王浩田,蔣景龍,吳 強(qiáng),秦公偉,任可心,李 麗,丁德寬

(1 陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,陜西漢中,723000;2 漢臺(tái)區(qū)蔬菜果品技術(shù)推廣中心,陜西漢中,723000;3 城固縣果業(yè)技術(shù)指導(dǎo)站,陜西漢中,723200)

“枳雀”(CitruswilsoniiTanaka ‘Zhique’)為蕓香科,柑桔亞科,柑桔屬,香圓種植物,別名有香櫞、氣柑、宜昌檸檬等,是陜南地區(qū)一種天然地方柑桔品種,至今已有500多年的栽培歷史,目前發(fā)現(xiàn)枳雀的最大樹齡已經(jīng)超過(guò)300年,生產(chǎn)中又可分為粗皮枳雀和細(xì)皮枳雀兩種類型[1-3]。李航等[4]研究認(rèn)為,枳雀的母本為柚類或者具有柚類母本血緣的雜交柑桔品種,父本是一個(gè)具有枳的血緣的雜交柑桔品種。枳雀是陜南柑桔苗木繁育重要的優(yōu)良砧木之一。枳雀做柑桔砧木,具有很強(qiáng)的抗性,如:抗旱性[2]、抗鹽堿性[3]以及抗凍性[5]等,并且在堿性土壤條件下枳雀砧柑桔植株表現(xiàn)出極強(qiáng)的抗缺鐵黃化性狀[6]。據(jù)《中國(guó)藥典》記載,枳雀青果切片制干藥用在治療咳嗽、炎癥、多痰等癥狀中有重要作用[7]。

柑桔具有童期長(zhǎng)、雜合度高、多胚性等特點(diǎn),這使得柑桔的定向改良育種與遺傳親本分析變得異常困難[8-9]。隨著分子生物學(xué)和植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷成熟,利用生物技術(shù)進(jìn)行植物育種已經(jīng)成為了可能。Hidaka等[10]在1990年首次利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了一株華盛頓臍橙轉(zhuǎn)基因植株。當(dāng)直接利用柑桔實(shí)生苗作為遺傳轉(zhuǎn)化的起始材料時(shí),大多數(shù)柑桔實(shí)生苗仍處于童期,經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植物必須經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的生長(zhǎng)周期才能進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀測(cè)和轉(zhuǎn)基因植株基因性狀表達(dá)等研究。以成熟柑桔莖段、頂芽和側(cè)芽等外植體材料作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體,能極大程度地縮短柑桔育種周期,但卻存在再生率低等特點(diǎn)。柑桔組織培養(yǎng)相較于葡萄[11]、沙梨[12]等其他水果作物更加困難,這進(jìn)一步增加了柑桔遺傳轉(zhuǎn)化的難度。因此,對(duì)于柑桔轉(zhuǎn)基因研究而言,建立柑桔類植物高效穩(wěn)定的快繁體系尤為重要。

柑桔組織培養(yǎng)已有50多年的歷史。黃純真等[13](1978年)利用成年金桔嫩枝側(cè)芽為外植體,成功建立了金桔體外再生體系;Kobayashi等[14](2003年)以甜橙成熟莖段為外植體,通過(guò)微芽嫁接方法成功獲得甜橙完整植株;陳國(guó)華等[15](2016年)研究了兩個(gè)柑桔品種(紅江橙、沙糖桔)的頂芽、側(cè)芽、莖段對(duì)芽增殖的影響,建立了一種新型的柑桔脫毒苗快繁體系。柑桔組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)日趨成熟。迄今為止,關(guān)于枳雀再生體系建立相關(guān)的研究仍未見(jiàn)報(bào)道。本研究以枳雀實(shí)生幼苗莖段為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)快速繁育,旨在于建立一種高效穩(wěn)定的枳雀快繁體系,為后續(xù)枳雀的遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

枳雀實(shí)生苗種植于陜西理工大學(xué)植物逆境與細(xì)胞工程課題組培養(yǎng)室,待其生長(zhǎng)到4個(gè)月大時(shí)取莖段為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 莖段表面消毒和接種 挑選長(zhǎng)勢(shì)良好的枳雀上部幼嫩莖段,自來(lái)水沖洗1～2 h,沖洗干凈后剪切成2～5 cm長(zhǎng),轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái),用75%乙醇溶液浸泡30 s,蒸餾水沖洗3次,0.1%升汞溶液浸泡6 min,蒸餾水沖洗3～5次,于無(wú)菌濾紙上吸干表面多余水分,再剪切成0.7～1 cm長(zhǎng),接種到MT培養(yǎng)基[14]中,在培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度為(25±1) ℃,光/暗周期12 h/12 h,光照強(qiáng)度為2 000 lx,相對(duì)濕度為50%～60%。

