中性粒細(xì)胞在肝纖維化中的作用

齊婧姝 平大冰 孫鑫 胡旭東 彭淵 劉成海

肝纖維化是由多種病因如酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)、病毒性肝炎、膽汁淤積等導(dǎo)致的慢性肝損傷向肝硬化發(fā)展的關(guān)鍵病理過(guò)程,主要涉及肝細(xì)胞損傷、間質(zhì)細(xì)胞活化、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過(guò)度沉積等。近年來(lái),以肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)與肝臟天然免疫細(xì)胞所構(gòu)成的肝臟免疫微環(huán)境失衡而導(dǎo)致肝纖維化進(jìn)展是重要的研究熱點(diǎn),主要圍繞固有免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cells, NK cells)等與HSC間相互關(guān)系展開(kāi)研究[1],然而中性粒細(xì)胞在其中的作用卻鮮有關(guān)注。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為中性粒細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞,是一群有著抗菌功能的同質(zhì)細(xì)胞,但越來(lái)越多的證據(jù)表明,中性粒細(xì)胞具有免疫抑制性,并參與多種器官纖維化進(jìn)程[2,3],這表明中性粒細(xì)胞具有可塑性和異質(zhì)性。本文就中性粒細(xì)胞在肝纖維化中的作用展開(kāi)綜述。

一、中性粒細(xì)胞的基本生物學(xué)特征

中性粒細(xì)胞由骨髓造血干細(xì)胞發(fā)育而來(lái),造血干細(xì)胞經(jīng)多能祖細(xì)胞階段分化為粒細(xì)胞-單核細(xì)胞髓樣祖細(xì)胞,隨后在粒細(xì)胞集落刺激因子或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的作用下,經(jīng)成髓細(xì)胞、早幼粒細(xì)胞、中幼粒細(xì)胞、晚幼粒細(xì)胞等階段,最終分化為成熟的中性粒細(xì)胞,釋放至循環(huán)中。經(jīng)典的中性粒細(xì)胞從血液中募集至炎癥部位(包括肌肉、皮膚、腸系膜等),是通過(guò)選擇素-PSGL-整合素的途徑實(shí)現(xiàn)的。然而Senger團(tuán)隊(duì)研究發(fā)現(xiàn)肝臟招募中性粒細(xì)胞并不遵循此經(jīng)典途徑,他們認(rèn)為中性粒細(xì)胞通過(guò)與肝臟內(nèi)皮細(xì)胞的特異受體(Ⅰ型二肽酶)結(jié)合,從而募集至肝臟[4]。正常成人的中性粒細(xì)胞占循環(huán)白細(xì)胞的50%～70%,在小鼠中只有10%～25%[5,6],在人和小鼠外周血存活的半衰期分別為8小時(shí)和1.5小時(shí)[7,8]。盡管中性粒細(xì)胞的壽命很短,但其具有強(qiáng)大的趨化能力和吞噬功能,被認(rèn)為是固有免疫系統(tǒng)的第一道防線。事實(shí)上,中性粒細(xì)胞是循環(huán)中最豐富的白細(xì)胞,它可通過(guò)吞噬、脫顆粒、產(chǎn)生活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)等,形成中性粒細(xì)胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NET)來(lái)捕獲并消滅入侵微生物[9]。同時(shí),中性粒細(xì)胞釋放的髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)因子和ROS等亦可引起正常組織的損傷[10,11]。越來(lái)越多的證據(jù)表明,中性粒細(xì)胞在多種病因所致肝損傷和肝纖維化中扮演重要角色[12,13]。

二、中性粒細(xì)胞在不同病因所致肝纖維化中的作用

(一)脂肪性肝纖維化 脂肪性肝纖維化主要是指由ALD和NAFLD所引起的肝纖維化,其突出病理改變是肝組織內(nèi)出現(xiàn)明顯的肝細(xì)胞脂肪變性[14]。

