亞硝酸鹽對(duì)鲆鰈類急性毒性影響研究進(jìn)展

葛偉宏 趙心冉 劉栩華 吉 情 李云婷 曹 梅* 王興強(qiáng)于佳辰 于潤(rùn)川

（1江蘇海洋大學(xué)海洋科學(xué)與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港 222005；2連云港海之源水產(chǎn)育苗有限公司，江蘇連云港 222005）

鲆鰈類是一種富含多種營(yíng)養(yǎng)成分的魚(yú)類，因它含有人體所需要的元素，且肉質(zhì)鮮美、口感細(xì)膩，目前已成為中國(guó)人民餐桌上常見(jiàn)的食物。同時(shí)，鲆蝶類生長(zhǎng)速度快、食性廣、養(yǎng)殖周期短、效益高的特點(diǎn)，已使其成為中國(guó)海水養(yǎng)殖業(yè)中最具有代表性的產(chǎn)業(yè)之一。亞硝酸鹽是水生環(huán)境常見(jiàn)污染物，對(duì)水生生物具有毒性。鲆鰈類在國(guó)內(nèi)外的水產(chǎn)養(yǎng)殖中占有重要地位，被廣泛集約化養(yǎng)殖。本文總結(jié)了亞硝酸鹽的來(lái)源、毒性機(jī)理以及其對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖生物的危害，綜述了硝酸鹽對(duì)鲆鰈類組織器官、應(yīng)激反應(yīng)、生理功能、免疫應(yīng)答以及細(xì)胞凋亡方面的影響。[1]。

1 亞硝酸鹽的來(lái)源和毒性機(jī)理

亞硝酸鹽（NO2-）是水生環(huán)境中常見(jiàn)的污染物，對(duì)水生生物具有毒性。在天然水體中，亞硝酸鹽濃度通常低于0.1 mg/L。鲆鰈類主要在室內(nèi)水池中進(jìn)行高密度養(yǎng)殖及生產(chǎn)，養(yǎng)殖系統(tǒng)包括再循環(huán)和流經(jīng)系統(tǒng)，其中海水經(jīng)常被重復(fù)利用以節(jié)省能源，水質(zhì)情況是影響魚(yú)類品質(zhì)和生產(chǎn)水平的最重要因素之一[2-3]，因此有必要對(duì)此進(jìn)行嚴(yán)格的水質(zhì)控制。水體生態(tài)正常時(shí)，亞硝酸鹽等有害物質(zhì)可以通過(guò)硝化細(xì)菌的作用被轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的物質(zhì)，或者被水中藻類生物利用變成無(wú)毒的氮?dú)狻＿@樣可以使水體環(huán)境處于自凈平衡的狀態(tài)。然而，當(dāng)水體中污染物超過(guò)了水體自我凈化的能力時(shí)，水質(zhì)惡化。這會(huì)增加水中有害物質(zhì)的含量，對(duì)水生生物健康產(chǎn)生威脅，影響水體生態(tài)平衡。

亞硝酸鹽對(duì)動(dòng)物的致毒機(jī)理：①亞硝酸鹽會(huì)影響魚(yú)、蝦、蛙等動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化酶活性，溶菌酶的活力和脾細(xì)胞的呼吸爆發(fā)力，從而降低動(dòng)物的免疫能力；②亞硝酸鹽還會(huì)將動(dòng)物體內(nèi)血紅蛋白球中的血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白，從而導(dǎo)致組織內(nèi)缺氧，細(xì)胞膜的通透性改變，組織自溶性提高以及組織壞死等病理現(xiàn)象。目前，亞硝酸鹽對(duì)水生動(dòng)物毒性效應(yīng)方面的研究，多見(jiàn)于魚(yú)、蝦和鱉等[2]。

在海水魚(yú)類中，亞硝酸鹽攝取的途徑已被證明發(fā)生在腸道和鰓上皮[3]。一些研究還發(fā)現(xiàn)，亞硝酸鹽濃度過(guò)高會(huì)減緩海魚(yú)的生長(zhǎng)，擾亂離子平衡，并引起缺氧應(yīng)激，但亞硝酸鹽毒性的分子機(jī)制尚未完全了解[4]。關(guān)于亞硝酸鹽對(duì)鲆鰈類以及整個(gè)魚(yú)類的毒性機(jī)理研究一直在進(jìn)行。

