銀州柴胡根的發(fā)育解剖學(xué)研究

李 根,韓桂軍,李為民,李 斌,周亞福

(1 陜西省西安植物園[陜西省植物研究所],西安 710061;2 陜西省植物資源保護(hù)與利用工程技術(shù)研究中心,西安 710061)

銀州柴胡(BupleurumyinchowenseShan et Y. Li)隸屬于傘形科(Umbelliferae)柴胡屬,為多年生草本植物。藥用部位為干燥根,異名紅柴胡、紅軟柴胡、軟柴胡(陜西),臥銀花(陜西橫山)[1]。其主要有效成分為皂苷和揮發(fā)油等,具有和解退熱、疏肝解郁、升提中氣的功效[2]。

銀州柴胡作為柴胡類(lèi)藥材的一種,其名稱(chēng)的出現(xiàn)可追溯至宋代或更早?！侗静輬D經(jīng)》中提及:“柴胡-銀夏出者獨(dú)勝”。《本草別說(shuō)》亦稱(chēng):“柴胡-唯銀夏者最良”等[3]?？梢?jiàn)在宋代-明代時(shí)期,銀州一帶所產(chǎn)的柴胡普遍為醫(yī)家所知,并被認(rèn)為是品質(zhì)優(yōu)良的一類(lèi)。西北傳統(tǒng)醫(yī)藥認(rèn)為,銀州柴胡為柴胡中品質(zhì)最佳品種,且銷(xiāo)售量較大,部分地區(qū)已將其列入地方標(biāo)準(zhǔn)。主要分布在陜西、寧夏、甘肅和內(nèi)蒙等省區(qū),是陜甘寧中藥柴胡主流品種之一[4]。銀州柴胡在陜西省有悠久的藥用歷史,在陜西北部作紅柴胡入藥。本課題組前期對(duì)柴胡屬5種藥用植物總皂苷和總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定,發(fā)現(xiàn)銀州柴胡主要化學(xué)成分柴胡皂苷和總黃酮含量均較高,與藥典收錄的北柴胡和狹葉柴胡主要成分含量類(lèi)似,表明銀州柴胡品質(zhì)優(yōu)良,具有很好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[5]。

為進(jìn)一步合理開(kāi)發(fā)和利用柴胡屬其他野生植物資源,很有必要對(duì)銀州柴胡這一優(yōu)良種質(zhì)進(jìn)行深入系統(tǒng)研究。目前關(guān)于銀州柴胡的研究主要集中在有效成分的分離提取[2,5-8]、中藥鑒定[9-10]以及本草考證[11]等方面。本研究以銀州柴胡藥用部位根為研究對(duì)象,旨在揭示其藥用部位的發(fā)生發(fā)育特點(diǎn),為柴胡屬藥用植物的分類(lèi)鑒定及有效成分積累的研究等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

研究材料為傘形科柴胡屬銀州柴胡(BupleurumyinchowenseShan et Y. Li),采自陜西省咸陽(yáng)市永壽縣(34°41′26.88″ N,108°8′40.92″ E),選取健康生長(zhǎng)的銀州柴胡根作為試驗(yàn)材料。

采用石蠟切片法對(duì)藥用植物銀州柴胡根進(jìn)行發(fā)育解剖學(xué)研究。取銀州柴胡根尖、初生結(jié)構(gòu)和次生結(jié)構(gòu)的根,切割至3～5 mm的小段,浸入50%FAA固定液(V∶V,50%酒精∶冰醋酸∶甲醛=90∶5∶5)進(jìn)行固定48 h[12]。經(jīng)梯度酒精進(jìn)行脫水(50%,70%,80%,95%,100%,100%酒精)后,二甲苯透明,石蠟包埋。使用Leica RM 2135旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切片,厚度為7～12 μm。切片后經(jīng)番紅-固綠染色與鐵礬-蘇木精染色[12]。Leica全自動(dòng)熒光生物顯微鏡(Leica DM 3000 CCD:DFC7000 T)鏡檢并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 根尖及其組織分化