中性粒細(xì)胞在脂肪性肝纖維化中起著促纖維化和抗纖維化的雙重作用,其促肝纖維化的機(jī)制如下:①ROS。在高脂飲食+乙醇誘導(dǎo)的脂肪性肝纖維化模型中,Zhou等發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞來(lái)源的ROS可促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展[15]。中性粒細(xì)胞受到胞外信息(如激素、細(xì)胞因子、細(xì)菌等)的刺激時(shí)被激活,胞膜形成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)復(fù)合體,催化胞外O2生成大量ROS,如過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)等,引起肝細(xì)胞G2期細(xì)胞阻滯,導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡和壞死[16]后釋放腫瘤壞死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β),并激活鄰近HSC[17,18]。②MPO。MPO是主要存在于中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒中的一種血紅素蛋白,可作為中性粒細(xì)胞和NET的特異性標(biāo)記物[19]。MPO可通過(guò)脫顆粒和NET釋放至胞外,發(fā)揮殺滅病原微生物及促纖維化的作用。在低密度脂蛋白受體缺陷小鼠(NASH易感)的模型中,MPO缺乏可減輕纖維化嚴(yán)重程度[20]。其機(jī)制如下:MPO可激活促纖維化細(xì)胞因子TGF-β,進(jìn)而激活HSC[21];同時(shí),釋放至胞外的MPO可催化H2O2生成高氧化性的次氯酸,其可失活基質(zhì)金屬蛋白酶7,從而抑制ECM的降解[22];此外,與MPO相關(guān)的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物可通過(guò)激活核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor-kappa B,NF-kB)和誘導(dǎo)cmyb核表達(dá)刺激HSC激活[23]。③人中性粒細(xì)胞多肽-1(human neutrophil polypeptide-1,HNP-1)。HNP-1是儲(chǔ)存在中性粒細(xì)胞嗜天青顆粒中的一種防御素,即抗菌蛋白[24]。和MPO一樣,中性粒細(xì)胞在受到胞外信息被激活時(shí),HNP-1會(huì)釋放到胞外。Hashimoto等予HNP-1轉(zhuǎn)基因小鼠膽堿缺乏性氨基酸飲食誘導(dǎo)脂肪性肝纖維化,發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞來(lái)源的HNP-1可誘導(dǎo)HSC激活并增殖,使膠原產(chǎn)生增加[25]。此外,HNP-1也可通過(guò)抑制肝細(xì)胞B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(B cell lymphoma-2,Bcl-2)的表達(dá),通過(guò)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡促進(jìn)肝纖維化[26]。

中性粒細(xì)胞減輕肝纖維化的機(jī)制與微小RNA-223(microRNA-223,miR-223)密切相關(guān)。miR-223是中性粒細(xì)胞中表達(dá)最豐富的miRNA之一,并在中性粒細(xì)胞來(lái)源的胞外囊泡中特異性富集,miR-223在包括肝臟疾病在內(nèi)的各種疾病的炎癥控制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[27]。miR-223可以通過(guò)胞外囊泡從中性粒細(xì)胞傳遞到肝巨噬細(xì)胞,在肝巨噬細(xì)胞中,miR-223抑制NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3),將促炎型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為一種恢復(fù)表型,以減輕蛋氨酸和膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的脂肪性肝纖維化模型[28];miR-223也可由中性粒細(xì)胞經(jīng)胞外囊泡轉(zhuǎn)移至肝細(xì)胞,并通過(guò)靶向抑制肝細(xì)胞中的C-X-C基序趨化因子10(C-X-C motif chemokine 10,CXCL10),以及與pdz結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ)表達(dá)[29],遏止脂肪性肝纖維化的發(fā)生及發(fā)展。

(二)感染性肝纖維化 感染性肝纖維化由病毒、細(xì)菌、真菌等病原微生物引起的感染性肝病進(jìn)展而來(lái),以乙型和丙型肝炎病毒性肝炎最為常見(jiàn)。研究發(fā)現(xiàn),由病毒性肝炎進(jìn)展至肝纖維化的患者肝組織中,白細(xì)胞介素-17(interleukin-17, IL-17)陽(yáng)性的中性粒細(xì)胞可在纖維化間隔和門脈區(qū)特異性累積,并與循環(huán)中IL-17表達(dá)呈正相關(guān)[30]。IL-17是一種具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子[31],通常IL-17即特指IL-17A[32]。除了由輔助性T細(xì)胞分泌,中性粒細(xì)胞亦為其主要來(lái)源[30]。IL-17以c-Jun末端激酶(JNK)依賴的方式增加HSC中的TGF-β受體,增加母親DPP同源物3(mothers against decapentaplegic homolog 3,SMAD3)的磷酸化,從而激活HSC[33]。IL-17A還可通過(guò)激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases,ERK1/2),以及p38信號(hào)通路促進(jìn)HSC激活和膠原蛋白表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展[34]。因此IL-17+中性粒細(xì)胞可通過(guò)分泌IL-17在局部促進(jìn)纖維化的進(jìn)展,有望成為減輕甚至治愈肝纖維化的有效靶點(diǎn)。

(三)化學(xué)試劑誘導(dǎo)的肝纖維化 肝纖維化體內(nèi)試驗(yàn)的開(kāi)展少不了小鼠肝纖維化模型的建立,而誘導(dǎo)小鼠肝纖維化最常見(jiàn)的化學(xué)試劑就是四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)。中性粒細(xì)胞在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化中發(fā)揮著促纖維化和抗纖維化的雙重作用。相關(guān)機(jī)制如下:①基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)。MMP-9又稱為明膠酶B,可儲(chǔ)存在中性粒細(xì)胞明膠酶顆粒中。Eiko Saijou等敲除小鼠trib1基因,人為使小鼠肝臟中性粒細(xì)胞增加,結(jié)果顯示:CCl4造模4周后,trib1敲除的小鼠與野生型小鼠肝臟相比,中性粒細(xì)胞顯著增多,而纖維化程度明顯減少,且中性粒細(xì)胞來(lái)源MMP-9顯著升高。這表明中性粒細(xì)胞可通過(guò)表達(dá)MMP-9,從而抑制金屬蛋白酶組織抑制劑1 (tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1, TIMP1),進(jìn)而促進(jìn)ECM的降解[35]。②中性粒細(xì)胞經(jīng)胞外囊泡轉(zhuǎn)移至肝細(xì)胞及HSC的miR-223,可分別通過(guò)抑制肝細(xì)胞中TAZ-IHH-GLI2通路及靶向GLI家族鋅指蛋白2(GLI family zinc finger 2,GLI2)和血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α/β(platelet-derived growth factor receptor α/β,PDGFα/β),直接抑制HSC的激活和增殖,從而改善肝纖維化[36]。③其他。有研究發(fā)現(xiàn)CCl4小鼠肝纖維化模型中性粒細(xì)胞具有顯著的NETosis激活,MPO釋放,ROS暴發(fā),從而促進(jìn)肝纖維化[37]。此外,中性粒細(xì)胞下調(diào)丁酸受體G蛋白偶聯(lián)受體43,上調(diào)TNF-α和IL-6的分泌,從而促進(jìn)腸道微生物易位,加重CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化[38]。

