黃婷婷，王若楠，高展，孫繼超，馬瑩，張恒，賈春江，徐政虎，苑世領(lǐng)，劉剛

山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，濟(jì)南 250100

1 引言

“菠菜葉中色素的提取與分離”是大學(xué)有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)課程及中學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的經(jīng)典項(xiàng)目之一。菠菜葉中不同色素呈現(xiàn)不同顏色，可以形象、生動地展示色素分離過程，在幫助學(xué)生認(rèn)識天然化合物、理解色譜分離基本原理[1]、掌握薄層色譜和柱色譜等基本實(shí)驗(yàn)操作技能、激發(fā)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣[2]等方面發(fā)揮了重要作用。

自從1985年葉綠素的提取及分離實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)在教學(xué)課本之后[3]，教育工作者對該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了大量的優(yōu)化改進(jìn)[4-13]。該實(shí)驗(yàn)也先后被收錄到大學(xué)本科的有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教材中，如汪志勇等人主編的《實(shí)用有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)高級教程》、查正根等人主編的《有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)》、侯士聰?shù)热酥骶幍摹痘A(chǔ)有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)》等[14-23]。但是，其實(shí)際教學(xué)效果仍然不盡如人意，特別是在4-6學(xué)時(shí)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)中，仍然存在著大量使用甲醇、苯等毒性較大的試劑[4-13]、實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣[12]、用時(shí)較長、試劑用量大[13]、分離效果不佳[4,8]等問題。

為進(jìn)一步解決本實(shí)驗(yàn)在實(shí)際教學(xué)中暴露出的問題，提高該實(shí)驗(yàn)的實(shí)際教學(xué)效果，本文系統(tǒng)總結(jié)了目前已提出的色素分離方法，對比分析了實(shí)際色素分離效果，通過優(yōu)化薄層色譜展開劑、改進(jìn)柱色譜流動相組成，制定了耗時(shí)更短、試劑更友好、分離效果更理想的菠菜葉色素提取與分離實(shí)驗(yàn)方案。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

菠菜中含有葉綠素、葉黃素和胡蘿卜素等多種天然色素。葉綠素主要存在葉綠素a(C55H72N4O5Mg)和葉綠素b (C55H70O6N4Mg)兩種結(jié)構(gòu)相似的形式。胡蘿卜素(C40H56)是一類長鏈多烯類的化合物。葉黃素(C40H56O2)是胡蘿卜素的衍生物。圖1為各色素的分子結(jié)構(gòu)示意圖。色素各組成存在明顯的極性差異，極性從小到大依次為胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b、葉黃素。

圖1 葉綠素a、葉綠素b、α-胡蘿卜素、葉黃素和β-胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)式

本實(shí)驗(yàn)從菠菜葉中提取色素，利用各色素的極性差異，通過薄層色譜法和柱色譜法進(jìn)行分離、鑒定和提純。薄層色譜實(shí)驗(yàn)中，因各色素的極性差異，層析板上的硅膠對各色素組分的吸附能力不同，當(dāng)展開劑流過硅膠板時(shí)，不同色素連續(xù)發(fā)生吸附、解吸附過程，最終實(shí)現(xiàn)各色素組分互相分離。柱色譜也是分離、提純有機(jī)物的重要方法，本實(shí)驗(yàn)利用吸附柱色譜通過連續(xù)地吸附、解吸附過程，實(shí)現(xiàn)色素各組分的分離、提純。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

正己烷(分析純)，丙酮(分析純)，正丁醇(分析純)，無水乙醇(分析純)，10%氯化鈉溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，無水硫酸鈉(分析純)，硅膠(100-200目)，中性氧化鋁(100-200目)，石英砂(分析純)，新鮮菠菜。

2.3 實(shí)驗(yàn)器材

層析柱(內(nèi)徑14 mm，長300 mm)，100 mL錐形瓶，60 mL梨形分液漏斗，膠頭漏斗，玻璃棒，滴管，脫脂棉，200 mL燒杯，10 mL量筒，50 mL量筒，天平，鐵架臺，層析缸，毛細(xì)管，薄層色譜板(25 mm × 75 mm)。

