王亮,田玉潭,劉軍,鄭安然,毛筱藝,吳迅,劉敦華,*

1(寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院,寧夏 銀川,750021)2(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川,750021)

畜禽鮮骨是畜禽肉加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物,富含極高的營養(yǎng)價值[1]。我國肉雞總產(chǎn)量居世界前列,雞骨資源非常豐富,雞骨中含有約51%的水分、19%的蛋白質(zhì)和15%的灰分,目前,我國有少部分雞骨被加工成骨粉、骨泥等低價值產(chǎn)品,并沒有實現(xiàn)雞骨的高值化利用,造成了蛋白資源浪費[2]。

研究表明,雞骨被酶水解后,蛋白質(zhì)被催化分解,釋放出大量的呈味游離氨基酸,是風(fēng)味物質(zhì)的重要前體物,具有制作調(diào)味料基料的潛質(zhì)[3]。此外,發(fā)酵技術(shù)有助于促進雞骨中風(fēng)味前體物的產(chǎn)生,可以改善產(chǎn)品的風(fēng)味[4]。而通過酶解-發(fā)酵聯(lián)用技術(shù)能夠改善產(chǎn)品風(fēng)味,產(chǎn)生功能性物質(zhì),因此利用酶解-發(fā)酵技術(shù)制備肉類風(fēng)味香精具有廣闊的應(yīng)用前景。

YANG等[5]研究表明超聲預(yù)處理草魚蛋白水解物后,可以促進草魚蛋白水解物發(fā)生美拉德反應(yīng),并且可以改善美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味。美拉德反應(yīng)能夠改善蛋白質(zhì)水解物的風(fēng)味、穩(wěn)定性、溶解性、黏度等功能特性,同時影響美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性、抑菌性、降血壓、消化性等性質(zhì)[6]。蛋白酶水解和美拉德反應(yīng)的結(jié)合可以有效改善產(chǎn)品的風(fēng)味:降低雞骨提取物的口味,改善口感、新鮮度[6]。蛋白質(zhì)水解物的美拉德反應(yīng)涉及許多因素,包括游離氨基和羰基的比例、溫度、時間、pH值等,此外,研究發(fā)現(xiàn)超聲處理、微波處理等外在的處理方式會影響美拉德反應(yīng)速率。超聲波通過機械作用、空化效應(yīng)作用于反應(yīng)物質(zhì),產(chǎn)生巨大的壓力、剪切應(yīng)力、動態(tài)攪拌和溫度梯度,超聲協(xié)同熱處理改變了空間結(jié)構(gòu),加快分子間的反應(yīng)速度,促進了美拉德反應(yīng)的進行[7]。目前,關(guān)于美拉德反應(yīng)制備雞骨香精基料的研究較少,因此,對雞骨香精基料及其活性的研究具有重要意義。

本實驗以雞骨為原料,加入木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進行酶解,接種發(fā)酵劑,制成雞骨酶解發(fā)酵液,在此基礎(chǔ)上添加糖和氨基酸進行美拉德反應(yīng),制成雞骨香精基料,對比熱處理、超聲協(xié)同熱處理制備雞骨香精基料的美拉德反應(yīng)體系及揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量,并測定雞骨香精基料的抗氧化活性、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制活性、膽固醇抑制率等活性,旨在明確超聲處理對雞骨香精基料美拉德反應(yīng)程度及活性的影響,以期為開發(fā)具有抗氧化活性和抑制活性的高品質(zhì)肉味衍生化產(chǎn)品提供一定參考,并實現(xiàn)雞骨的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞骨架購于銀川市同心路綜合市場;木瓜蛋白酶(100 000 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(15 000 U/g)(食品級),夏盛生物科技開發(fā)有限公司;植物乳桿菌凍干粉,濟南金雨源生物技術(shù)有限公司;戊糖片球菌凍干粉,上海北諾有限公司;D-木糖、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、維生素C、維生素B1、酵母抽提物(食品級),英博生物科技有限公司;葡萄糖(食品級),濟南銘鋒生物科技有限公司;食鹽(食品級),銀川聚信匯科生物技術(shù)有限公司;ABTS,上海麥克林生化科技有限公司;血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu,HHL),美國Sigma試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SE-150型高速萬能粉碎機,北京科一電器有限公司;LRH-150-B型生化培養(yǎng)箱,廣州瑞豐實驗設(shè)備有限公司;DSX-280型手提式壓力蒸汽滅菌鍋,山東歐萊博醫(yī)療器械;pHS-2F型pH計、970CRT型熒光分光光度計,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器,河南博匯機械設(shè)備有限公司;DP-400型色差儀,柯尼卡美能達公司;UV-18000304042502型紫外可見光分光光度計,日本島津;Agilent 5975GC-MSD型氣質(zhì)聯(lián)用儀質(zhì)譜儀 安捷倫科技有限公司;GL-10C型高速冷凍離心機,濟南好來寶醫(yī)療器械有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 雞骨香精基料制備