2 亞硝酸鹽的主要協(xié)同因子

導(dǎo)致亞硝酸鹽中毒的主要因子包括接觸時(shí)間、電離強(qiáng)度、鐵離子數(shù)量、pH 和溶氧濃度等。亞硝酸鹽對(duì)魚(yú)的毒性與接觸時(shí)間有關(guān)。在接觸時(shí)間不超過(guò)24 h 時(shí)，其半致死劑量（LD50/LCt50）通常高于最高值。但隨著接觸時(shí)間的延長(zhǎng)，其毒性逐漸減弱。此外，相同含量的亞硝酸鹽在中等分子強(qiáng)度的軟水體中比硬水體毒性更強(qiáng)，在淡水中比在海水中毒性更強(qiáng)。水的離子種類也可以降低對(duì)亞硝酸鹽的毒害，較高的氯離子濃度（鹽濃度）能夠顯著減少亞硝酸鹽對(duì)魚(yú)類的侵害。而溴化物的分子也能以競(jìng)爭(zhēng)通道的方式，從而抑制亞硝根物質(zhì)滲透到魚(yú)鰓的上表層細(xì)胞。較好的氯化物分子與亞硝根離子比率可抑制亞硝酸鹽進(jìn)入血液，從而減少其“表面上”的毒性。一般而言，當(dāng)亞硝酸鹽含量在39～436 mg/L時(shí)，而氯離子含量大約為10～190 mg/L 時(shí)，就可以減少亞硝酸鹽的毒害。此外，碳酸根化合物雖然具有一個(gè)類似于與溴化物發(fā)生反應(yīng)的功能，但是因?yàn)樘妓岣x子的分子量較大，而無(wú)法有效地與亞硝根化合物競(jìng)爭(zhēng)。控制水體的pH也有助于減少亞硝酸鹽的毒性，主要因?yàn)閜H能夠反應(yīng)亞硝酸鹽在水中的溶解狀態(tài)，其分子結(jié)構(gòu)以及與其他分子結(jié)構(gòu)之間的相互作用也取決于pH 而定。當(dāng)pH 低于7 時(shí)，與亞硝酸根離子結(jié)合的H+會(huì)增加，因此生成亞硝酸元素的總量也就會(huì)增加。亞硝酸分子更易于透過(guò)魚(yú)鰓的上皮細(xì)胞，之后更順暢地進(jìn)入到血液中，且不會(huì)被任何分子所阻滯。而水體中高含氧量也會(huì)降低亞硝酸鹽的毒性，這是因?yàn)閬喯跛猁}會(huì)降低向血液中運(yùn)送氧氣的功能。已有研究證實(shí)，在水域中高亞硝酸鹽濃度的前提下，魚(yú)類對(duì)氧的需要量將遠(yuǎn)高于在水域中亞硝酸鹽濃度低的情況。

3 亞硝酸鹽對(duì)鲆鰈類急性毒性影響

水體中亞硝酸鹽濃度過(guò)高是對(duì)水生動(dòng)物是有毒害的，生存和致死濃度50%（LC50）被認(rèn)為是評(píng)估急性毒性的關(guān)鍵參數(shù)[3]。溶解氧、氨、亞硝酸鹽等水質(zhì)變化可能引起生物應(yīng)激[4]。在大菱鲆（Scophthalmus maximus）中，亞硝酸鹽的急性毒性已被報(bào)道，96 h中位致死濃度（LC50）為1.88 mmol/L，但在分子和生理水平上的后續(xù)影響未被描述[5]。此外，海水中亞硝酸鹽暴露水平高于25 mg/L 則會(huì)影響褐牙鲆的抗氧化系統(tǒng)、神經(jīng)遞質(zhì)和免疫反應(yīng)。亞硝酸鹽暴露水平高于25 mg/L 可以通過(guò)改變?nèi)芫负虸gM 活性來(lái)改變抗氧化酶（SOD、CAT、GST和GSH）的活性，以及神經(jīng)遞質(zhì)AChE的活性和免疫反應(yīng)[6]。