2.4 實(shí)驗(yàn)步驟

2.4.1 色素提取

在研缽中放入2.0 g新鮮菠菜葉(剪碎)，研磨。加入22.0 mL丙酮和3.0 mL正己烷，攪拌、研磨至葉片變白[24]。用膠頭滴管將研缽中的提取液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入10.0 mL正己烷和10.0 mL 10%氯化鈉水溶液，振搖，靜置。分去水層，有機(jī)層用10.0 mL 10%氯化鈉溶液水洗兩次，然后將有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥。將干燥好的提取液轉(zhuǎn)移至另一容器中。若溶液顏色較淺，可適當(dāng)濃縮。

2.4.2 色素的分離與提純

薄層色譜法可以快速進(jìn)行物質(zhì)的分離、鑒定。本實(shí)驗(yàn)選用青島海洋化工有限公司的薄層色譜板(25 mm × 75 mm)，在點(diǎn)樣后將其放入裝有適量展開劑的層析缸中進(jìn)行菠菜葉各色素的分離、鑒定。

柱色譜法是分離、提純有機(jī)物的重要方法。本實(shí)驗(yàn)分別討論了硅膠、中性氧化鋁兩種固定相和多種不同組合的流動相，通過不斷調(diào)整流動相的極性，探索0.5 mL菠菜提取液各色素組分的最佳分離條件。

3 結(jié)果與討論

3.1 薄層色譜

為了尋找最優(yōu)的薄層方案，我們首先對已報(bào)道的正己烷-丙酮[14,15,17,18,21]、正己烷-乙酸乙酯[18,24]兩種常用展開劑組合進(jìn)行了嘗試，其次探究了二氯甲烷-乙酸乙酯、正己烷-正丁醇、正己烷-無水乙醇等多種新展開劑，通過觀察色素點(diǎn)展開情況，優(yōu)化展開劑極性大小，以期實(shí)現(xiàn)菠菜葉色素的最佳分離效果。

3.1.1 已報(bào)道展開劑

正己烷-丙酮是菠菜葉色素的提取與分離實(shí)驗(yàn)中最為常見的薄層色譜展開劑。我們系統(tǒng)分析了已報(bào)道的體積比4.0 : 1.0[15,17,18]、8.0 : 3.0[14]、5.0 : 2.0[21]、7.0 : 3.0[24]、3.0 : 2.0[14]的正己烷-丙酮組合，比較不同的展開劑對菠菜葉色素分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，當(dāng)正己烷-丙酮體積比為5.0 : 2.0、7.0 : 3.0時(shí)，得到6個(gè)色素點(diǎn)，分離效果相對較好，其中7.0 : 3.0時(shí)色素點(diǎn)分布更均勻(圖2a)。

表1 以正己烷-丙酮、正己烷-乙酸乙酯為展開劑的薄層色譜分離實(shí)驗(yàn)

圖2 菠菜葉色素薄層色譜分離效果圖

正己烷-乙酸乙酯同樣是較為常見的薄層色譜展開劑。采用正己烷-乙酸乙酯體積比為3.0 : 2.0[18,25]、5.0 : 4.0[23]的混合溶液對菠菜葉色素進(jìn)行薄層色譜分離實(shí)驗(yàn)。如表1所示，正己烷-乙酸乙酯5.0 : 4.0時(shí)得到最多的色素點(diǎn)，但各色素點(diǎn)拖尾嚴(yán)重(圖2b)。我們另外又嘗試了正己烷-乙酸乙酯6.0 : 5.0、5.0 : 3.0、2.8 : 1.5、3.0 : 1.4的混合比例，均未能得到好的色素分離效果。

3.1.2 新展開劑

為了進(jìn)一步優(yōu)化薄層色譜分離方案，我們還嘗試了“菠菜葉中色素提取與分離實(shí)驗(yàn)”未曾使用過的新展開劑組合如二氯甲烷-乙酸乙酯、正己烷-正丁醇、正己烷-無水乙醇等，通過系統(tǒng)分析不同展開劑作用下的色素點(diǎn)分離情況，優(yōu)化展開劑極性大小，以期實(shí)現(xiàn)菠菜葉色素的最佳分離。