在前期研究[8]的基礎(chǔ)上,建立雞骨酶解發(fā)酵液美拉德反應(yīng)體系。向雞骨泥中添加木瓜蛋白酶8.15 g/kg,55 ℃條件下水解4 h,風(fēng)味蛋白酶8 g/kg,55 ℃條件下水解3 h,酶解完成后在90 ℃條件下進行滅菌,得到雞骨酶解液,接入發(fā)酵劑(植物乳桿菌：戊糖片球菌為1：1),發(fā)酵溫度為33 ℃,發(fā)酵劑接種量為6%,發(fā)酵時間為49 h,得到雞骨酶解發(fā)酵液;香精配料為:L-半胱氨酸和酵母提取物2%,L-丙氨酸1%,L-精氨酸2.5%,維生素C和維生素B10.8%,木糖和葡萄糖3%,食鹽0.6%,放入美拉德反應(yīng)瓶中,使原料全部溶解,調(diào)節(jié)pH值至6.0,置于105 ℃油浴鍋中反應(yīng)50 min,發(fā)生美拉德反應(yīng)得到雞骨香精基料。每10 min從油浴鍋中取美拉德反應(yīng)產(chǎn)物,用冰浴停止反應(yīng),用高速冷凍離心機以10 000 r/min離心10 min,得到測試原液,測定美拉德反應(yīng)程度及生物活性。

1.3.2 超聲協(xié)同熱處理

參考劉偉[9]的方法,先將雞骨酶解發(fā)酵液超聲處理30 min,超聲條件為:超聲功率因數(shù)60%(900 W),超聲溫度保持在(60±3) ℃,再置于105 ℃油浴鍋中熱處理50 min發(fā)生美拉德反應(yīng)。

1.3.3 色澤測定

參考TAN等[10]的方法并略作修改,使用色度計測定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的顏色,色度計的校準(zhǔn)使用白色標(biāo)準(zhǔn)板(L*=95.28,a*=-0.14,b*=0.95)。

1.3.4 中間產(chǎn)物的測定

參考TAN等[10]的方法并略作修改,取測試原液用去離子水稀釋20倍,于最大吸收波長294 nm處測定吸光度。

1.3.5 褐變程度的測定

參考TAN等[10]的方法并略作修改,取測試原液用去離子水稀釋20倍,于最大吸收波長420 nm處測定吸光度。

1.3.6 熒光光譜的測定

參考TAN等[10]的方法并略作修改,取測試原液稀釋16倍,用熒光分光光度計進行測定:熒光光譜激發(fā)波長為417 nm,掃描發(fā)射波長為200～450 nm,狹縫寬度為10 nm,靈敏度為1。

1.3.7 揮發(fā)性物質(zhì)的測定

參考依勝男等[11]的方法并略作修改,固相微萃取(DVB/CAR/PDMS 50 μm):取5 mL雞骨香精基料置于20 mL的頂空瓶中,溫度50 ℃,水浴平衡10 min,頂空吸附30 min,進樣分析,解析5 min,溫度為250 ℃。