3.1 亞硝酸鹽對(duì)鲆鰈類組織器官的影響

亞硝酸鹽不僅在血液中能積累，在鰓、肝臟、大腦和肌肉組織中也會(huì)發(fā)生生物積累。硬骨魚(yú)的鰓是一種多功能器官，可以進(jìn)行離子運(yùn)輸、氣體交換、酸堿調(diào)節(jié)和廢物排泄。它是環(huán)境污染物的主要靶器官，被認(rèn)為是魚(yú)類吸收亞硝酸鹽、Cu 和Zn 等污染物的主要部位[6-7]。因此，魚(yú)鰓比其他器官更容易受到毒物的傷害。高濃度的亞硝酸鹽會(huì)導(dǎo)致鰓的肥大、增生、上皮細(xì)胞壞死和滲透調(diào)節(jié)功能障礙。在鰓中，高濃度亞硝酸鹽會(huì)引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致抗氧化成分損失造成脂質(zhì)過(guò)氧化[7]。目前，國(guó)內(nèi)外研究者在亞硝酸鹽暴露水平升高時(shí)對(duì)魚(yú)類，特別是海魚(yú)鰓的分子效應(yīng)的研究很少。

3.2 亞硝酸鹽對(duì)鲆鰈類應(yīng)激反應(yīng)的影響

魚(yú)的應(yīng)激反應(yīng)是由外部環(huán)境的改變或暴露于有毒物質(zhì)引起的，應(yīng)激指標(biāo)用于檢測(cè)這些毒性效應(yīng)[8]。高濃度的亞硝酸鹽暴露會(huì)對(duì)魚(yú)類造成相當(dāng)大的應(yīng)激，其毒性表現(xiàn)為生理變化、組織損傷和細(xì)胞損傷[9]。在各種應(yīng)激指標(biāo)中，葡萄糖濃度指標(biāo)很重要，因?yàn)楸┞队谟卸疚镔|(zhì)的魚(yú)類，其碳水化合物代謝的增加通常會(huì)導(dǎo)致葡萄糖濃度升高[10]。水生動(dòng)物對(duì)葡萄糖和糖原的利用是一種解毒機(jī)制，在應(yīng)激條件下，葡萄糖濃度通常會(huì)增加。血漿皮質(zhì)醇是魚(yú)類體內(nèi)主要的類固醇激素，皮質(zhì)醇的分泌通常受到各種應(yīng)激源的刺激，如暴露于有毒物質(zhì)和環(huán)境變化[11]。熱休克蛋白（Heat shock proteins，HSPs）是由各種應(yīng)激源誘導(dǎo)的應(yīng)激蛋白，在亞硝酸鹽環(huán)境中作為可靠的應(yīng)激指標(biāo)。許多研究認(rèn)為熱休克蛋白與細(xì)胞保護(hù)功能密切相關(guān)，它們?cè)诩?xì)胞和組織中的調(diào)節(jié)是一種應(yīng)激反應(yīng)[12-13]。