(四)膽汁淤積性肝纖維化 由膽道結(jié)石、腫瘤、膽道寄生蟲病、膽管閉鎖、膽管炎等引起的慢性炎癥進(jìn)展而來(lái)的肝纖維化稱為膽汁淤積性肝纖維化。在膽道梗阻誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝纖維化模型中,中性粒細(xì)胞可抑制肝纖維化的進(jìn)展。Harty等發(fā)現(xiàn)抑制中性粒細(xì)胞會(huì)降低基質(zhì)金屬蛋白酶8(matrix metalloproteinase-8,MMP-8),又稱為中性粒細(xì)胞膠原酶的活性及膠原吸收,這表明中性粒細(xì)胞來(lái)源的MMP-8或其介導(dǎo)的固有肝臟MMP的激活是肝纖維化修復(fù)成功的關(guān)鍵[39]。

三、總結(jié)及展望

中性粒細(xì)胞是人體固有免疫的第一道防線,是第一個(gè)到達(dá)病灶的免疫細(xì)胞,較早產(chǎn)生免疫應(yīng)答;而在肝纖維化中后期階段,中性粒細(xì)胞及其因子或產(chǎn)物可在多種病因引起的肝纖維化中發(fā)揮促進(jìn)和抑制肝纖維化的作用,似一把“雙刃劍”。我們總結(jié)中性粒細(xì)胞促進(jìn)纖維化作用機(jī)制主要如下:①產(chǎn)生ROS引起肝細(xì)胞凋亡壞死,釋放TNF-α/TGF-β,進(jìn)而激活HSC。②釋放MPO通過(guò)激活NFκB和誘導(dǎo)cmyb核表達(dá)或直接激活TGF-β,進(jìn)而誘導(dǎo)HSC活化;其氧化產(chǎn)物HOCl失活具有降解細(xì)胞外基質(zhì)作用的MMP7。③表達(dá)HNP-1抑制肝細(xì)胞Bcl-2的表達(dá),引起肝細(xì)胞的凋亡釋放TNF-α/TGF-β,進(jìn)而激活HSC。④分泌IL-17通過(guò)激活ERK1/2、p38或JNK-SMAD3-TGFβ信號(hào)通路,激活HSC(圖1)。

圖1 中性粒細(xì)胞在肝纖維化中的作用機(jī)制

中性粒細(xì)胞抑制纖維化作用主要機(jī)制:①中性粒細(xì)胞可將富含miR-223的胞外囊泡轉(zhuǎn)移至肝細(xì)胞、肝巨噬細(xì)胞、HSC,并分別通過(guò)抑制TAZ-IHH-GLI2通路、促使肝巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為恢復(fù)型、靶向GLI2和PDGFα/β,抑制HSC的激活,進(jìn)而減輕肝纖維化。②中性粒細(xì)胞來(lái)源的MMP9可中和TIMP1,進(jìn)而促進(jìn)纖維膠原降解(圖1)。

中性粒細(xì)胞在肝纖維化中的作用仍有較大的研究空間,體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:①機(jī)制研究不夠深入。例如,MPO怎么激活TGF-β?HNP-1如何抑制肝細(xì)胞Bcl-2表達(dá)?這些問(wèn)題尚無(wú)研究涉及。②與肝纖維化相關(guān)的中性粒細(xì)胞亞群待研究。

肝內(nèi)中性粒細(xì)胞的亞群包括腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞(tumor-associated neutrophils,TAN)、多性核髓源抑制細(xì)胞(polymorphonuclear-myeloid-derived suppressor cells,PMN-MDSC)等,然而它們與肝纖維化的關(guān)系尚無(wú)報(bào)道。Lemmers等雖發(fā)現(xiàn)在纖維化肝臟中存在一群分泌IL-17的中性粒細(xì)胞,這群中性粒細(xì)胞與肝纖維化的進(jìn)展呈正相關(guān),但尚無(wú)具體研究此群細(xì)胞的相關(guān)論述。解決并深入研究上述問(wèn)題將為臨床抗肝纖維化治療提供靶點(diǎn),促進(jìn)抗肝纖維化藥物的研發(fā)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。