GC條件:DB-5MS毛細管柱(30 mm×0.25 mm×0.5 μm,Agilent Techonologies),載氣為高純氦氣,起始溫度設(shè)定為40 ℃,持續(xù)3 min后,以5 ℃/min升溫到230 ℃,持續(xù)3 min,共40 min。恒定流速為1.2 mL/min,不分流。

MS條件:GC-MS接口溫度為200 ℃,質(zhì)譜庫NIST17.L,質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍40～450 amu。各揮發(fā)性物質(zhì)相對含量(%)按照峰面積歸一化法計算。

1.3.8 抗氧化活性的測定

1.3.8.1 DPPH自由基清除活性的測定

參考XIONG等[12]的方法并略作修改,將超聲協(xié)同熱處理制備的測試原液稀釋20倍,取2 mL加入2.0 mL DPPH溶液(0.20 mmol/L),振蕩混勻,置于陰涼處避光靜置30 min,于最大吸收波長517 nm處測定其吸光度,陽性對照為樣液與無水乙醇溶液以及無水乙醇與DPPH溶液。

1.3.8.2 超氧陰離子自由基清除活性的測定

參考張亞琨等[13]的方法,取5 mL Tris-HCl(0.05 mol/L)緩沖溶液,25 ℃下預(yù)熱20 min,將超聲協(xié)同熱處理制備的測試原液稀釋20倍,取1 mL加入500 μL鄰苯三酚溶液(3 mmol/L),混合均勻,繼續(xù)反應(yīng)5 min,添加1 mL鹽酸(8 mmol/L)停止反應(yīng),于最大吸收波長299 nm處測定吸光度。

1.3.8.3 ABTS陽離子自由基清除活性的測定

參考TAN等[10]的方法并略作修改,取0.352 mL K2S2O8溶液(140 mmol/L)和20 mL ABTS陽離子溶液(7 mmol/L),在室溫下避光反應(yīng)12～16 h,用無水乙醇稀釋至在734 nm處的吸光度為0.7±0.02,取5 mL該溶液,將測試原液稀釋20倍,取50 μL樣液與之混合,在室溫下避光反應(yīng)6 min,于734 nm處測定吸光度。

1.3.9 ACE抑制活性的測定

參考LI等[14]的方法并略作修改,反應(yīng)開始后,每間隔10 min取超聲協(xié)同熱處理制備的測試原液15 μL,添加30 μL HHL(2 mg/mL)溶液和ACE酶液(12.5 mg/mL),置于96孔酶標(biāo)板,混合均勻后在37 ℃條件下反應(yīng)60 min,立即加入120 μL NaOH(1.2 mol/L)溶液停止反應(yīng),加入30 μL 2%的鄰苯二甲醛溶液,混合均勻,室溫下靜置20 min,添加30 μL的HCl(6 mol/L)溶液停止反應(yīng)。測定熒光強度:激發(fā)波長340 nm,掃描發(fā)射波長300～600 nm,狹縫寬度10 nm,靈敏度為2。

1.3.10 體外降膽固醇能力的測定

參考李晶等[15]的方法并略作修改,制備1 mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液,配制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,測定混合液在550 nm處的吸光度,以膽固醇濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算回歸方程。根據(jù)不加測試原液的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值A(chǔ)0,添加與之相同量的測試原液測得吸光度A1,帶入回歸方程得到美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的膽固醇濃度ω0和ω1,計算膽固醇抑制率,如公式(1)所示:

(1)

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗進行3次平行,采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計并做標(biāo)準(zhǔn)差,采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行顯著性分析,P<0.05表示差異顯著,采用Origin 2019對數(shù)據(jù)進行處理并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色澤分析