亞硝酸鹽暴露通過(guò)引起氧自由基在體內(nèi)積聚而誘發(fā)氧化應(yīng)激。GST是一種與肝臟解毒有關(guān)的重要酶。該蛋白催化涉及GSH 的反應(yīng)生成無(wú)毒或有毒的小GSH硫結(jié)合化合物，這些化合物與各種帶正電的內(nèi)源性或外源性物質(zhì)反應(yīng)，確保這些物質(zhì)可以很容易地從膽汁或尿液中排出[14]。生物絮凝體和海水中亞硝酸鹽暴露后，肝臟和鰓中的GST 活性均顯著升高，這可能是由于亞硝酸鹽暴露引起的抗氧化反應(yīng)，以防止氧化應(yīng)激[15]。暴露于亞硝酸鹽的鳙魚(yú)的GST 活性顯著增加。谷胱甘肽系統(tǒng)（谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物）在控制細(xì)胞氧化還原狀態(tài)和維持細(xì)胞正常生理功能方面具有關(guān)鍵作用；魚(yú)在氧化應(yīng)激下，GSH 對(duì)外界刺激的敏感度降低[16]。亞硝酸鹽暴露在生物絮團(tuán)和海水中后，肝臟和鰓中的谷胱甘肽顯著降低，有研究表明暴露于亞硝酸鹽的鳙魚(yú)肝臟中GSH的顯著減少，GSH的減少是由于GSH氧化為GSSG，從而消除了ROS，這一過(guò)程是作為氧化應(yīng)激的防御機(jī)制。此外，GSH 的還原與GST 活性密切相關(guān)，因?yàn)镚ST 通過(guò)結(jié)合親電氧自由基催化GSH 的還原[17]。魚(yú)類暴露于亞硝酸鹽會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS和RNS 的生成顯著增加[18]。海水養(yǎng)殖中的褐牙鲆，在水體亞硝酸鹽暴露后，顯著改變了SOD、CAT、GST和GSH等抗氧化反應(yīng)酶的活性，這種反應(yīng)可能通過(guò)刺激抗氧化防御系統(tǒng)而發(fā)生[19]。

膽堿酯酶廣泛存在于脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物中，對(duì)乙酰膽堿酯酶活性的抑制被認(rèn)為是一種可靠且精準(zhǔn)的生物標(biāo)志物，可用于評(píng)估暴露于毒物環(huán)境下魚(yú)類的神經(jīng)遞質(zhì)的毒性[20]。在生物絮凝體和海水中飼養(yǎng)的褐牙鲆（P.olivaceus）肝臟和鰓中的AChE 活性被水中亞硝酸鹽暴露顯著抑制[9]。暴露于高濃度亞硝酸鹽的卡特拉魮（Catla catla）、亞洲野鯪（rohu）和麥瑞加拉鯪（Cirrhinus mrigala）大腦和肝臟中的AChE 活性顯著降低[17]。進(jìn)一步表明了暴露于亞硝酸鹽的亞洲野鯪的大腦AChE 活性顯著降低。這種AChE 活性的抑制是由于亞硝酸鹽暴露應(yīng)激引起的突觸區(qū)域膽堿含量的增加，從而影響神經(jīng)傳遞并引起神經(jīng)毒性。

門診、急診就醫(yī)病人人流量較大、病情復(fù)雜多變[3-6]、病人及其家屬對(duì)醫(yī)院服務(wù)需求和服務(wù)質(zhì)量要求差異較大[7]，加之疾病譜變化，醫(yī)療保險(xiǎn)制度改革，導(dǎo)致異地就醫(yī)病人流動(dòng)性增加，造成綜合性醫(yī)院志愿服務(wù)隊(duì)伍人力資源合理配置難度增加。

亞硝酸鹽暴露可誘發(fā)滲透調(diào)節(jié)毒性作用，如低鈉血癥、低氯血癥、氯攝取抑制和鰓氯細(xì)胞衰竭，這些都是應(yīng)激源，導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)[21]。例如，血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白（亞硝酸鹽毒性的主要機(jī)制），這是一個(gè)高應(yīng)激因子，因?yàn)樗鼤?huì)誘導(dǎo)組織缺氧，而亞硝酸鹽暴露會(huì)導(dǎo)致應(yīng)激指標(biāo)顯著增加[22]。在這些脅迫指標(biāo)中，血漿葡萄糖是評(píng)價(jià)脅迫的關(guān)鍵，因?yàn)樵搮?shù)通常是通過(guò)環(huán)境脅迫誘導(dǎo)的糖異生作用而升高的[23]。在海水中的褐牙鲆的血漿葡萄糖濃度因水中亞硝酸鹽的暴露而顯著升高[24]。Roques等[25]發(fā)現(xiàn)暴露于亞硝酸鹽的尖齒胡鯰（Claris gariepinus）的血糖濃度顯著升高，這是由于密集的糖原分解和葡萄糖合成的升高。壓力刺激兒茶酚胺分泌，反應(yīng)增加糖原分解，從而升高血糖濃度[26]。此外，還報(bào)道了亞硝酸鹽暴露導(dǎo)致大菱鲆幼魚(yú)血糖濃度顯著升高。皮質(zhì)醇是魚(yú)類的主要應(yīng)激激素，受下丘腦-垂體-腎間軸（HPI）調(diào)節(jié)，在代謝中起重要的調(diào)節(jié)作用。皮質(zhì)醇被認(rèn)為是各種應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志，暴露于亞硝酸鹽96 h 的露斯塔野鯪（Labeo rohita）的血清皮質(zhì)醇顯著增加。以及暴露于亞硝酸鹽導(dǎo)致大菱鲆幼魚(yú)血漿皮質(zhì)醇濃度顯著增加[7]。在魚(yú)類中，應(yīng)激誘導(dǎo)的血漿皮質(zhì)醇或皮質(zhì)類固醇的增加會(huì)刺激淋巴器官的淋巴細(xì)胞減少，應(yīng)激誘導(dǎo)的血漿皮質(zhì)醇增加對(duì)先天非特異性免疫防御機(jī)制的影響已得到證實(shí)[27]。有研究表明，在海水中褐牙鲆血漿皮質(zhì)醇濃度因亞硝酸鹽濃度升高而顯著升高，這可能是由刺激下丘腦垂體腎間軸（HPI）引起的一般應(yīng)激反應(yīng)[24]。