研究對(duì)銀州柴胡根尖進(jìn)行了橫切和縱切。結(jié)果表明,銀州柴胡的根尖從上到下分為:根冠、分生區(qū)、伸長(zhǎng)區(qū)和成熟區(qū)(根毛區(qū))4個(gè)部分(圖1,A)。根冠位于根尖的最先端,縱切面呈帽子狀;橫切面上根冠細(xì)胞總體上形狀不規(guī)則,均由薄壁細(xì)胞組成(圖1,B)。根冠最內(nèi)方的細(xì)胞體積小,細(xì)胞核大而圓,細(xì)胞質(zhì)濃厚;最外方的細(xì)胞體積較大,細(xì)胞核部分消失,液泡大而明顯(圖1,A)。分生區(qū)緊鄰根冠,位于根冠和伸長(zhǎng)區(qū)之間即頂端分生組織,頂端分生組織由原分生組織(圖1,C)及其衍生的初生分生組織組成(圖1,D)。

A. 根尖縱切,示根冠、分生區(qū)、伸長(zhǎng)區(qū)和成熟區(qū);B. 根冠橫切;C. 原生分生組織;D. 原表皮外方的根冠組織、原表皮、皮層原以及中柱原;E. 表皮、皮層和維管柱以及原生韌皮部篩管;F. 熒光顯微照片,表皮、皮層和維管柱以及原生韌皮部篩管;G. 根初生結(jié)構(gòu),由表皮、皮層和維管柱組成;H. 熒光顯微照片,示內(nèi)皮層凱氏帶以及表皮細(xì)胞明顯的徑向壁加厚。Co.皮層;CC.木栓形成層;CL.木栓層;CS.凱氏帶;EN.內(nèi)皮層;EP.表皮;IC.皮層原;IS.中柱原;PE.中柱鞘;PP.原表皮;PPS.原生韌皮部篩管;PRP.原生韌皮部;PRX.原生木質(zhì)部;RC.根冠;RWT.徑向壁加厚;S.中柱;SC.分泌道;SXF.次生木質(zhì)部纖維;VS.維管形成層。

原分生組織細(xì)胞由未分化的細(xì)胞組成,其細(xì)胞體積小、等徑、排列緊密、細(xì)胞壁薄而細(xì)胞質(zhì)濃厚、細(xì)胞核大而明顯且液泡極小,具有典型的分生組織的特點(diǎn)。初生分生組織位于原分生組織前后方,由原分生組織細(xì)胞的衍生細(xì)胞組成,其組織細(xì)胞已開(kāi)始分化,細(xì)胞體積增大且呈長(zhǎng)方形,細(xì)胞質(zhì)逐漸變薄,液泡體積增大。

在縱切片上,銀州柴胡根初生分生組織由根冠原、表皮原、皮層原和中柱原四部分組成(圖1,A)。根冠原位于原分生組織上方,是根冠最內(nèi)方的細(xì)胞群,其分化產(chǎn)生根冠(圖1,B)。從橫切面上,表皮原位于根初生分生組織的最外方,由一層排列緊密且整齊的細(xì)胞組成,細(xì)胞體積小而呈矩形,細(xì)胞質(zhì)濃厚(圖1,D)。皮層原位于表皮原的下方,5～7層類(lèi)圓形或矩形的細(xì)胞組成(圖1,D)。中柱原位于根的中央,細(xì)胞體積小,等徑或呈圓形、類(lèi)圓形,細(xì)胞質(zhì)濃厚且細(xì)胞核大而明顯(圖1,D)。

2.2 根初生生長(zhǎng)與初生結(jié)構(gòu)

銀州柴胡根的初生結(jié)構(gòu)是通過(guò)初生生長(zhǎng)過(guò)程中初生分生組織的衍生細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟而來(lái)。在此過(guò)程中,原表皮組織形成根的表皮,皮層原或基本分生組織形成根的皮層,中柱原形成根的維管柱。表皮、皮層和維管柱組成銀州柴胡根的初生結(jié)構(gòu)。

