爾比和40倍摩爾比酯化釕標(biāo)記的引物體積分別為34 μL和39 μL,D:氨基修飾的上游引物稀釋倍數(shù)為10,VNH2-Primer:加入的上游氨基修飾引物體積為50 μL。

通過電化學(xué)發(fā)光法考察酯化釕標(biāo)記引物情況,如圖3所示,20倍摩爾比釕標(biāo)引物比40倍摩爾比釕標(biāo)引物具有更高的發(fā)光強(qiáng)度。

圖3 兩種摩爾比酯化釕標(biāo)記引物ECL響應(yīng)圖

綜合紫外分光光度法和電化學(xué)發(fā)光法結(jié)果,酯化釕與氨基修飾引物摩爾比為20∶1時釕標(biāo)記率與電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度更高,且發(fā)光強(qiáng)度足以滿足實(shí)驗(yàn)后續(xù)檢測的需要。

2.2 RPA產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

設(shè)置滅菌水為空白對照,用試紙條法對2例HPV 16型樣本、1例HPV 18型樣本、1例HPV 11型樣本進(jìn)行核酸提取,經(jīng)RPA擴(kuò)增后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖4所示。HPV 16陽性樣本在150 bp左右出現(xiàn)特異性條帶,空白對照、HPV 18型、HPV 11型在150 bp處未出現(xiàn)明顯特異性條帶,其他條帶為非特異擴(kuò)增條帶。結(jié)果說明試紙條法提取的宮頸脫落細(xì)胞中的HPV 16型DNA,經(jīng)RPA擴(kuò)增可以得到陽性結(jié)果,且特異性較好。

M:50bp Ladder Marker;1:滅菌水;2:HPV16型樣本1;3:HPV16型樣本2;4:HPV18型樣本;5:HPV11型樣本

2.3 靈敏度分析

如圖5所示,隨著HPV 16型陽性質(zhì)粒DNA濃度(5 copies/mL～5×105copies/mL)的增加,ECL發(fā)光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),最低檢出限為50 copies/mL(S/N>3)。

曲線從下到上濃度為0 copies/mL,5 copies/mL,50 copies/mL,5×102 copies/mL,5×103 copies/mL,5×104 copies/mL,5×105copies/mL

2.4 特異性及重復(fù)性

通過平行檢測空白、陰性對照、HPV18型、HPV52型、HPV16型陽性樣本的電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)情況,以考察所構(gòu)建方法的特異性。圖6顯示,干擾物質(zhì)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度遠(yuǎn)低于HPV 16型的電化學(xué)信號強(qiáng)度,對HPV 16 DNA的檢測基本不造成干擾,說明本方法特異性較好。

*空白與陰性對照比較P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;**空白與HPV 18、HPV52陽性組比較P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;***空白組與HPV 16陽性組比較P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義

檢測兩種不同濃度HPV 16 型DNA(5×102copies/mL、5×105copies/mL),每個濃度檢測5次,結(jié)果顯示相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.82%和2.28%,說明本法重復(fù)性較好。

2.5 方法學(xué)比較

臨床樣品檢測:健康人宮頸脫落細(xì)胞樣本(2#樣品)、HPV 18陽性(3#樣品)、HPV 52陽性樣本(4#樣品)與空白對照(1#樣品)的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度沒有差異,電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度約為2100,RT-PCR法無典型的擴(kuò)增曲線;8例HPV 16型陽性樣本(5～12#樣品)均能產(chǎn)生較強(qiáng)的電化學(xué)發(fā)光信號,可見典型的擴(kuò)增曲線,兩種方法具有較好的相關(guān)性,本法適用于臨床宮頸脫落細(xì)胞樣本HPV檢測,有較好的臨床應(yīng)用前景,見圖7。

1:空白,2:陰性對照,3:HPV 18型陽性樣本;4:HPV 52型陽性樣本;5～12:HPV 16型陽性樣本a:1～4#樣本比較P>0.05,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;5～12#樣本與1#樣本比較P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義