眾所周知，暴露于有機(jī)毒物和重金屬的魚(yú)類通過(guò)熱休克蛋白控制應(yīng)激反應(yīng)，這與細(xì)胞保護(hù)功能有關(guān)，可以預(yù)防和修復(fù)蛋白質(zhì)損傷。熱休克蛋白在魚(yú)的細(xì)胞和組織中被調(diào)節(jié)，作為亞硝酸鹽暴露的應(yīng)激反應(yīng)[12]。HSP70因其對(duì)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用而被廣泛研究[13]。許多研究表明暴露于亞硝酸鹽的各種魚(yú)類的HSP70顯著增加，亞硝酸鹽暴露引起鰓、肝臟和腎臟等組織損傷[28]。亞硝酸鹽暴露也顯著提高了生物絮凝體和海水中褐牙鲆肝臟和鰓中HSP70 的濃度[24]。

3.3 亞硝酸鹽對(duì)鲆鰈類生理功能的影響

亞硝酸鹽通常對(duì)水生生物有毒，并破壞一些生理功能。血液參數(shù)已用于評(píng)估魚(yú)類的毒性作用[29]。亞硝酸鹽暴露通過(guò)將血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白影響魚(yú)類血液生理，引起內(nèi)源性一氧化氮產(chǎn)生等各種生理障礙，如炎癥、離子失調(diào)、內(nèi)分泌紊亂和排泄過(guò)程干擾等現(xiàn)象[21，25，30]。此外，亞硝酸鹽暴露顯著降低了在海水中飼養(yǎng)的褐牙鲆的血紅蛋白和紅細(xì)胞壓積的血液學(xué)參數(shù)[24]。Svobodova 等[31]報(bào)道了鯉魚(yú)（Cyprinus carpioL.）暴露于亞硝酸鹽后血紅蛋白的顯著降低。Avilez 等[27]也報(bào)道了暴露于亞硝酸鹽的石脂鯉（Brycon cephalus）的血紅蛋白和紅細(xì)胞壓積顯著降低。亞硝酸鹽暴露導(dǎo)致溶血性貧血，由于NADH高鐵血紅蛋白還原酶降低了高鐵血紅蛋白的含量，增加了紅細(xì)胞（RBCs）的能量需求，從而減少了紅細(xì)胞在脾臟和腎臟代謝之前的循環(huán)時(shí)間。Costao 等[32]進(jìn)一步研究點(diǎn)鰭紅眼脂鯉（Colossoma macropomum）暴露于亞硝酸鹽時(shí)紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白的顯著降低。通過(guò)血紅蛋白轉(zhuǎn)化為高鐵血紅蛋白而減少血紅蛋白是暴露于亞硝酸鹽的魚(yú)類的主要毒性作用，當(dāng)這些魚(yú)暴露于水中亞硝酸鹽時(shí)，觀察到灰鰭鯛（Sebastes inermis）的血紅蛋白顯著降低。類似的，Roques 等[25]發(fā)現(xiàn)暴露于亞硝酸鹽的尖齒胡鯰（Clarias gariepinus）的血紅蛋白也顯著降低。

