毛佳琪 張 敏 代文娟 秦加陽

濱州醫(yī)學院藥學院 山東 煙臺 264003

ε-聚賴氨酸(ε-polylysine,ε-PL)是25～35個L-賴氨酸的同型單體聚合物,具有熱穩(wěn)定好、水溶性高和pH耐受范圍廣等優(yōu)良特性,對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、絕大多數真菌和一些病毒等都有良好的抑菌活性,是我國批準使用的四種天然防腐劑之一(GB 2760-2014)[1-2]。近年來,ε-PL在醫(yī)藥、化工、電子材料、生物工程等領域也展現(xiàn)出廣闊的應用前景[3-4]。ε-PL的工業(yè)生產方法主要為微生物發(fā)酵法,生產菌株為小白鏈霉菌(Streptomycesalbulus)突變株,通常以葡萄糖和甘油為底物,目前存在產量不高、生產速度慢和轉化率低等問題,造成ε-PL生產成本較高,嚴重限制了其在食品和醫(yī)藥等領域的應用[3]。

基因工程是提高菌株生產能力的重要方法。目前,小白鏈霉菌中ε-PL的合成途徑研究較為清楚,其合成前體是L-賴氨酸,L-賴氨酸在ε-PL合成酶(polylysine synthetase,Pls)的作用下聚合生成ε-PL[5]。本課題組在研究前期利用基因工程方法在小白鏈霉菌中實現(xiàn)了Pls的過量表達,一定程度上提高了ε-PL的產量和生產速度[6]。在此基礎上,提高前體L-賴氨酸的供給是下一步基因工程改造的重要方向。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)是L-賴氨酸合成途徑中重要的輔酶,通常合成1分子L-賴氨酸需要多達4分子NADPH[7]。因此,解決NADPH供給問題可能是提高胞內L-賴氨酸濃度的有效方法。

本研究化學合成了來自變異鏈球菌的一種特殊的依賴于NADP的三磷酸甘油醛脫氫酶(NADP-dependent glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GapN),構建了GapN誘導型表達的小白鏈霉菌基因工程菌,通過添加不同濃度的纖維二糖調控GapN的表達水平,提高胞內NADPH濃度,研究其對ε-PL產量的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒和引物 本研究所用菌株、質粒和引物見表1。

表1 本研究用到的菌株、質粒和引物

1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基成分為胰蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,氯化鈉10 g/L。MS固體培養(yǎng)基成分為甘露醇20 g/L,黃豆粉20 g/L,瓊脂粉20 g/L。種子培養(yǎng)基成分為甘露醇50 g/L,(NH4)2SO410 g/L,酵母粉5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,K2HPO40.8 g/L,K2HPO41.36 g/L,FeSO4·7H2O 0.03 g/L,ZnSO4·7H2O 0.04 g/L,pH 6.8。發(fā)酵培養(yǎng)基成分為種子培養(yǎng)基添加檸檬酸鈉5 g/L,纖維二糖0、0.007 5、0.03或0.6 mM。2×YT培養(yǎng)基成分為胰蛋白胨16 g/L,酵母粉10 g/L和氯化鈉5 g/L。抗性菌株培養(yǎng)和篩選時添加抗生素的濃度分別為安普霉素80 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氯霉素50 μg/mL、萘啶酮酸25 μg/mL。

1.3 GapN誘導型表達菌株的構建 以含有密碼子優(yōu)化的gapN基因的質粒pUC57-gapN為模板,使用引物RS2-gapN-F和RS2-gapN-R(表1)擴增得到gapN基因片段。PCR反應條件為:95℃ 15 s,55℃ 15 s,72℃ 1 min,30個循環(huán)。將gapN基因片段與NdeI和EcoR I雙酶切的pSET152-Cel-RS2-neo質粒做無縫克隆后轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,篩選正確連接的轉化子并測序驗證,得到重組表達質粒pSET152-Cel-RS2-gapN(圖1)。將構建好的質粒利用接合轉移轉入S.albulusCICC11022[6],置30℃培養(yǎng)約5～7 d后可看到抗性接合孢子,培養(yǎng)該孢子得到基因工程菌株S.albulusQ-gapN-Cel。