美拉德反應(yīng)底物的糖基化程度可以通過反應(yīng)過程中的顏色變化來判斷[10]。由圖1可知,不同處理方式不同反應(yīng)時間之間的a*、b*、L*在反應(yīng)第10～50 min時差異性均顯著(P<0.05)。隨熱反應(yīng)時間延長,各處理組雞骨香精基料的L*值呈下降趨勢,a*值呈上升趨勢,b*值呈降低趨勢,說明隨反應(yīng)時間延長,雞骨香精基料的色澤逐漸變暗,紅色加深,黃色變淺,這是由于加熱時間延長,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物不斷增加,類黑精物質(zhì)累計,導(dǎo)致顏色不斷加深,且加熱時間增加,美拉德反應(yīng)程度越高,顏色變化越明顯。另外,超聲協(xié)同熱處理組的a*值始終高于熱處理組,L*值在反應(yīng)第20 min時高于熱處理組,剩余時間均低于熱處理組,b*值在反應(yīng)第10 min時高于熱處理組,剩余時間均低于熱處理組,說明經(jīng)超聲處理過的雞骨香精基料色澤較暗,亮度更低。美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的棕色黑色素會使L*持續(xù)下降,由于黑色素的積累,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物會產(chǎn)生紅色和黃色。經(jīng)超聲處理后,雞骨蛋白的三級結(jié)構(gòu)得到更廣泛的擴展,使美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有更好的溶解性,有利于顏色產(chǎn)生;超聲波的物理和機械作用改變了雞骨香精基料的蛋白質(zhì)性質(zhì),這可能會加速美拉德反應(yīng)過程,導(dǎo)致黑色素增加,因此色澤變化更為明顯[16]。

a-L*;b-a*;c-b*圖1 雞骨香精基料的色澤變化Fig.1 Changes of color of chicken bone essence basic material注:同一種處理方式不同反應(yīng)時間之間的差異性用小寫字母表示(P<0.05),同一反應(yīng)時間不同處理方式之間的差異性用大寫字母表示(P<0.05)。

2.2 中間產(chǎn)物及褐變程度分析

雞骨香精基料中間產(chǎn)物及褐變程度的變化如圖2所示。在美拉德反應(yīng)中產(chǎn)生的二羰基化合物(如酮類和醛類)可在294 nm處進行測量[17],可反映美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物變化。由于色素產(chǎn)物的形成,美拉德反應(yīng)通常伴隨著褐變,因此褐變程度(A420 nm)可以反映樣品美拉德反應(yīng)的劇烈程度[17]。由圖2可知,超聲協(xié)同熱處理組的樣品其在294、420 nm處的吸光度始終高于熱處理組,且隨著時間延長而增加,中間產(chǎn)物的變化趨勢與褐變程度相一致,原因可能是因為雞骨蛋白被酶解后,三級結(jié)構(gòu)被破壞,蛋白質(zhì)鏈上的氨基裸露出來,然后在酶的作用下,蛋白鏈的肽鍵被破壞,分解為小分子的肽鏈或游離氨基酸,而超聲處理改變了雞骨蛋白的高級結(jié)構(gòu),促進了雞骨的酶解,產(chǎn)生了更多肽和氨基酸[17]。因此可得出結(jié)論:超聲協(xié)同熱處理可使雞骨香精基料美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的中間產(chǎn)物和褐變程度增強,類黑精含量增多。

a-中間產(chǎn)物;b-褐變程度圖2 雞骨香精基料A294nm吸光度及褐變程度的變化Fig.2 Changes of intermediate products and browning degree of chicken bone essence basic material