以二氯甲烷-乙酸乙酯作為展開劑，我們依次嘗試了體積比5.0 : 2.0、2.0 : 1.0、3.0 : 2.0、1.0 : 1.0的二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶液對薄層分離效果的影響。如表2所示，二氯甲烷-乙酸乙酯體積比為2.0 : 1.0、3.0 : 2.0時(shí)，得到了6個(gè)色素點(diǎn)，分離出的色素點(diǎn)最多，其中體積比為2.0 : 1.0時(shí)色素點(diǎn)分布更加均勻(圖3a)。

表2 以二氯甲烷-乙酸乙酯、正己烷-正丁醇、正己烷-無水乙醇為展開劑的薄層色譜分離實(shí)驗(yàn)

圖3 薄層色譜實(shí)驗(yàn)中色素展開圖

以正己烷-正丁醇作為展開劑，我們依次比較了正己烷-正丁醇體積比為5.0 : 1.0、7.0 : 1.0、12.0 : 1.0、13.0 : 1.0、14.0 : 1.0、15.0 : 1.0、18.0 : 1.0的混合溶液。如表2所示，當(dāng)展開劑為13.0 : 1.0、15.0 : 1.0時(shí)，得到了7個(gè)色素點(diǎn)，15.0 : 1.0時(shí)色素點(diǎn)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象(圖3b)，13.0 : 1.0時(shí)色素點(diǎn)分離效果更好(圖3c)。

以正己烷-無水乙醇作為展開劑，我們依次嘗試了體積比為5.0 : 4.0、2.0 : 1.0、9.0 : 1.0、10.0 : 1.0、11.0 : 1.0、12.0 : 1.0、13.0 : 1.0的正己烷-無水乙醇混合溶液。如表2所示，當(dāng)正己烷-無水乙醇體積比為10.0 : 1.0、11.0 : 1.0、12.0 : 1.0、13.0 : 1.0時(shí)，菠菜葉中不同色素可以實(shí)現(xiàn)較好分離，均出現(xiàn)8個(gè)色素點(diǎn)。其中，10.0 : 1.0時(shí)色素點(diǎn)分布相對均勻(圖3d)，分離出4個(gè)葉綠素色素點(diǎn)，色素點(diǎn)均無明顯拖尾。但隨著展開劑極性的進(jìn)一步降低，從11.0 : 1.0比例開始，葉黃素的分離效果逐漸變差(圖3e)。

另外，我們還嘗試了正己烷-甲醇、二氯甲烷-甲醇、四氯化碳-乙酸乙酯作為薄層色譜分離實(shí)驗(yàn)的展開劑，但均未取得較好的分離效果。

綜上所述，分別得到了薄層色譜實(shí)驗(yàn)中不同展開劑組合的最佳比例及分離效果(表3)。比較發(fā)現(xiàn)，展開劑為體積比10.0 : 1.0的正己烷-無水乙醇時(shí)，色素分離效果好，出現(xiàn)色素點(diǎn)最多，色素點(diǎn)無明顯拖尾現(xiàn)象，其次是體積比13.0 : 1.0的正己烷-正丁醇溶液。

表3 不同展開劑組合的最佳比例及分離效果

3.2 柱色譜

在本科教學(xué)階段，柱色譜分離實(shí)驗(yàn)通常選用硅膠或中性氧化鋁作為固定相，選用有機(jī)混合溶液作為流動相。在前期的薄層色譜實(shí)驗(yàn)中，已經(jīng)得到了菠菜葉中色素分離效果較好的薄層色譜展開劑組合：正己烷-無水乙醇和正己烷-正丁醇。因此，本部分以硅膠或中性氧化鋁為固定相，分別選擇正己烷-無水乙醇、正己烷-正丁醇的混合試劑作為流動相，通過不斷調(diào)整試劑的組合比例，探索能清晰分離各種色素且試劑用量少、洗脫時(shí)間短的流動相組合，從而得到相對理想的柱色譜實(shí)驗(yàn)方案。