在初生結(jié)構(gòu)分化過(guò)程中,皮層出現(xiàn)相對(duì)較早,其次為表皮層和中柱的出現(xiàn)。早期形成的表皮細(xì)胞,等徑或類(lèi)圓形,排列緊密,隨著表皮細(xì)胞的成熟,其細(xì)胞呈長(zhǎng)方柱形。相對(duì)于表皮和中柱,皮層細(xì)胞體積大,細(xì)胞質(zhì)薄,液泡化明顯,排列相對(duì)疏松,緊貼表皮的皮層細(xì)胞和內(nèi)皮層細(xì)胞體積較小(圖1,E)。在維管柱最外方,由1圈中柱鞘細(xì)胞組成。在維管柱中,韌皮部首先分化,表現(xiàn)為對(duì)稱(chēng)分布的2個(gè)區(qū)域,該區(qū)域細(xì)胞體積小且排列緊密,細(xì)胞質(zhì)濃厚且細(xì)胞核明顯,在相對(duì)位置韌皮部外方分化出最早的原生韌皮部篩管,在熒光顯微鏡下表現(xiàn)為2個(gè)細(xì)胞壁較厚的菱形細(xì)胞(圖1,F),隨之形成后生韌皮部。

在2個(gè)韌皮部之間的位置形成木質(zhì)部,位于外方原生木質(zhì)部的導(dǎo)管最先形成,內(nèi)方的后生木質(zhì)部導(dǎo)管依次形成,木質(zhì)部脊為2束(圖1,G、H)。本研究采用熒光顯微鏡對(duì)銀州柴胡根的初生結(jié)構(gòu)進(jìn)行了觀察,可明顯觀察到內(nèi)皮層細(xì)胞徑向壁加厚的凱氏帶結(jié)構(gòu)(圖1,H);同時(shí),銀州柴胡根初生結(jié)構(gòu)的表皮細(xì)胞上也可觀察到加厚的徑向壁熒光(圖1,H)。

2.3 根次生生長(zhǎng)與次生結(jié)構(gòu)

在銀州柴胡根的初生結(jié)構(gòu)中,維管柱主要由初生木質(zhì)部、初生韌皮部以及外圍的中柱鞘細(xì)胞層組成,原形成層位于初生木質(zhì)部和初生韌皮部之間。隨著發(fā)育的進(jìn)行,位于銀州柴胡根初生木質(zhì)部和初生韌皮部之間的原形成層恢復(fù)分裂能力形成維管形成層(圖2,A)。維管形成層不斷的向內(nèi)形成次生木質(zhì)部,向外形成次生韌皮部,隨之原生木質(zhì)部上方對(duì)應(yīng)的中柱鞘細(xì)胞進(jìn)行分裂并向兩邊擴(kuò)展,形成連續(xù)的維管形成層。

A. 早期維管形成層;B. 維管形成層環(huán);C. 皮層、內(nèi)皮層、木栓層、栓內(nèi)層的分泌道以及維管形成層;D. 熒光顯微鏡下表皮細(xì)胞的徑向壁加厚、皮層、內(nèi)皮層、木栓層以及栓內(nèi)層的分泌道。

在早期,維管形成層產(chǎn)生次生木質(zhì)部的速度大于形成次生韌皮部,使得維管形成層環(huán)不斷的向外推進(jìn),最后在次生木質(zhì)部和次生韌皮部之間形成1個(gè)閉合的維管形成層環(huán)(圖2,B)。

次生維管組織的產(chǎn)生使得根初生結(jié)構(gòu)如表皮、皮層以及中柱鞘組織不斷地向外推進(jìn)(圖2,C)。當(dāng)維管形成層活動(dòng)到一定的時(shí)期,此時(shí)根內(nèi)皮層內(nèi)方的中柱鞘組織恢復(fù)分裂能力形成木栓形成層,木栓形成層向外形成木栓層,向內(nèi)形成栓內(nèi)層(圖2,C、D)。

此時(shí),木栓層外方的表皮、皮層等尚未脫落,可明顯的觀察到根表皮細(xì)胞徑向壁加厚的熒光以及內(nèi)皮層的凱氏帶加厚(圖2,D)。隨著栓內(nèi)層層數(shù)的增加,在栓內(nèi)層中3～4個(gè)細(xì)胞之間發(fā)生細(xì)胞壁分離,最初形成3～4個(gè)分泌細(xì)胞圍繞的細(xì)胞腔隙或分泌腔隙(圖2,C、D),隨著發(fā)育的進(jìn)行,分泌細(xì)胞的數(shù)量不斷增加。