2.3 熒光光譜分析

不同處理方式對雞骨香精基料熒光光譜如圖3所示。熒光化合物出現(xiàn)在可見棕色色素形成之前,因此可用作美拉德反應(yīng)初始階段的指示劑[17]。由圖3可知,不同反應(yīng)時間產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物其熒光光譜僅呈現(xiàn)單峰,且各處理組雞骨香精基料的熒光強度隨著時間延長呈現(xiàn)逐步增長的趨勢,當(dāng)處理時間為50 min時,熱處理和超聲協(xié)同熱處理的樣品熒光強度均達到峰值(414 nm處),分別為127、238,表明隨著加熱時間延長,美拉德反應(yīng)過程中產(chǎn)生了更多的熒光化合物,考慮原因可能是隨著加熱時間延長,蛋白質(zhì)的肽鍵被破壞,暴露出更多的酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基,酪蛋白發(fā)生去折疊現(xiàn)象,使更多具有熒光吸收能力的苯環(huán)基團裸露,從而增加了對熒光的吸收,使熒光強度增加。而在熒光強度達到峰值后熒光強度的降低可能是因為木糖與蛋白酶解物發(fā)生共價反應(yīng),美拉德產(chǎn)物的空間位阻增加,氨基酸吸收熒光的信號被屏蔽,使熒光強度降低[18],也有學(xué)者認(rèn)為熒光化合物是美拉德反應(yīng)混合物的前體,而不是最終產(chǎn)物[19]。LI等[19]對山藥多糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強度進行測定,發(fā)現(xiàn)山藥多糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強度在426 nm處達到峰值,達到最大值后熒光強度呈下降趨勢,與本實驗結(jié)論相一致。另外,經(jīng)超聲預(yù)處理的樣品,熒光強度始終高于熱處理的樣品,考慮原因可能是超聲使蛋白質(zhì)分子鏈伸展,蛋白質(zhì)分子之間的疏水鍵被破壞,暴露出更多的疏水性基團,進而導(dǎo)致熒光強度增加[17],因此超聲協(xié)同熱處理有利于美拉德反應(yīng)生成熒光化合物,促進美拉德反應(yīng)的進行。

a-熱處理;b-超聲協(xié)同熱處理圖3 雞骨香精基料熒光光譜的變化Fig.3 Changes in the fluorescence spectra of chicken bone essence basic material

2.4 揮發(fā)性物質(zhì)分析

不同處理方式的雞骨香精基料揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖如圖4所示。結(jié)合圖4和表1容易看出,熱處理過的雞骨香精基料美拉德反應(yīng)體系共檢測出22種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì);超聲協(xié)同熱處理過的雞骨香精基料美拉德反應(yīng)體系共檢測出26種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)?？煞譃槠哳?其中醛類物質(zhì)5種、醇類物質(zhì)4種、酮類物質(zhì)2種、酚類物質(zhì)1種、酯類物質(zhì)3種、烷烴類物質(zhì)7種、雜環(huán)類化合物10種。熱處理組中烷烴類占比最高,相對含量為34.77%,雜環(huán)類次之,占比為22.81%;超聲協(xié)同熱處理組中同樣烷烴類和雜環(huán)類占比最高,分別為30.30%、24.44%。

表1 美拉德反應(yīng)體系中的揮發(fā)性物質(zhì)Table 1 Volatile substances in Maillard reaction system

a-熱處理;b-超聲協(xié)同熱處理圖4 雞骨香精基料揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖Fig.4 The total ion current diagrams of volatile substances in chicken bone essence basic material