有機(jī)血漿中的膽固醇成分是細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)中的重要物質(zhì)，也是所有類固醇激素的前體。毒性誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激通常會(huì)導(dǎo)致高膽固醇血癥。然而，相關(guān)研究認(rèn)為亞硝酸鹽會(huì)減少魚(yú)類體內(nèi)類固醇激素的合成，這可能與亞硝酸鹽向NO+的轉(zhuǎn)變有關(guān)[30-33]。Das等[34]認(rèn)為，在接觸毒物的情況下，血漿蛋白濃度可能會(huì)因蛋白質(zhì)分解代謝的增加而降低，以維持體內(nèi)平衡，將血液中的結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)化為能量。Kim 等[24]的試驗(yàn)證明，海水養(yǎng)殖中的褐牙鲆，血漿膽固醇濃度因亞硝酸鹽暴露而顯著降低，這可能抑制了類固醇激素的合成，對(duì)褐牙鲆血漿總蛋白濃度無(wú)顯著影響，所以亞硝酸鹽暴露不影響褐牙鲆蛋白質(zhì)分解代謝。

酶促血漿中的GOT 和GPT 已被廣泛作為暴露于有毒環(huán)境所引起的肝損傷的指標(biāo)[35]。海水養(yǎng)殖的褐牙鲆血漿中GOT 和GPT 濃度因水中亞硝酸鹽濃度升高而顯著升高，這可能是由于氮代謝紊亂引起的肝臟損傷所致。Hyun 等[36]研究了暴露于亞硝酸鹽后，歐洲鰻鱺（Anguilla Anguilla）的GOT 和GPT 顯著增加，并伴有肝壞死現(xiàn)象。以上表明，亞硝酸鹽的暴露會(huì)影響海水養(yǎng)殖的魚(yú)類的生產(chǎn)效率。

3.4 亞硝酸鹽對(duì)鲆鰈類免疫應(yīng)答的影響

環(huán)境變化往往會(huì)對(duì)魚(yú)類造成壓力，導(dǎo)致免疫力下降[37]。硬骨魚(yú)具有各種重要的防御分子，如溶菌酶、補(bǔ)體和IgM，它們參與保護(hù)機(jī)體，使其免受潛在有害條件的侵害[38]。LYS 是一種陽(yáng)離子酶，在防止魚(yú)類感染革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌方面起著關(guān)鍵作用[39]。有研究表明亞硝酸鹽暴露導(dǎo)致露斯塔野鯪的LYS 活性降低[40]。同時(shí)，LYS 基因在鰓組織中的表達(dá)也發(fā)生了類似的變化[41]。C3 和C4 是經(jīng)典途徑和凝集素途徑的關(guān)鍵成分，負(fù)責(zé)各種免疫效應(yīng)功能[42]。然而，補(bǔ)體的持續(xù)激活可能導(dǎo)致對(duì)宿主的不良反應(yīng)和免疫抑制[43]。研究表明，環(huán)境污染物導(dǎo)致魚(yú)類C3和C4基因或蛋白質(zhì)上調(diào)[44]。魚(yú)類有四類免疫球蛋白，它們是體液免疫系統(tǒng)的組成部分，包括IgM、IgD、IgT 和IgZ，由B 淋巴細(xì)胞分泌。在這些免疫球蛋白中，IgM 在魚(yú)類的適應(yīng)性免疫中具有關(guān)鍵功能，是評(píng)估魚(yú)類免疫毒性的關(guān)鍵因素[45]。在魚(yú)類中，一些研究報(bào)告了環(huán)境污染物，如硫酸銅、氨和二氧化碳，抑制了IgM 蛋白或mRNA 水平[46-47]。這些結(jié)果表明，亞硝酸鹽引起了大菱鲆的免疫毒性和體液免疫抑制。