腋芽分化條件篩選:選用MT基本培養(yǎng)基(pH值5.8),內(nèi)含8 g/L瓊脂和50 g/L蔗糖,分別添加0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL的KT和6-BA,以MT培養(yǎng)基為對(duì)照。每個(gè)處理設(shè)置3組重復(fù),每個(gè)重復(fù)接種5瓶,每瓶接種3個(gè)外植體。培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計(jì)膨大率,培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)腋芽誘導(dǎo)率和分化系數(shù)。膨大率=(膨大外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%,腋芽誘導(dǎo)率=(出芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%,腋芽分化系數(shù)=腋芽總數(shù)/接入外植體總數(shù)。

誘導(dǎo)生根條件篩選:挑選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的芽,轉(zhuǎn)接到添加有0(對(duì)照)、0.1、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL IBA的1/2 MT(內(nèi)含8 g/L瓊脂和50 g/L蔗糖)與1/2 MSN[16](內(nèi)含7 g/L瓊脂和30 g/L蔗糖)生根培養(yǎng)基中。每個(gè)處理設(shè)置3組重復(fù),每個(gè)重復(fù)接種10瓶,每瓶接種2個(gè)外植體。培養(yǎng)45 d后對(duì)再生苗生長(zhǎng)狀況進(jìn)行觀察,并統(tǒng)計(jì)生根率和生根系數(shù),培養(yǎng)90 d后觀察根系生長(zhǎng)狀況。生根率=(生根芽數(shù)/接種芽總數(shù))×100%,生根系數(shù)=生根條數(shù)/生根芽總數(shù)。

1.2.3 移栽和馴化 將根系發(fā)育良好的再生苗從培養(yǎng)基中移出,用無(wú)菌蒸餾水將培養(yǎng)基徹底沖洗干凈,隨后轉(zhuǎn)移到含有滅菌營(yíng)養(yǎng)土(泥炭土∶蛭石∶珍珠巖=1∶1∶1)的花盆中,封口膜封口進(jìn)行馴化處理。1個(gè)月后由培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到室外培養(yǎng)并統(tǒng)計(jì)成活率。成活率=(成活苗數(shù)/移栽苗總數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖段腋芽分化誘導(dǎo)培養(yǎng)

將消毒后的莖段接種于不同配方植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng),均能誘導(dǎo)腋芽分化。外植體培養(yǎng)第7天可觀察到明顯的膨大現(xiàn)象(見(jiàn)圖1A),第10天時(shí)外植體上已經(jīng)萌發(fā)出幼嫩腋芽(見(jiàn)圖1B),第15天時(shí)腋芽已經(jīng)逐漸舒展開且又有新腋芽長(zhǎng)出(見(jiàn)圖1C)。隨著時(shí)間延長(zhǎng),腋芽進(jìn)一步分化形成出新的莖和葉片。培養(yǎng)30 d時(shí),新生的莖明顯伸長(zhǎng)且分化出3～5片葉片,與添加6-BA相比,未添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和添加KT的新生莖短而葉片寬厚(見(jiàn)圖1D、E和F)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),當(dāng)培養(yǎng)基中添加0.5 mg/mL 6-BA和1.0 mg/mL 6-BA時(shí),均可取得較好的培養(yǎng)效果。其中,添加1.0 mg/mL 6-BA時(shí),外植體膨大率(88.89%)、腋芽誘導(dǎo)率(88.89%)和腋芽分化系數(shù)(1.56)均最大,培養(yǎng)效果最佳(見(jiàn)表1)?？梢?jiàn),添加1.0 mg/mL 6-BA的MT培養(yǎng)基是誘導(dǎo)枳雀莖段腋芽分化的最佳培養(yǎng)基。

表1 不同濃度KT和6-BA對(duì)枳雀莖段腋芽分化的影響

注:A:外植體膨大(培養(yǎng)7 d);B:腋芽萌發(fā)(培養(yǎng)10 d);C:發(fā)育階段的腋芽,箭頭所示為新萌發(fā)的腋芽(培養(yǎng)15 d);D:附加6-BA形成的腋芽(培養(yǎng)30 d);E:MT培養(yǎng)基萌發(fā)的腋芽(不含任何激素,培養(yǎng)30 d);F:附加KT形成的腋芽(培養(yǎng)30 d)。

2.2 生根培養(yǎng)

將枳雀莖段誘導(dǎo)出的幼芽,在添加不同濃度IBA的1/2 MT和1/2 MSN培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。1/2MT培養(yǎng)基最早出根時(shí)間為9 d,1/2MSN培養(yǎng)基最早出根時(shí)間為18 d。培養(yǎng)45 d時(shí),1/2MT培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的根細(xì)長(zhǎng),而1/2MSN培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的根則比較粗短(見(jiàn)圖2A、B和C);在組培瓶中培養(yǎng)90 d時(shí),根均進(jìn)一步伸長(zhǎng)且長(zhǎng)出側(cè)根,在1/2MT培養(yǎng)基中莖段生長(zhǎng)迅速、側(cè)根較少,在1/2MSN培養(yǎng)基莖段發(fā)育緩慢、側(cè)根更多(見(jiàn)圖2D、E和F)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)45 d,添加2.0 mg/mL IBA的1/2MT培養(yǎng)基的生根率(86.67%)最大,平均根長(zhǎng)(7.75 cm)和生根系數(shù)(1.15)較大,總體生根效果最佳(見(jiàn)表2)。