3.2.1 以硅膠為固定相

我們首先嘗試了Isac-Garcia等人的實(shí)驗(yàn)方案[24]，采用體積比為7.0 : 3.0的石油醚-丙酮進(jìn)行洗脫，分離得到了三個(gè)色素組分：胡蘿卜素、葉綠素、葉黃素混合液，消耗試劑共計(jì)210 mL，耗時(shí)160 min。

以正己烷-無水乙醇作為洗脫劑，分別嘗試體積比為10.0 : 1.0、20.0 : 1.0、30.0 : 1.0的溶液組合。當(dāng)體積比為10.0 : 1.0時(shí)，洗脫劑極性適中，各色素可以分離；當(dāng)體積比為20.0 : 1.0、30.0 : 1.0時(shí)，洗脫劑極性過小，葉綠素和葉黃素色帶連在一起無法分離。在正己烷-無水乙醇10 : 1的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步嘗試梯度洗脫方法，如表4第1組實(shí)驗(yàn)，依次選擇10.0 : 1.0、5.0 : 1.0、0.0 : 1.0的正己烷-無水乙醇進(jìn)行梯度洗脫，分別得到了胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b、葉黃素1、葉黃素2、葉黃素3，共六種色素組分(圖4a)，消耗試劑180.0 mL，洗脫用時(shí)180 min。

表4 以硅膠為固定相的不同洗脫劑梯度洗脫效果

圖4 柱色譜分離過程

以正己烷-正丁醇作為洗脫劑，分別使用體積比為13.0 : 1.0、14.0 : 1.0、16.0 : 1.0、18.0 : 1.0、20.0 : 1.0、22.0 : 1.0、24.0 : 1.0的溶液組合。當(dāng)體積比為13.0 : 1.0、14.0 : 1.0、和16.0 : 1.0時(shí)，洗脫劑極性過大，各色素混合，無法分離；當(dāng)體積比為18.0 : 1.0、20.0 : 1.0時(shí)，只能分離得到胡蘿卜素和葉綠素；當(dāng)體積比為22.0 : 1.0和24.0 : 1.0時(shí)，胡蘿卜素、葉綠素、葉黃素可以完全分離。進(jìn)一步對22.0 : 1.0的流動相進(jìn)行優(yōu)化，如表4第2組實(shí)驗(yàn)，依次使用22.0 : 1.0、15.0 : 1.0、1.0 : 1.0正己烷-正丁醇進(jìn)行梯度洗脫，分別得到了胡蘿卜素、葉綠素、第一個(gè)葉黃素、第二個(gè)和第三個(gè)混合之后的葉黃素組分，共四種色素組分(圖4b)，消耗試劑158.0 mL，洗脫用時(shí)230 min。

綜上所述，正己烷-無水乙醇體積比為10.0 : 1.0、5.0 : 1.0和0.0 : 1.0的梯度洗脫方法，可以洗脫出六種色素，消耗試劑180.0 mL，耗時(shí)180 min。正己烷-正丁醇作為流動相時(shí)，洗脫出四種色素組分，消耗試劑158.0 mL，洗脫時(shí)間為230 min。因此，以硅膠做固定相，用正己烷-無水乙醇體積比為10.0 : 1.0、5.0 : 1.0和0.0 : 1.0的梯度洗脫方法是更為理想的柱色譜分離方案，此方法耗時(shí)短、試劑用量少、分離效果好，有利于教學(xué)實(shí)驗(yàn)的開展。

3.2.2 以中性氧化鋁為固定相

以中性氧化鋁做固定相，我們首先嘗試了已報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法：參考陳琳等人的實(shí)驗(yàn)方案，以正己烷、丙酮、正丁醇、乙醇和水作為洗脫劑(表5序號1)[15]，最終得到了四種完全分離的色素組分，消耗試劑86.0 mL，耗時(shí)80 min；參考趙劍英等人的實(shí)驗(yàn)方案，以正己烷、丙酮和95%的乙醇作為洗脫劑(表5序號2)[18]，最終得到了兩種色素組分，無法分離葉綠素和葉黃素，消耗試劑137.0 mL，耗時(shí)100 min；參考黃超、侯士聰?shù)热说膶?shí)驗(yàn)方案，以正己烷、丙酮、正丁醇、乙醇和水作為洗脫劑(表5序號3)[14,20]，共洗脫出4種色素，消耗試劑35.0 mL，耗時(shí)20.5 min。