在魚(yú)類中，2 個(gè)主要的HSP 家族是HSP70 和HSP90，它們被包括化學(xué)應(yīng)激、熱應(yīng)激和擁擠應(yīng)激的各種應(yīng)激源誘導(dǎo)，并參與免疫反應(yīng)[48-49]。魚(yú)體內(nèi)HSP70和HSP90水平的提高反映了蛋白質(zhì)損傷或?qū)罄m(xù)應(yīng)激耐受性的增強(qiáng)[50]。Jia 等[7，51]的研究表明，鰓中HSP70和HSP90基因的表達(dá)量隨著亞硝酸鹽濃度和暴露時(shí)間的增加而增加。這一結(jié)果與黃錫鯛（Sparus sarba）和團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala Yih）的研究一致。

魚(yú)體內(nèi)ROS 的大量產(chǎn)生會(huì)影響免疫力，并改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如脂質(zhì)、膜、蛋白質(zhì)和核酸[52]。魚(yú)類的免疫系統(tǒng)對(duì)環(huán)境壓力很敏感，免疫系統(tǒng)的變化被廣泛認(rèn)為是壓力源的可靠指標(biāo)。Miao[53]提示暴露于亞硝酸鹽影響免疫反應(yīng)，導(dǎo)致免疫抑制和免疫功能障礙。進(jìn)一步表明毒性環(huán)境可影響水生動(dòng)物的免疫反應(yīng)。在魚(yú)類體內(nèi)的各種防御分子中，溶菌酶在保護(hù)魚(yú)類免受細(xì)菌感染方面起著至關(guān)重要的作用。然而，亞硝酸鹽暴露可引起溶菌酶活性的增加。海水養(yǎng)殖的褐牙鲆暴露于亞硝酸鹽后血漿溶菌酶活性顯著提高，這可能是由免疫系統(tǒng)刺激引起的。因此，在亞硝酸鹽的環(huán)境脅迫下，魚(yú)體內(nèi)溶菌酶活性顯著增加。

3.5 亞硝酸鹽對(duì)鲆鰈類細(xì)胞凋亡的影響

一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞外刺激，如生物、化學(xué)或物理因素，通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)為細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，導(dǎo)致基因表達(dá)的變化[54]。亞硝酸鹽不僅引起氧化損傷，還可能引發(fā)細(xì)胞凋亡[55]。細(xì)胞凋亡是一種高度組織化的細(xì)胞過(guò)程，伴隨著大量細(xì)胞內(nèi)蛋白酶和內(nèi)切酶的激活。凋亡途徑主要分為2 類：死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑和線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。內(nèi)在和外在終點(diǎn)的共同事件是一組半胱氨酸蛋白酶（Caspases）的激活[56]。硬骨魚(yú)的鰓是排泄、滲透調(diào)節(jié)和呼吸的多功能器官，與溶解毒物直接接觸的面積較大。因此，鰓特別容易受到毒物的傷害。亞硝酸鹽暴露會(huì)導(dǎo)致鰓肥大、增生、上皮細(xì)胞壞死和滲透調(diào)節(jié)功能障礙。在水生動(dòng)物中，亞硝酸鹽暴露也促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Sun 等[50]報(bào)道亞硝酸鹽暴露誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因（Caspase-8 和Caspase-9）的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)了斑頭巨斑魚(yú)幼魚(yú)鰓細(xì)胞的凋亡。同樣，在凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）、斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）和羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）中也觀察到亞硝酸鹽誘導(dǎo)的血細(xì)胞凋亡[57-59]。然而，亞硝酸鹽對(duì)海洋魚(yú)類鰓細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響的研究資料非常有限。

Caspases 是半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞對(duì)不同刺激的凋亡反應(yīng)中起著重要作用。許多研究表明亞硝酸鹽可以通過(guò)Caspase 依賴通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[59]。Jia[7]發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽脅迫下大菱鲆鰓中Caspases-3、-7和-9的mRNA 水平升高。基于上述結(jié)果，推測(cè)亞硝酸鹽暴露通過(guò)激活大菱鲆的鰓中的啟動(dòng)子Caspase（Caspase-9）和效應(yīng)子Caspase-3 和-7 來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