SUN等[20]證明用雞骨的美拉德反應(yīng)制作的廣東香腸具有良好的質(zhì)地和感官特性,也有論文描述了從海鮮副產(chǎn)品和羊骨中制備風(fēng)味化合物[21-22]。研究發(fā)現(xiàn),醛類物質(zhì)主要來自脂肪的氧化分解以及戊糖和氨基酸的熱降解,由于醛的氣味閾值極低,因此,醛類物質(zhì)是美拉德反應(yīng)體系極重要的芳香化合物,其中苯甲醛具有堅果和水果香氣[23]。由表1可以看出,超聲處理過的樣品,醛類物質(zhì)含量較高。含硫化合物主要提供低閾值的肉類風(fēng)味,醇類物質(zhì)也是美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中重要的揮發(fā)性化合物,1-辛烯-3-醇可以改善或增強肉類風(fēng)味,且只在超聲處理過的樣品中檢測到了1-辛烯-3-醇。而醇酮類、酚類物質(zhì)相對含量較低,這些物質(zhì)氣味閾值較高,對產(chǎn)物香氣無明顯影響,但可以協(xié)調(diào)補充產(chǎn)物的整體香氣。雜環(huán)類化合物相對含量最高,而且雜環(huán)類化合物閾值較低,很有可能是雞骨香精基料中的主體風(fēng)味物質(zhì),呋喃類化合物是肉制品的主要雜環(huán)化合物,主要提供燒烤和海鮮風(fēng)味,且超聲處理過的雞骨酶解發(fā)酵液,其呋喃類化合物含量較高,這可能與超聲協(xié)同熱處理過程中,木糖環(huán)化的加劇有關(guān),其他雜環(huán)類化合物也貢獻烤香、焦甜香、堅果香、肉香等風(fēng)味,其中2-戊基-呋喃相對含量最高,呈現(xiàn)豆腥味[24]。美拉德反應(yīng)體系中最重要的呈味物質(zhì)是醛類和雜環(huán)類化合物,超聲處理得到的雞骨香精基料中醛類化合物和雜環(huán)類化合物均高于熱處理組,同樣證明超聲可促進美拉德反應(yīng)的發(fā)生。

2.5 抗氧化活性分析

由圖5可知,隨著時間延長,雞骨香精基料的抗氧化活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。DPPH自由基清除率在反應(yīng)第20 min時最高,為95.45%,ABTS陽離子自由基、超氧陰離子自由基清除率在反應(yīng)進行到30 min時最高,分別為83.82%和90.63%?？寡趸钚栽黾拥脑蚩赡苁敲览路磻?yīng)產(chǎn)物中一些還原性化合物的氫鍵被破壞,使更多羥基裸露出來,從而提供氫電子,氫電子的還原性對其他物質(zhì)發(fā)生氧化具有抑制作用[12]。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中類黑精的抗氧化特性部分歸因于這些化合物的金屬螯合能力,類黑精的陰離子能夠螯合過渡金屬,另外,類黑精組分可以清除多種活性氧,可清除自由基[25]。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物通過提供氫清除DPPH自由基,形成穩(wěn)定的DPPH-H分子。通過接受美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的氫自由基,DPPH的顏色從紫色變?yōu)辄S色,從而形成穩(wěn)定的分子[15]。ABTS陽離子自由基的主要清除機制是電子轉(zhuǎn)移,抗氧化劑為ABTS陽離子自由基提供電子以產(chǎn)生聚合物產(chǎn)品,并將ABTS陽離子溶液的顏色從綠色變?yōu)闊o色[15],這些結(jié)果可以表明,美拉德反應(yīng)和發(fā)酵水解破壞了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),可以對雞骨酶解發(fā)酵液的還原能力產(chǎn)生積極影響。此外,超聲波作用增強了氨基和羰基之間的分子運動,產(chǎn)生更多的抗氧化劑,這些結(jié)果可以表明超聲可以改變美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性能[12]?？寡趸钚越档偷脑蚩赡苁窃诜磻?yīng)后期,大量的氨基酸、多肽被消耗,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物減少,這也可能導(dǎo)致抗氧化活性降低。

圖5 雞骨香精基料的自由基清除活性Fig.5 Radical scavenging activity of chicken bone essence basic material

