王翔 趙琛 閆舟 張琛浩 曹睿

摘要：為研究4 種薔薇屬植物（毛萼薔薇、大花香水月季、維西薔薇、麗江薔薇）的抗寒性差異，以篩選出耐寒性強(qiáng)的品種，利用低溫培養(yǎng)箱進(jìn)行不同梯度低溫（0、-5、-10、-15 ℃）脅迫處理，測定4 種薔薇屬植物可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、丙二醛含量、脯氨酸（Pro）含量、SOD 活性、POD 活性及耐寒相關(guān)調(diào)控基因HSP90 的表達(dá)差異。結(jié)果表明，在低溫脅迫下，4 種薔薇屬植物葉片可溶性蛋白含量、可溶性糖含量、游離脯氨酸含量、丙二醛含量、SOD 活性和POD 活性均隨低溫脅迫加劇呈現(xiàn)逐漸升高趨勢。對4 種薔薇屬植物HSP90 基因的差異表達(dá)分析表明，該基因在4 種植物中的相對表達(dá)量隨低溫脅迫加劇呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，其中，毛萼薔薇在0、-5、-10、-15 ℃低溫脅迫下HSP90 基因表達(dá)量均最高。表明4 種薔薇屬植物的抗寒性存在差異，其中，毛萼薔薇的抗寒性較好。

關(guān)鍵詞：薔薇屬；生理變化；低溫脅迫；基因差異表達(dá)

中圖分類號：S685.12 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1002?2481（2023）03?0241?08

月季（Rosa hybrida） 是薔薇屬（Rosa） 多年生木本花卉，素有“花中皇后”之美譽(yù)，因其花色豐富、品種繁多而深受人們喜愛。月季具有花期相對較長、適應(yīng)性廣的特征，讓其名列我國十大名花，在盆栽以及地栽等場景廣泛栽種，有著巨大的市場潛力。近些年，隨著現(xiàn)代月季品種性狀改良的不斷發(fā)展，低溫環(huán)境對于月季品質(zhì)所產(chǎn)生的影響不斷增加，諸如低溫會造成枝條發(fā)育受到限制、花瓣出現(xiàn)畸形等問題，給馴化和培育種植帶來了更多挑戰(zhàn)。當(dāng)前，冬季環(huán)境下顯著偏低的溫度極大影響到花卉的品質(zhì)，因此，選擇和培育有耐寒特征的月季品種，是加強(qiáng)月季推廣的重要方式[1-6]。低溫會極大影響到植株的生長與分布，對于植物發(fā)育所產(chǎn)生的影響會顯著大于其他環(huán)境因素[7-9]。低溫脅迫一方面會顯著影響到植株生物量等關(guān)鍵因素，另一方面還會造成代謝紊亂，在超低溫的環(huán)境下還可能導(dǎo)致植株出現(xiàn)死亡[10]。有研究結(jié)果表明，植物在識別到外部環(huán)境溫度過低時，會自發(fā)啟動防御，隨之而促成細(xì)胞膜透性的提升，因此，產(chǎn)生活性氧，保護(hù)酶也較為快速地增多，滲透調(diào)控物質(zhì)SP、SS 與Pro[11]以及MDA含量增加[12]，而與代謝有密切聯(lián)系的生理活動會遭遇顯著抑制[13]。在植物抗寒性的分析中， LT50與相關(guān)生理指標(biāo)通常被視為抗寒性的重要指標(biāo)[14-15]。植物在低溫環(huán)境中的生理與生化表現(xiàn)可能會因各種基因的調(diào)控機(jī)制產(chǎn)生轉(zhuǎn)變，并再度誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步避免逆境損害的出現(xiàn)[16]。HSPs（熱激蛋白）對外界環(huán)境變化敏感，在逆境脅迫下高表達(dá)的HSPs 對細(xì)胞可能起到一定保護(hù)作用[17]，提高機(jī)體對逆境的適應(yīng)能力，從而增強(qiáng)抗逆性。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，HSP 熱激蛋白會在相關(guān)脅迫中產(chǎn)生顯著的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)效果[18]。目前特定基因的表達(dá)研究在低溫響應(yīng)機(jī)制、重要基因挖掘等領(lǐng)域取得了很多成果，廣泛運(yùn)用到擬南芥[19]、小麥[20]等各類作物的分析中。當(dāng)前科學(xué)家尋找到數(shù)百個基因?qū)τ趹?yīng)答反應(yīng)會產(chǎn)生巨大的影響，XU 等[21]通過對野生山葡萄開展深度分析，得出其依靠管控相關(guān)基因的差異表達(dá)，進(jìn)而應(yīng)對外界的寒冷環(huán)境。中外學(xué)者圍繞抗寒性的分析，多數(shù)是關(guān)于生理指標(biāo)的對比性分析[22-23]，而圍繞抗寒機(jī)制開展分子水平研究顯著偏少。