此外，亞硝酸鹽暴露引起了凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，表明Caspase 依賴通路的激活（圖1）[7]。另外，亞硝酸鹽暴露造成鰓細(xì)胞的凋亡與接觸時(shí)間和濃度呈正相關(guān)。由于mRNA水平不一定能反映蛋白質(zhì)水平和活性，亞硝酸鹽誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在今后的研究中需要在蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步評(píng)價(jià)。在血液中，亞硝酸鹽暴露改變了離子穩(wěn)態(tài)，有助于metHb的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)和皮質(zhì)醇、葡萄糖和熱休克蛋白70 水平的升高。亞硝酸鹽暴露引起鰓的氧化應(yīng)激，引起脂質(zhì)過(guò)氧化和抗氧化劑的損失。此外，亞硝酸鹽誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激或NO 可能激活MAPK/JUK信號(hào)通路，增加P53 水平，觸發(fā)Caspase 級(jí)聯(lián)促進(jìn)凋亡[7]。

圖1 亞硝酸鹽誘導(dǎo)大菱鲆毒性模型

4 研究與展望

隨著養(yǎng)殖標(biāo)準(zhǔn)的日益提升以及養(yǎng)殖密度的日益增加，水域的養(yǎng)殖容量已到達(dá)甚至超過(guò)飽和水平，導(dǎo)致水域的生化狀態(tài)日益下降，水域的氨氮含量、亞硝酸鹽、硫化物等有毒、有害物質(zhì)不斷增加，養(yǎng)殖生物容易患病或者中毒致死，帶來(lái)很大的風(fēng)險(xiǎn)。因此，對(duì)于亞硝酸鹽對(duì)養(yǎng)殖生物的毒性危害問(wèn)題的研究，必須從基礎(chǔ)理論上入手，尋找多元化的解決方法。

一是選擇一些同科（屬）的養(yǎng)殖生物在同一試驗(yàn)環(huán)境下開(kāi)展試驗(yàn)。例如：可以選擇生活在同一水層，相同科（屬）且規(guī)格一致的魚(yú)開(kāi)展毒性試驗(yàn)，所得結(jié)果就有很大參考性。二是選擇目前常見(jiàn)的混養(yǎng)品種，某種魚(yú)和某種蝦在同一試驗(yàn)環(huán)境下開(kāi)展試驗(yàn)。目前，有關(guān)亞硝酸鹽對(duì)單胞藻、大型藻類、海膽和海參等的試驗(yàn)還較少。單胞藻作為重要的海洋初級(jí)生產(chǎn)力，是水產(chǎn)動(dòng)物的天然餌料，但隨著市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)的日益發(fā)達(dá)，工、農(nóng)廢物以及人類生活廢棄物對(duì)海洋的污染，導(dǎo)致了沿海地區(qū)赤潮頻繁、內(nèi)陸海洋水華不斷，亞硝酸鹽作為單胞藻的氮來(lái)源，是引起這些問(wèn)題的主要因素之一，有待進(jìn)一步深入研究。三是養(yǎng)殖技術(shù)方面，生物絮凝技術(shù)（BFT）是一種將環(huán)境污染降到最低的創(chuàng)新方法，因?yàn)樗簧婕八慕粨Q。BFT能使水中的有益微生物將氨氮和亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽。生物絮凝體中的微生物有助于水產(chǎn)養(yǎng)殖魚(yú)類的免疫功能和生理活性的提高，促進(jìn)生長(zhǎng)。開(kāi)發(fā)利用BFT養(yǎng)殖鲆鰈類，可以提高其育種水平，所以需要對(duì)生物絮團(tuán)養(yǎng)殖環(huán)境中各種物質(zhì)的耐受性標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行更多的研究。

水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)在中國(guó)以及全球都是主要的食物供應(yīng)行業(yè)之一，做好水產(chǎn)養(yǎng)殖的研究工作有利于推動(dòng)其科學(xué)、健康、長(zhǎng)期穩(wěn)定的增長(zhǎng)，對(duì)保證全國(guó)食品供應(yīng)、推動(dòng)社會(huì)主義市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)建設(shè)、改善從業(yè)者收入水平以及提高人們生活質(zhì)量等具有很大意義。