圖1 pSET152-Cel-RS2-gapN質粒構建過程

1.4 菌株培養(yǎng)和發(fā)酵比較 將S.albulusQ-gapN-Cel和對照菌株S.albulusQ-152分別在MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5～7 d,收集孢子接種于50 mL 種子培養(yǎng)基中,在30℃和220 rpm下培養(yǎng)48 h得到種子培養(yǎng)液;然后按10%的接種比例將種子培養(yǎng)液接種于50 mL含有不同濃度纖維二糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中,在30℃和220 rpm下培養(yǎng)96 h,收集菌體檢測gapN基因表達水平和胞內NADPH濃度,并測定菌體生長和ε-PL產量。

1.5gapN基因表達水平檢測 采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)方法研究不同纖維二糖添加量對gapN基因表達水平的影響[6]。收集菌體,使用RNAiso Plus(寶生物)提取總RNA;使用EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金)獲得cDNA;qRT-PCR反應使用Hieff UNICON?Universal Blue qPCR SYBR Master Mix(翌圣)在LightCycler 96儀器(羅氏)上進行。選擇RNA聚合酶sigma因子(hrdB)作為內參基因。gapN和hrdB基因qRT-PCR的引物對分別為RT-gapN-F/RT-gapN-R和RT-hrdB-F/RT-hrdB-R(表1),反應條件為95℃ 10 s,60℃ 30 s,40個循環(huán)。相對基因表達數據采用2-ΔΔCt方法進行分析,所有的qRT-PCR檢測均采用3個生物學重復和3個技術重復進行。

1.6 檢測和分析方法 使用WST-8 NADP+/NADPH檢測試劑盒(碧云天)測定胞內NADPH濃度,使用增強型BCA蛋白檢測試劑盒(碧云天)測定細胞的蛋白濃度,計算每微克蛋白質的NADPH含量。通過在分光光度計中檢測樣品在600 nm的光密度來測定菌體生長情況。采用甲基橙比色法檢測發(fā)酵液中ε-PL的產量[5]。采用SnapGene 5(GSL Biotech, www.snapgene.com)進行引物設計、DNA序列分析和質粒圖繪制等工作。采用GraphPad Prism 8繪制發(fā)酵柱狀圖并進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1 GapN誘導型表達小白鏈霉菌基因工程菌株的構建 PCR擴增得到的gapN基因大小約為1.5 kb,利用NdeI/EcoR I雙酶切pSET152-Cel-RS2-neo后純化得到的載體框架約為8 kb(圖2A),均符合預期。無縫克隆后大腸桿菌轉化子的篩選結果如圖2B所示,所挑選的3個轉化子均擴增出了目標條帶。提取3個轉化子質粒后利用NdeI/EcoR I雙酶切驗證,均出現(xiàn)了約8 kb的質粒條帶和1.5 kb的gapN基因。將所得1號質粒送上海生工進行測序驗證,結果與目標序列100%一致。這表明:成功構建了重組表達質粒pSET152-Cel-RS2-gapN。接下來,將該質粒成功轉入E.coliET12567/pUZ8002,又利用接合轉移轉入S.albulusCICC11022,所得菌株命名為S.albulusQ-gapN-Cel,即為GapN誘導型表達小白鏈霉菌基因工程菌,用于后續(xù)實驗。

A.gapN基因和載體框架的制備。泳道1為gapN基因PCR擴增產物純化結果;泳道2為Nde I/EcoR I雙酶切pSET152-Cel-RS2-neo后純化得到的載體框架。B.PCR和雙酶切方法篩選正確的轉化子。泳道1～3為挑選的三個轉化子的PCR結果;泳道4為PCR篩選的陽性對照;泳道5為PCR篩選的陰性對照;泳道6～8為挑選的三個轉化子的雙酶切結果;泳道9為gapN基因雙酶切結果;泳道10為pSET152-Cel-RS2-neo質粒雙酶切結果。