多年生銀州柴胡根周皮由8～15層扁平的細(xì)胞組成,最外方的木栓層細(xì)胞細(xì)胞壁厚,原生質(zhì)消失;木栓形成層細(xì)胞體積較小,細(xì)胞質(zhì)濃厚;內(nèi)方的栓內(nèi)層細(xì)胞體積較大(圖3,A-C)。隨著維管形成層和木栓形成層的不斷活動(dòng),根的直徑不斷增大,表皮和皮層完全脫落(圖3,A、B)。在橫切面上,成熟的根由外到內(nèi)由周皮(木栓層、木栓形成層和栓內(nèi)層)、次生韌皮部、維管形成層、次生木質(zhì)部以及初生木質(zhì)部組成(圖3,A)。在發(fā)育早期,根次生韌皮部較寬廣,占根橫切面面積約70%。隨著根的發(fā)育,使得根不斷的增粗生長(zhǎng),次生韌皮部和次生木質(zhì)部面積不斷增加。多年生銀州柴胡根的次生木質(zhì)部相對(duì)面積不斷增加,且在次生木質(zhì)部導(dǎo)管周?chē)植加屑?xì)胞壁加厚的木質(zhì)部纖維群(圖3,B,D)。

在銀州柴胡根次生韌皮部,還觀察到由4～20個(gè)分泌細(xì)胞圍繞的細(xì)胞腔隙(圖3,E)。研究發(fā)現(xiàn),在距離維管形成層5～8個(gè)細(xì)胞位置的次生韌皮部,形成由4個(gè)分泌細(xì)胞相互分離而形產(chǎn)生的小細(xì)胞腔隙;其中次生韌皮部外圍的細(xì)胞腔隙直徑較大,但在木質(zhì)部中未觀察到由分泌細(xì)胞組成的細(xì)胞腔隙。隨著根直徑的增加,次生韌皮部和中柱鞘的分泌腔隙數(shù)量和分泌細(xì)胞的數(shù)量逐漸增加。在多年生根的中柱鞘位置,可觀察到由3～16個(gè)分泌細(xì)胞組成的分泌腔隙(圖3,F～G),在根橫切面上排列為一圈。

在縱切面上,中柱鞘(圖3,H)和次生韌皮部(圖3,I)位置上的分泌腔隙呈引長(zhǎng)的管狀結(jié)構(gòu),特別是中柱鞘位置的分泌腔隙表現(xiàn)為分支的管狀結(jié)構(gòu)(圖3,H)。

3 討 論

中藥柴胡為中國(guó)大宗中藥材,關(guān)于柴胡屬藥用植物根的結(jié)構(gòu)發(fā)育備受關(guān)注。本研究結(jié)果表明,多年生銀州柴胡根的結(jié)構(gòu)主要由周皮、次生韌皮部和次生木質(zhì)部組成,這與北柴胡和狹葉柴胡根的一般特點(diǎn)[13-14]一致。在銀州柴胡發(fā)育早期的根中尚未觀察到木纖維,但在多年生根次生木質(zhì)部發(fā)現(xiàn)有大量的木纖維群分布,這與北柴胡根的特點(diǎn)[14]類(lèi)似,但多年生狹葉柴胡根次生木質(zhì)部纖維少或無(wú)[15],明顯區(qū)別于銀州柴胡。譚玲玲等[13]和鄭麗等[14]對(duì)北柴胡和狹葉柴胡根的發(fā)育進(jìn)行了研究,表明北柴胡初生木質(zhì)部為二元型,但狹葉柴胡根初生木質(zhì)部為二元型,少數(shù)為三原型。本研究結(jié)果顯示,銀州柴胡根初生木質(zhì)部為二元型,亦有三元型,和狹葉柴胡[14]相吻合,也和李廣民和錢(qián)麗霞的報(bào)道[16]一致。