靈敏度比較:RT-PCR對HPV 16陽性質(zhì)粒的檢出限為8×102copies/mL[18],本法對HPV 16陽性質(zhì)粒的檢出限為50 copies/mL,本法檢測靈敏度高16倍。

檢測時間比較:浸蠟試紙條的制備、裂解液和洗滌液的配制、RPA反應(yīng)混合的配制、酯化釕標(biāo)記引物的過程可提前進(jìn)行準(zhǔn)備,故這部分時間不計算在內(nèi)。兩種方法檢測時間見表1,本法從樣本核酸提取到得到檢測結(jié)果時間<1 h,且無需對樣本進(jìn)行復(fù)雜的處理、無需復(fù)雜的儀器設(shè)備,極大的縮短了核酸提取的時間,在病原體即時檢測方面具有絕對優(yōu)勢。

表1 本法與RT-PCR法的HPV檢測所用時間

3 討論

常見的HPV高危亞型 HPV16,與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān),臨床上HPV檢測多為分型或定性檢測,依賴于專業(yè)檢測儀器,對實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求嚴(yán)格,因此,建立HPV 16簡便、快速、靈敏、特異的檢測方法意義重大。

本研究分別用20∶1和40∶1摩爾比的酯化釕標(biāo)記氨基修飾引物,用紫外分光光度法和電化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行釕標(biāo)引物表征,酯化釕分別在245 nm(金屬到配體電荷轉(zhuǎn)移(d →π*))、282 nm(配體內(nèi)的電荷躍遷(π→ π*))、455 nm(自旋允許的金屬到配體電荷轉(zhuǎn)移(d→π*))處有特征吸收峰[16];氨基修飾引物在260 nm(嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛雙鍵)處有特征吸收峰。氨基修飾引物通過酰胺鍵與酯化釕共價結(jié)合形成釕標(biāo)引物復(fù)合物,在455 nm處的吸收峰表明酯化釕與氨基修飾引物的結(jié)合。根據(jù)標(biāo)記率及電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)結(jié)果,最終采用20倍摩爾比的釕標(biāo)引物進(jìn)行后續(xù)RPA實(shí)驗(yàn)。

本研究利用試紙條提取核酸,通過紙基材料表面的特殊處理,對裂解液和洗滌液的組成成分或pH值、試紙條在3種溶液中的停留時間、提取時的環(huán)境溫度等因素的優(yōu)化,在保證模板質(zhì)量的前提下,大大縮短了樣本的檢測時間;利用重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)只需一個簡單的加熱裝置即可在20 min內(nèi)完成擴(kuò)增,甚至室溫條件下也可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增;利用磁性顆粒使生物素-親和素在近均相的條件下實(shí)現(xiàn)快速的反應(yīng)動力學(xué),通過外加磁場快速高效地富集擴(kuò)增產(chǎn)物;利用可拋式紙基電極,簡化操作步驟,減少試劑(樣品)用量,降低檢測成本,利用電化學(xué)發(fā)光高靈敏度、高選擇性、動態(tài)范圍寬、抗干擾能力強(qiáng)的特性[16];最終構(gòu)建的基于試紙條核酸提取和重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)的紙基電極-電化學(xué)發(fā)光分析方法,從樣本核酸提取到得到檢測結(jié)果時間<1 h,最低檢出限為50 copies/mL,具有較高的特異性、穩(wěn)定性和靈敏度,對臨床宮頸脫落細(xì)胞樣本HPV檢測分析,HPV 16型陽性樣本的電化學(xué)發(fā)光信號強(qiáng)度與陰性樣本和其他型陽性樣本有顯著差異,與RT-PCR結(jié)果一致,可用于臨床宮頸脫落細(xì)胞樣本HPV16型檢測,在即時檢測領(lǐng)域有一定的應(yīng)用前景。

功能化納米材料是提高電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的有效途徑[11,20],后續(xù)可發(fā)展納米尺度下石墨烯或貴金屬粒子與其他功能材料復(fù)合的綠色可控制備技術(shù),通過各組分的協(xié)同效應(yīng)提高傳感界面性能,實(shí)現(xiàn)核酸高靈敏檢測。