為更加深入研究月季抗寒原理，本研究選擇4 種薔薇屬植物，分析低溫脅迫中HSP90 基因表達(dá)變化和相關(guān)生理指標(biāo)差異，為探究分析月季抗寒機(jī)制與品種選育提供一定的數(shù)據(jù)支撐，以期為月季栽培推廣提供支持。

1材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用毛萼薔薇（R. lasiosepala）（編號S1）、大花香水月季（R. odorata. var. gigantea）（編號S2）、維西薔薇（R. weisiensis）（編號S3）和麗江薔薇（R. lichiangensis）（編號S4）4 種薔薇屬植物的盆栽苗為研究對象，均來自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所薔薇屬種質(zhì)資源圃，為3 年生嫁接植株，植株生長健壯。

1.2 試驗(yàn)方法

2020 年12 月，選定發(fā)育無異常、長勢較為接近的扦插苗54 株分別栽入到花盆，放在溫室（溫度設(shè)定為25 ℃，濕度設(shè)定為65%，光強(qiáng)為200 lx，光周期為14 h 光照/10 h 黑暗）中持續(xù)培育14 d。每個處理選用3 株，每個處理3 次重復(fù)。分別在人工低溫氣候箱進(jìn)行0、-5、-10、-15 ℃低溫下脅迫2 h，從各處理植株選取成熟葉片，用于半致死溫度和各相關(guān)生理指標(biāo)的測定。同時迅速取各植株頂端幼嫩葉片裝入到離心管中，立即投入到液氮中降溫速凍后，置于-80 ℃ 冰箱中保存，用于RNA 的提取和qPCR 試驗(yàn)。以上試驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 生理生化指標(biāo)的測定 參考陳建勛等[24]方法測定丙二醛（MDA）含量、游離脯氨酸（Pro）含量、SOD 活性、POD 活性與可溶性糖（SS）含量、可溶性蛋白（SP）含量。

1.3.2 總RNA 提取與cDNA 合成 使用RNA ExtractionKit（大連Takara）提取得到各植株葉片的總RNA。使用NanoDrop 2000 測定獲得具體的RNA純度、完整性以及RIN 值。然后使用qPCR 逆轉(zhuǎn)錄盒PrimeScript TMRT reagent Kit（大連Takara）合成cDNA，具體流程詳見相應(yīng)說明書。

1.3.3 qPCR 候選基因與引物設(shè)計(jì) 參考李瑞雪等[25]所提出的方法，完成HSP90 基因差異表達(dá)研究，應(yīng)用qPCR 分析使用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（大連Takara），結(jié)合說明書的流程穩(wěn)定推進(jìn)。參照文獻(xiàn)[26]的方法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)采用Excel 2016、SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對薔薇屬植物L(fēng)T50的影響

不同薔薇屬植物的LT50比較結(jié)果如圖1 所示。

由圖1 可知，4 種薔薇屬植物L(fēng)T50 為-18.87～-10.52 ℃，而S1 與S2 的半致死溫度均低于-15 ℃，S3 與S4 的半致死溫度低于-10 ℃，但高于-15 ℃?？梢? 種薔薇屬植物的LT50 指標(biāo)從小到大依次為S1

2.2 低溫脅迫對薔薇屬植物可溶性蛋白含量的影響

由圖2 可知，在0 ℃環(huán)境下開展低溫脅迫，4 種薔薇屬植物葉片的SP 指標(biāo)差異顯著，可溶性蛋白含量隨著溫度降低呈現(xiàn)上升趨勢。S1、S2 與S3 的可溶性蛋白含量在-15 ℃脅迫下達(dá)到了峰值，S4 則是-10 ℃脅迫下達(dá)到峰值。在峰值時，SP 含量由高到低依次為S1>S2>S3>S4，與0 ℃ 低溫脅迫時相比，4 種植株增長最低為127%，最高為142%?？梢钥闯觯琇T50更低的薔薇屬植物，其SP 指標(biāo)的上升幅度更高。