2.2 纖維二糖添加量對gapN基因表達和NADPH濃度的影響 將GapN誘導型表達菌株Q-gapN-Cel在不添加纖維二糖時gapN基因的表達量定義為1,添加0.007 5、0.03和0.6 mM纖維二糖時gapN基因的表達量分別為1.35、1.85和2.62(圖3A)。這表明,該菌株中gapN基因的表達水平與纖維二糖的添加量呈正相關。胞內NADPH濃度檢測結果顯示:GapN誘導型表達菌株Q-gapN-Cel在添加不同濃度纖維二糖情況下胞內NADPH濃度顯著高于對照菌株Q-152;添加0.03 mM纖維二糖時胞內NADPH濃度最高,纖維二糖濃度增加到0.6 mM時胞內NADPH濃度開始下降,但仍高于對照菌株;不添加纖維二糖時Q-gapN-Cel胞內NADPH濃度也高于對照菌株,這表明,該誘導表達系統(tǒng)存在泄漏表達(圖3B)。

**P<0.01,****P<0.0001。

2.3gapN基因表達水平對菌體生長和ε-PL產量的影響 如圖4所示,GapN誘導型表達菌株S.albulusQ-gapN-Cel在添加0、0.007 5、0.03和0.6 mM纖維二糖時的OD值分別為14.62、14.73、15.22和13.98,均顯著低于對照菌株S.albulusQ-152的OD值17.95。雖然菌體生長能力不如對照菌株,GapN誘導型表達菌株S.albulusQ-gapN-Cel在添加0、0.007 5和0.03 mM纖維二糖時ε-PL的產量分別為0.54、0.88和0.96 g/L,分別比對照菌株Q-152的產量0.38 g/L高42.1%、131.6%和152.6%,但是當纖維二糖的添加量為0.6 mM時,菌株Q-gapN-Cel的ε-PL產量僅為0.14 g/L,比對照菌株低63.2%。這表明:GapN表達水平對小白鏈霉菌生產ε-PL有顯著影響,通過控制GapN的表達水平能夠有效提高小白鏈霉菌發(fā)酵生產ε-PL的能力。

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001。

3 討論

輔酶參與許多胞內反應,并對氧化還原平衡和細胞代謝產生重要影響[9]。輔酶工程是微生物代謝工程的一個有效途徑,通常利用基因工程方法改變胞內輔酶供應或者修改酶的輔酶偏好性,實現(xiàn)目標產物的高效生產[10]。在L-賴氨酸的生物合成途徑中,NADPH是一種重要的輔酶,通過提高胞內NADPH供給或降低NADPH需求均能提高谷氨酸棒桿菌合成L-賴氨酸的能力[7,11-12]。L-賴氨酸是ε-PL生物合成的前體,在小白鏈霉菌提高NADPH的供給能否提高ε-PL的產量有待研究。

3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GapA)是糖酵解途徑的關鍵酶之一,它催化三磷酸甘油醛到1,3-二磷酸甘油酸的反應,同時將NAD還原為NADH。然而,在自然界一些物種如變異鏈球菌中存在一種特殊的依賴于NADP的三磷酸甘油醛脫氫酶GapN,其催化三磷酸甘油醛不可逆氧化為三磷酸甘油酸,并將NADP還原為NADPH[12]。本研究構建了異源GapN誘導型表達的小白鏈霉菌基因工程菌株。本研究發(fā)現(xiàn),GapN表達能夠顯著提高胞內NADPH濃度,隨著GapN表達水平的提高,ε-PL的產量先增加后降低。其可能的機制為,GapN能夠與胞內原有的GapA競爭底物3-磷酸甘油醛,從而提高胞內NADPH的含量,同時會造成胞內NADH含量的降低(圖5)。雖然NADPH含量的提高可能有利于L-賴氨酸的合成,但NADH可以經過呼吸鏈產生ATP,NADH含量的降低可能影響ATP的再生,由于L-賴氨酸聚合為ε-PL需要較多ATP[3],因此,胞內NADPH的濃度不宜過高,只有適當提高胞內NADPH濃度,同時不影響ε-PL聚合對ATP的需求時才能提高ε-PL的產量。

G3P,3-磷酸甘油醛;1,3-PG,1,3-二磷酸甘油酸;3PG,3-磷酸甘油酸;紅色虛線,本研究引入的代謝途徑;綠色實線,小白鏈霉菌原有代謝途徑

綜上所述,GapN表達水平對小白鏈霉菌生產ε-PL有顯著影響,通過控制GapN的表達水平能夠有效提高小白鏈霉菌發(fā)酵生產ε-PL的能力。本研究為利用基因工程方法提高ε-PL的產量提供了新的靶點。