2.6 ACE抑制活性分析

由圖6可知,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的ACE抑制活性呈先上升后下降的趨勢,與自由基清除活性的變化趨勢相一致。ACE在調(diào)節(jié)動脈血壓中起關(guān)鍵作用,血管緊張素Ⅰ由腎素水解產(chǎn)生,ACE可催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ(血管收縮劑),血管緊張素Ⅱ可使具有血管舒張作用的緩激肽失活,還能與血管緊張素Ⅱ 1型(AT1)受體結(jié)合,導(dǎo)致血管收縮和血壓升高[26]。反應(yīng)至40 min時,ACE抑制活性由53.25%增加到89.997%,ACE抑制活性增加的原因可能是超聲空化效應(yīng)使蛋白分子的分散性增加,加速了美拉德反應(yīng)過程中具有ACE抑制活性的物質(zhì)釋放,導(dǎo)致ACE抑制活性增加,在反應(yīng)至50 min時,ACE抑制活性降低至84.39%,原因可能是美拉德反應(yīng)消耗了具有ACE抑制活性的肽,導(dǎo)致ACE抑制活性降低[26]。研究發(fā)現(xiàn),美拉德反應(yīng)產(chǎn)物類黑精具有ACE抑制作用,目前,已經(jīng)研究了從咖啡、啤酒、甜酒中分離的純類黑素的體外ACE抑制活性,具備潛在的抗高血壓活性[26]。LI等[27]研究發(fā)現(xiàn),大豆分離物具有ACE抑制活性,從中分離鑒定出一種化合物C15H21NO7,推測是苯丙氨酸與葡萄糖通過美拉德反應(yīng)形成的共軛物,證實了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在豆瓣醬ACE抑制活性中的重要作用。

圖6 雞骨香精基料的ACE抑制活性Fig.6 ACE inhibitory activity of chicken bone essence basic material

2.7 體外降膽固醇能力分析

由圖7可知,隨反應(yīng)時間延長,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的體外降膽固醇能力在10～50 min呈上升趨勢。這可能是由于隨反應(yīng)時間延長,美拉德反應(yīng)程度加劇,美拉德反應(yīng)體系中類黑精物質(zhì)及其他生物活性物質(zhì)不斷積累,改善了雞骨香精基料的降膽固醇能力,另一方面,膽固醇抑制活性與肽的疏水性有關(guān),超聲能夠使雞骨蛋白中的疏水基團外露,從而提高雞骨香精基料的降膽固醇能力[28]。PAK等[29]確定疏水性是導(dǎo)致膽固醇降低的關(guān)鍵因素,而脯氨酸殘基是關(guān)鍵的組成部分,此外,疏水性和與膽汁酸結(jié)合的能力之間的相關(guān)性表明,具有高膽汁酸結(jié)合能力的多肽可以抑制回腸中膽汁酸的吸收并降低血清膽固醇水平。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)協(xié)同發(fā)酵顯著提高了乳蛋白的抗血栓活性水平和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制作用,但并未改變膠束膽固醇溶解度的活性水平,同時美拉德反應(yīng)增強了乳蛋白的抗氧化性能,確定了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中產(chǎn)生的小分子大小的化合物,這些化合物具有更高的心血管預(yù)防作用,因此,發(fā)酵的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可用于降低氧化應(yīng)激,血小板聚集和膽固醇合成[30]。但是關(guān)于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抑制機理還未有明確報道,需要進一步探究。

圖7 雞骨香精基料的體外降膽固醇能力Fig.7 Cholesterol lowering ability of chicken bone essence basic material

3 結(jié)論

本研究基于美拉德反應(yīng)制備雞骨香精基料,分析超聲預(yù)處理對雞骨酶解發(fā)酵液制備雞骨香精基料的影響及雞骨香精基料的生物活性。結(jié)果表明,超聲預(yù)處理對雞骨香精基料的美拉德反應(yīng)具有積極影響,促進了美拉德反應(yīng)的發(fā)生。GC-MS檢測到呋喃類化合物、1-辛烯-3-醇等對風(fēng)味有重要影響的揮發(fā)性物質(zhì),能夠改善雞骨香精基料的風(fēng)味;實驗結(jié)果證明雞骨香精基料具有較高的抗氧化活性、ACE抑制活性,還具備一定的體外降膽固醇能力?？傮w而言,以上結(jié)果為美拉德反應(yīng)制備雞骨香精基料提供了技術(shù)支持,證明利用肉類工業(yè)的副產(chǎn)品骨骼殘渣制備肉味香精具有一定的可行性。