此外,本研究采用熒光顯微鏡技術(shù)對(duì)銀州柴胡根初生結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察研究,結(jié)果顯示在橫切面上,當(dāng)根初生結(jié)構(gòu)完全分化,除了在根的內(nèi)皮層細(xì)胞可觀察到徑向壁加厚的凱氏帶外,在根表皮細(xì)胞的徑向壁亦觀察到加厚的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。雖然本研究尚未證實(shí)表皮細(xì)胞橫向壁是否具有加厚的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),但從其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)來(lái)看,推測(cè)為一種類(lèi)似凱氏帶的結(jié)構(gòu)。研究表明,在很多高等植物根內(nèi)皮層以外的部位均發(fā)現(xiàn)凱氏帶或類(lèi)似凱氏帶的結(jié)構(gòu),如罌粟科植物白屈菜根的外皮層、天竺葵莖中木栓細(xì)胞中以及豌豆黃化苗莖中以及松科植物針葉內(nèi)皮層細(xì)胞壁[17]。在我國(guó),銀州柴胡主要分布在陜西北部、甘肅的榆中和靜寧、寧夏的海源及內(nèi)蒙古等西北干旱的區(qū)域,生長(zhǎng)于干燥山坡及多沙地帶瘠薄的土壤中[1]。銀州柴胡根表皮細(xì)胞徑向壁加厚,其作用可能類(lèi)似植物根內(nèi)皮層凱氏帶,并作為根吸收過(guò)程的第一道選擇屏障,起著防止水分通過(guò)非共質(zhì)體外滲、抵御干旱及養(yǎng)分選擇性吸收等重要的角色[17],其具體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)還需要從超微結(jié)構(gòu)水平去進(jìn)一步深入研究。

蔡少青等[18]報(bào)道,在北柴胡和狹葉柴胡根的皮層和韌皮部中分布有油室。潘勝利等[19]報(bào)道,在柴胡屬植物中柱鞘組織分布有分泌道,而在韌皮部則分布為油室。在植物學(xué)上,分泌道是一類(lèi)引長(zhǎng)的管狀結(jié)構(gòu),而油室則為一種儲(chǔ)存油類(lèi)物質(zhì)的細(xì)胞腔隙或分泌腔[20]。本研究對(duì)銀州柴胡根進(jìn)行了縱切,結(jié)果顯示根中柱鞘和次生韌皮部的分泌腔隙或細(xì)胞腔隙均為引長(zhǎng)的分泌道,且銀州柴胡根中柱鞘分泌道為一種分支的管狀結(jié)構(gòu)。從分泌道形成的方式來(lái)看,銀州柴胡中柱鞘分泌道和次生韌皮部分泌道均為分泌細(xì)胞的相互分離而形成,是一種裂生型分泌道,和北柴胡分泌道形成方式[13,20]一致。

Metcalfe和Chalk[21]指出,分泌道在傘形科普遍存在,是傘形科植物的典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。李廣民和錢(qián)麗霞[16]對(duì)西北產(chǎn)6種藥用柴胡營(yíng)養(yǎng)器官的比較解剖學(xué)進(jìn)行了研究,表明分泌道分布于根的皮層和韌皮部中。本研究結(jié)果顯示,在根初生結(jié)構(gòu)的皮層中尚未觀察到分泌道的分布,分泌道形成于木栓形成層和維管形成層的活動(dòng)而產(chǎn)生的栓內(nèi)層和次生韌皮部而非皮層中,是典型的次生分泌結(jié)構(gòu),這和北柴胡分泌道的研究結(jié)果[13,20]相吻合。由于銀州柴胡根分泌道的形成與中柱鞘和維管形成層衍生細(xì)胞的活動(dòng)密切相關(guān),故稱(chēng)之為中柱鞘分泌道和次生韌皮部分泌道。從發(fā)育的角度,當(dāng)銀州柴胡根的周皮形成初期,在栓內(nèi)層中即形成了中柱鞘分泌道,此時(shí)次生韌皮部分泌道尚未觀察到,即相對(duì)于次生韌皮部分泌道的形成,中柱鞘分泌道出現(xiàn)較早。

銀州柴胡根周皮的栓內(nèi)層和次生韌皮部均分布有分泌道,與北柴胡和紅柴胡[13-14]一致,但在紫花大葉柴胡根次生韌皮部尚未觀察到分泌道[22]。從分泌道和分泌細(xì)胞的數(shù)量上來(lái)看,相同大小銀州柴胡根中次生韌皮部的分泌道和分泌細(xì)胞數(shù)量均大于北柴胡而小于狹葉柴胡[15]。由此可見(jiàn),銀州柴胡根中柱鞘及次生韌皮部分泌道與柴胡屬其他植物相應(yīng)位置的分泌道在形態(tài)上相似,但分泌道的數(shù)量及大小等可作為柴胡屬植物重要的分類(lèi)鑒定依據(jù)。