2.3 低溫脅迫對薔薇屬植物可溶性糖含量的影響

低溫下4 種薔薇屬植物可溶性糖含量的變化如圖3 所示。

由圖3 可知，4 種薔薇屬植物葉片的SS 指標(biāo)隨著脅迫溫度降低而逐漸升高。在0 ℃低溫脅迫時，各品種間的可溶性糖含量差異顯著（P<0.05），其中，S1 的SS 含量顯著高于其他薔薇屬植物。在-15 ℃脅迫下，4 種薔薇屬植物可溶性糖含量表現(xiàn)為S1>S2>S3>S4，與0 ℃低溫脅迫時相比，4 種薔薇屬植物最大增長47%，最小增長19%，可見，LT50更低的植株在低溫狀況下積累的SS 更多。

2.4 低溫脅迫對薔薇屬植物游離脯氨酸含量的影響

在低溫脅迫的影響下，4 種植株的Pro 含量呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢（圖4）。在-15 ℃時，Pro 含量均達(dá)到峰值，具體表現(xiàn)為S1>S2>S3>S4，和0 ℃低溫脅迫相比，4 種植株樣本最高增加了382%，最低增加了299%，可見不同的樣本在低溫脅迫下Pro含量有顯著差異（P<0.05）。

2.5 低溫脅迫對薔薇屬植物丙二醛含量的影響

低溫下4 種薔薇屬植物丙二醛含量的變化如圖5 所示。

由圖5 可知，4 種薔薇屬植物丙二醛含量表現(xiàn)出不斷上升的趨勢。低溫脅迫中，LT50 相對較低的植株MDA 含量更低。4 種薔薇屬植物在0 ℃低溫脅迫下的MDA 含量差異顯著（P<0.05）。并且隨著脅迫溫度的降低，MDA 含量也不斷增加，在-15 ℃ 脅迫下達(dá)到峰值；LT50 相對較高的植物在低溫脅迫下會有著更高的MDA 積累。在不同低溫脅迫下，MDA 含量均表現(xiàn)為S2

2.6 低溫脅迫對SOD 和POD 活性的影響

由圖6、7 可知，在低溫脅迫下，4 種植物SOD 與POD 活性的變化趨勢較為相似，表現(xiàn)為S1、S2 呈現(xiàn)持續(xù)上升，S3、S4 則是先上升后下降的變化趨勢，同時4 種植株的SOD 與POD 活性在接近LT50溫度會有顯著下降（P<0.05）。0 ℃低溫脅迫時，S1 的SOD與POD 活性顯著降低（P<0.05），并且4 種植物的差異顯著；在-5 ℃低溫脅迫下，仍表現(xiàn)為類似的變化趨勢，-10 ℃低溫脅迫下S2 與S3 的SOD 活性非常接近，相對于0 ℃ 下增幅分別為62% 與47%，而POD 活性相較于0 ℃時增幅分別為106% 與75%，S1、S2 的SOD、POD 活性在-15 ℃低溫脅迫下活性較高，S3、S4 的SOD 與POD 活性則出現(xiàn)了一定程度的下降，并且4 種植物的差異顯著（P<0.05）。

2.7 低溫脅迫對HSP90 基因表達(dá)差異的影響

從圖8 可以看出，低溫脅迫下HSP90 在4 種薔薇屬植物葉片中的具體表達(dá)會有持續(xù)提升的變化。0 ℃脅迫情況下，HSP90 基因的相對表達(dá)量在4 種植物間差距較??；在-5 ℃ 脅迫下，4 種植物為更好地減少低溫負(fù)面影響，會開啟內(nèi)部的耐寒基因；接近-10 ℃脅迫下，4 種植物的實(shí)際表達(dá)會再度產(chǎn)生激活；而-15 ℃脅迫下，基因產(chǎn)生了深度的激活。相關(guān)低溫影響下，HSP90 的表達(dá)表現(xiàn)為S1>S2>S3>S4，可見4 種薔薇屬植物通過HSP90 的表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)而更加有效地應(yīng)對低溫環(huán)境，而且該基因表達(dá)更高的植物會表現(xiàn)出越強(qiáng)的耐寒性。

3結(jié)論與討論

3.1 葉片低溫半致死溫度與抗寒性

低溫脅迫的影響下，植物會產(chǎn)生相關(guān)的生理生化變動，進(jìn)一步更好地應(yīng)對外部的低溫環(huán)境[27-28]。LT50能夠較為精準(zhǔn)地表現(xiàn)抗寒性能，該指標(biāo)更低則意味著抗寒性更優(yōu)秀[29]。溫度低于LT50的情況下，植物細(xì)胞會產(chǎn)生較為迅速的結(jié)冰，生理代謝機(jī)制會產(chǎn)生轉(zhuǎn)變，會有相關(guān)的凍害現(xiàn)象，使得植株遭遇的傷害也難以恢復(fù)[30]。因此，LT50 能夠充當(dāng)作物遭遇無法逆轉(zhuǎn)損害的閾值。本研究表明，4 種薔薇屬植物L(fēng)T50 在-18.87～ -10.52 ℃ ，從低至高的依次是S1