表2 不同培養(yǎng)基和不同濃度IBA對(duì)枳雀幼芽生根的影響

注:A:1/2MT培養(yǎng)基,培養(yǎng)45 d;B:1/2MSN培養(yǎng)基,培養(yǎng)45 d;C:左為1/2MT培養(yǎng)基,右為1/2MSN培養(yǎng)基,培養(yǎng)45 d;D:1/2MT培養(yǎng)基,培養(yǎng)90 d;E:1/2MSN培養(yǎng)基,培養(yǎng)90 d;F:左為1/2MT培養(yǎng)基,右為1/2MSN培養(yǎng)基,培養(yǎng)90 d。

2.3 再生苗移栽和馴化

生根培養(yǎng)90 d、已經(jīng)生根的再生苗,去除組培瓶封口膜,在培養(yǎng)室中敞口3 d。用鑷子將根系發(fā)育良好的再生苗從培養(yǎng)基中輕輕夾出,注意不要損傷根系,隨后移栽到滅菌基質(zhì)上(見(jiàn)圖3)。移栽好后,在培養(yǎng)室內(nèi)采用封口膜封口(見(jiàn)圖3)和定期敞口的辦法進(jìn)行馴化處理,即每3 d進(jìn)行一次敞口,敞口時(shí)間隨敞口次數(shù)的增加而延長(zhǎng),分別為1、2、4、8、12 h,最后完全敞口,1個(gè)月后轉(zhuǎn)移至室外進(jìn)行培養(yǎng)。移栽后完成馴化的幼苗,葉片鮮綠,莖段相比于移栽前進(jìn)一步發(fā)育(見(jiàn)圖3)。試驗(yàn)共移栽枳雀組培苗100株,成活率高達(dá)96%。

圖3 枳雀組培苗的移栽和馴化

3 討論

建立高效的植物再生體系是轉(zhuǎn)基因研究的基礎(chǔ)。目前關(guān)于柑桔組織培養(yǎng)的報(bào)道已有很多,但不同柑桔種類之間的再生仍存在一定差異。洪磊等[17]以化州桔紅成年態(tài)半木質(zhì)化新梢莖段為外植體的腋芽誘導(dǎo)率為60%以上。Ramha等[18]在關(guān)于“Maltese halfblood”的報(bào)道中,芽萌發(fā)率僅有40%左右。本研究中以枳雀實(shí)生幼苗莖段為外植體,腋芽誘導(dǎo)率高達(dá)88.89%。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究存在差異的主要原因可能是試驗(yàn)所取外植體及培養(yǎng)條件不同。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)植物離體再生發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其中,細(xì)胞分裂素在植物芽再生過(guò)程中作用顯著,大多數(shù)植物材料以6-BA最為有效,但不同材料最適6-BA濃度卻存在較大差異[19]。文露清等[20]在研究金柑時(shí)發(fā)現(xiàn),2.0 mg/mL 6-BA最適合進(jìn)行幼芽分化。鄒金美等[21]在研究文旦柚和下河蜜柚成年樹幼嫩莖段外植體不定芽分化時(shí)僅添加0.5 mg/mL 6-BA便可取得較好的再生效果。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),最適合枳雀實(shí)生幼苗莖段外植體腋芽分化的6-BA濃度為1.0 mg/mL。以上結(jié)果證實(shí)6-BA在誘導(dǎo)芽分化過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,最適6-BA濃度可能與柑桔種類等有關(guān)。

生長(zhǎng)素在植物離體再生過(guò)程中對(duì)根系誘導(dǎo)有著顯著的作用,其中以IBA的促根效果最好,且根的進(jìn)一步生長(zhǎng)較為正常。楊莉等[22]在誘導(dǎo)金柑生根時(shí)發(fā)現(xiàn),添加3.0 mg/mL IBA的1/2 MS培養(yǎng)基更適于金柑幼芽生根,生根率為86.7%。Tongbram等[16]發(fā)現(xiàn),在1/2 MSN培養(yǎng)基中添加1.0 mg/mL IAA更有助于粗檸檬(CitrusjambhiriLush.)幼芽生根,生根率為80%。本試驗(yàn)中,誘導(dǎo)枳雀幼芽生根的最佳培養(yǎng)條件為附加2.0 mg/mL IBA的1/2MT培養(yǎng)基,生根率為86.67%。

4 結(jié)論

枳雀幼嫩莖段外植體,以MT+1.0 mg/mL 6-BA培養(yǎng)基最適合腋芽分化,腋芽誘導(dǎo)率為88.89%,分化系數(shù)為1.56;最佳生根培養(yǎng)基為1/2MT+2.0 mg/mL IBA,平均根長(zhǎng)為7.75 cm,生根率為86.67%,生根系數(shù)為1.15。本研究首次建立了柑桔品系枳雀的快速繁育體系,為后續(xù)的枳雀快繁體系優(yōu)化及遺傳轉(zhuǎn)化工作奠定了基礎(chǔ)。