表5 以中性氧化鋁為固定相的洗脫劑梯度洗脫效果

參考以硅膠為固定相的柱色譜分離實(shí)驗(yàn)，我們在中性氧化鋁做固定相的實(shí)驗(yàn)中，也嘗試了正己烷-無水乙醇、正己烷-正丁醇兩種洗脫方案。以正己烷-無水乙醇作為洗脫劑，采用體積比為20.0 : 1.0、10.0 : 1.0、5.0 : 1.0的比例進(jìn)行梯度洗脫，只分離出了胡蘿卜素，葉綠素和葉黃素連接在一塊，無法分離。進(jìn)一步調(diào)整正己烷-無水乙醇洗脫劑體積比為25.0 : 1.0和30.0 : 1.0，仍然無法實(shí)現(xiàn)葉綠素和葉黃素的分離。以正己烷-正丁醇作為洗脫劑，采用體積比為22.0 : 1.0、20.0 : 1.0、1.0 : 1.0的比例進(jìn)行梯度洗脫，如表5中4號實(shí)驗(yàn)所示，分別得到了胡蘿卜素、葉綠素、三個(gè)葉黃素組分，共5種色素，試劑消耗量78.0 mL，耗時(shí)27 min。

與文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行對比，以中性氧化鋁為固定相時(shí)，采用體積比為22.0 : 1.0、20.0 : 1.0、1.0 : 1.0的正己烷-正丁醇作為洗脫劑的梯度洗脫方案分離效果最佳，分離得到了最多的色素組分，所用展開劑種類少，實(shí)驗(yàn)用時(shí)較短，更適合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

綜上所述，我們得到了柱色譜實(shí)驗(yàn)的兩個(gè)最優(yōu)方案(表6)：1) 以12.0 g硅膠做固定相，分別用110.0 mL 10.0 : 1.0、60.0 mL 5.0 : 1.0和10.0 mL 0.0 : 1.0正己烷-無水乙醇進(jìn)行梯度洗脫，可以分別得到6種色素組分，消耗試劑180.0 mL，實(shí)驗(yàn)耗時(shí)180 min。2) 以15.0 g中性氧化鋁做固定相，分別用35.0 mL 22.0 : 1.0、21.0 mL 20.0 : 1.0和22.0 mL 1.0 : 1.0正己烷-正丁醇進(jìn)行梯度洗脫，可以分離得到5種色素組分，試劑消耗量78.0 mL，耗時(shí)27 min。但是，如圖5所示，以氧化鋁做固定相時(shí)，各色素在色譜柱中顯色不明顯，難以觀察色譜柱中各色素帶的分離情況。

表6 最佳梯度洗脫方案

4 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)探究了菠菜葉色素的提取與分離教學(xué)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化了薄層色譜展開劑和柱色譜洗脫劑，得到了更佳的薄層色譜、柱色譜分離效果。薄層色譜實(shí)驗(yàn)中選用體積比為10.0 : 1.0的正己烷-無水乙醇作展開劑可以得到8個(gè)色素分離點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)分離效果最佳。柱色譜實(shí)驗(yàn)中選用硅膠為固定相，分別用體積比為10.0 : 1.0、5.0 : 1.0、0.0 : 1.0正己烷-無水乙醇進(jìn)行梯度洗脫，或者選用中性氧化鋁為固定相，分別用體積比為22.0 : 1.0、20.0 : 1.0、1.0 : 1.0正己烷-正丁醇進(jìn)行梯度洗脫，都可以得到較好的色素分離效果。此次實(shí)驗(yàn)改進(jìn)，進(jìn)一步提高了色素分離效果，減少了管制試劑及毒性較大試劑的使用，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，對該實(shí)驗(yàn)在實(shí)際教學(xué)中進(jìn)一步的推廣應(yīng)用具有重要意義。