3.2 葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量與抗寒性

可溶性蛋白（SP）是植物必不可少的一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，和植物耐寒性有著十分緊密的聯(lián)系[31]。有研究顯示，Hsp 家族熱激蛋白等的引導(dǎo)使得可溶性蛋白會出現(xiàn)一定的改變，在植物響應(yīng)低溫脅迫信號過程中具有極為關(guān)鍵的作用 [32]。而可溶性蛋白含量的提升可促使下游物質(zhì)合成進(jìn)而為植物響應(yīng)低溫脅迫給予相應(yīng)的物質(zhì)以及能量，并有效地提升在低溫下的生存率[33]。在低溫環(huán)境下，糖類代謝往往是用于調(diào)控生物合成以及蛋白質(zhì)分解間的平衡，可溶性蛋白的水解要有非常多的蛋白水解酶如Clp蛋白酶和以及ATP 蛋白酶，從而讓多肽不可逆轉(zhuǎn)地去生成可溶性糖[34]。本研究表明，4 種薔薇屬植物可溶性蛋白含量在低溫脅迫中表現(xiàn)出不斷增加的態(tài)勢，抗寒性越強(qiáng)的材料在接收到外界環(huán)境的低溫信號下，對應(yīng)的蛋白質(zhì)增加幅度以及分解糖的效率會更高，這就意味著抗寒性越高的材料在接收到冷信號后可以迅速地提高細(xì)胞液濃度，并不斷把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成糖，經(jīng)過可溶性蛋白去帶動相應(yīng)的生理反應(yīng)，可溶性蛋白的轉(zhuǎn)移對其余物質(zhì)的合成有著十分關(guān)鍵的作用，使植物可以快速進(jìn)行冷應(yīng)激反應(yīng)，并有效地適應(yīng)低溫環(huán)境，這和以往杜鵑[35]、鳶尾[36]、木蘭[25]等植物的研究結(jié)果是一致的。

植物在低溫環(huán)境中可以經(jīng)過降低游離Pro 含量，有效地提升自身抗寒性能[37]。在低溫脅迫之后，游離Pro 經(jīng)過對蛋白質(zhì)的水合作用， 能夠有效地確保其細(xì)胞空間結(jié)構(gòu)不會受到不利影響，從而完成對植物的有效保護(hù)[38]。XIN 等[39]對擬南芥的研究表明，高濃度脯氨酸是抗凍性提升的一個核心因素。在本研究中，4 種薔薇屬植物的Pro 含量伴隨溫度的下降表現(xiàn)出不斷增加的態(tài)勢，LT50 較低的S1和S2 其Pro 峰值位于-20 ℃左右，同時在低溫時期其游離脯氨酸含量要明顯的超過其余薔薇屬植株，這和李瑞雪等[25]所研究的低溫環(huán)境下植物生理行為變化的結(jié)論一致，LT50 產(chǎn)生時間越晚，植物所累積的Pro 就越多，耐寒性能就越高，但隨著低溫脅迫的不斷加大，酶系統(tǒng)遭到破壞，葉片Pro 合成速率下降或者其降解速率提高，進(jìn)而會使得Pro 含量出現(xiàn)降低的變化。

植物在低溫情況下，經(jīng)過生成可溶性糖含量來提升細(xì)胞組織的滲透勢，從而讓結(jié)冰點(diǎn)降低，避免過度脫水，免受低溫影響[40]。本研究表明，伴隨溫度的不斷下降，4 種薔薇屬植物的SS 含量表現(xiàn)為不斷提高，這與在玉米、番茄[41]和甘蔗[42]上研究結(jié)論是相同的。LT50 最低的S1 對應(yīng)的SS 含量要明顯超過其余薔薇屬植物，抗寒性最高；第二為S2，而S4 的SS 最小，這意味著LT50 越低的品種低溫所生成的SS 越多，抗寒性能越高，這和李瑞雪等[25]在木蘭科植物上得到的研究結(jié)論相同。

3.3 葉片丙二醛和抗氧化酶活性與抗寒性

低溫脅迫能夠讓胞內(nèi)活性氧（ROS）迅速生成，從而誘導(dǎo)膜脂過氧化，并進(jìn)一步導(dǎo)致丙二醛（MDA）不斷積累[43]。CAMPOS 等[44]研究表明，可將MDA 含量當(dāng)做判斷植物受到低溫傷害程度的一個關(guān)鍵指標(biāo)[45]。在本研究中，4 種薔薇屬植物葉片MDA 含量伴隨溫度的下降表現(xiàn)出持續(xù)提高的趨勢，可見植物膜質(zhì)過氧化程度逐漸加重，LT50 越低的植物對應(yīng)葉片MDA 含量提升的迅速越慢。LT50最低的S1 葉片在低溫階段MDA 一直保持在一個比較低的水平，這表明S1 在低溫脅迫下膜脂過氧化水平比較弱，也就是其抗寒性能較強(qiáng)。并且MDA增幅的程度和4 種植物抗寒性能具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，這和鄧仁菊等[46]、WANG 等[47]和朱曉非等[22]得出的結(jié)論是相似的。SOD 以及POD 能夠有效去除氧自由基，從而維護(hù)植株的正常生理功能，并提高它們的抗寒能力[48]。此外，4 種薔薇屬植物整體表現(xiàn)出提升的變化趨勢，SOD 以及POD 活性的提升能夠有效地降低低溫環(huán)境對生物膜的損害，這意味著植株對低溫會出現(xiàn)相應(yīng)的響應(yīng)。不過MDA 含量的提升表明伴隨溫度的持續(xù)下降，葉片膜脂過氧化水平也越來越高。在-5～-10 ℃情況下，LT50 低的S1以及S2 葉片SOD、POD 活性較其余2 種薔薇屬植物更小，可能由于植株自身具有抵抗低溫的功能，并不需要憑借保護(hù)酶去提高對植株的保護(hù)。伴隨溫度的不斷下降，S1 以及S2 葉片中SOD、POD 活性被激活從而防御低溫傷害。這表明重度低溫脅迫會阻礙植株的抗氧化酶活性，進(jìn)而讓細(xì)胞遭受損傷，在LT50 范圍內(nèi)SOD 以及POD 活性的提升能夠有效地防止低溫對細(xì)胞帶來的損害。

3.4 抗寒相關(guān)調(diào)節(jié)基因HSP90 與抗寒性

低溫是干擾植物生長發(fā)育的一個重要因素，植物具備不同的防御機(jī)制去抵御寒冷的傷害[47，49-50]。通過轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)是最高效的防御應(yīng)答反應(yīng)之一，組成了植物復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵部分[51]。很多研究顯示，各種熱休克蛋白HSPs 轉(zhuǎn)錄因子在溫度感知以及信號處理中有著不可替代的關(guān)鍵作用，熱激轉(zhuǎn)錄因子HSP 在逆境脅迫下和熱激元件（HSE）識別并進(jìn)行組合，進(jìn)而帶動下游基因HSP 的轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)[52]，對植物抵御逆境傷害以及其余生理行為有著重要意義。HSP90 為HSPs 的一部分，是類固醇受體的重要部分，可以促使目標(biāo)蛋白的積累以及激酶的激活，整合質(zhì)體信號通路，調(diào)節(jié)CBF 和COR 表達(dá)[53]。有研究顯示，低溫環(huán)境可以有效地促使HSP90 基因表達(dá)，從而調(diào)整擬南芥幼苗的生長發(fā)育[47]。在低溫環(huán)境中，經(jīng)過促使HSP 基因過量表達(dá)去去除多余的活性氧，進(jìn)而防止氧化脅迫帶來的影響[54]。本研究中，HSP90 基因相對表達(dá)量隨著低溫脅迫溫度的降低，整體表現(xiàn)出不斷增加的態(tài)勢，這種表達(dá)方式和SP、Pro、SOD、POD 在 4 種薔薇屬植株中的變化基本一致，意味著HSP90 會參加到目標(biāo)蛋白的積累過程中。在0 ℃下，HSP90 基因在4 種植株間的表達(dá)量差異不太明顯，伴隨低溫脅迫的不斷加大，該基因在葉片中的表達(dá)也不斷提高。低溫時，耐寒種質(zhì)S1 以及S2 中HSP90 的表達(dá)量一直都位于最高。這意味著4 種薔薇屬植物抗寒性強(qiáng)度不同對低溫的應(yīng)答機(jī)制也就有所不同，耐寒性越高的植株為防范低溫帶來的損傷，會更加迅速地開啟低溫應(yīng)答機(jī)制，激活HSP90 進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)一步讓下游和耐寒有關(guān)的基因完成表達(dá)，提高ROS 清除力度，降低氧化脅迫帶來的影響[55]，這種隨低溫脅迫時間不斷增加，轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)越來越強(qiáng)的狀況在短枝木麻黃[26]和木蘭科植物[25]等研究中也有類似的結(jié)論。

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