劉學(xué)艷，于龍鳳，蘇向宇，吳成遠(yuǎn)*

1.滇西科技師范學(xué)院 生物技術(shù)與工程學(xué)院，云南 臨滄 677000；2.云南省紅茶工程技術(shù)研究中心，云南 臨滄 677000；3.云南滇紅集團(tuán)股份有限公司，云南 臨滄 677000

可可堿（3,7-二甲基黃嘌呤）與咖啡堿（1,3,7-三甲基黃嘌呤）同為茶樹(shù)中重要的嘌呤生物堿，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上，咖啡堿僅僅比可可堿多一個(gè)甲基取代基[1]。眾所周知，咖啡堿具有促進(jìn)身體新陳代謝、提高大腦注意力等活性，但過(guò)量咖啡堿會(huì)引起高血壓、骨質(zhì)疏松、肌肉震顫等不良反應(yīng)，不適合兒童、婦女、老人及高血壓患者等咖啡堿敏感性人群（10 mg/次）飲用[2]；高可可堿、低咖啡堿的可可茶（Camellia ptilophyllaChang）可顯著降低高咖啡堿茶葉對(duì)人體的負(fù)面影響，在國(guó)內(nèi)外茶葉市場(chǎng)廣受消費(fèi)者歡迎?？煽刹栌?981年被張宏達(dá)教授發(fā)現(xiàn)[3]，其GCG含量高，具有抗腫瘤[4]、降低膽固醇[5]、抗前列腺癌[6]、改善睡眠質(zhì)量[7]等功效。

隨著消費(fèi)者對(duì)低咖啡堿飲料的關(guān)注，國(guó)內(nèi)外對(duì)低咖啡堿茶樹(shù)的研究也于20世紀(jì)末逐漸興起，包括脫咖啡堿工藝研究、低咖啡堿茶產(chǎn)品品質(zhì)研究、低咖啡堿茶樹(shù)育種方法研究等。在脫咖啡堿工藝方面，國(guó)內(nèi)外報(bào)道了多種茶葉脫咖啡堿的方法，包括傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法（茶多酚水溶液浸提法[8-9]、熱水浸提法、超臨界萃取法[10]、有機(jī)溶劑萃取法）及微生物和酶法降解法等，這些方法能夠降低咖啡堿含量但影響茶葉風(fēng)味且成本高昂，并不能解決根本問(wèn)題。因此，學(xué)者轉(zhuǎn)向育種方法選育低咖啡堿茶樹(shù)品種。

在低咖啡堿茶樹(shù)育種及成品茶品質(zhì)方面，楊亞軍等[11]于2003年篩選出2份低咖啡堿（＜1.0%）茶樹(shù)資源；吳華玲等[12]研究團(tuán)隊(duì)從野生‘南昆白毛茶’群體中獲得100多個(gè)無(wú)咖啡堿的‘可可茶’單株，建立起‘可可茶’基地，選育出‘可可茶1號(hào)’和‘可可茶2號(hào)’并于2008年獲國(guó)家植物新品種權(quán)；何玉媚等[13]將‘可可茶1號(hào)’和‘可可茶2號(hào)’制成綠茶、黃茶、紅茶，可可堿含量為3.98%～6.26%；宋曉虹等[14]研究認(rèn)為，發(fā)酵8 h更利于紅茶品質(zhì)成分的保留。近年來(lái)，大量的野生天然高可可堿茶樹(shù)種質(zhì)資源逐漸被發(fā)現(xiàn)，如廣東南昆山的‘可可茶’、福建南部山區(qū)的‘紅芽茶’、云南馬關(guān)和西疇一帶的‘厚軸茶’（Camellia crassicolumaChang）、廣西大瑤山的‘禿房茶’（CamelliagymnogynaChang）[15]、云南景洪地區(qū)的野生低咖啡堿古樹(shù)茶[16]等，為我國(guó)天然低咖啡堿茶樹(shù)的育種提供了豐富的試驗(yàn)材料。

本試驗(yàn)以滇紅集團(tuán)從無(wú)咖啡堿群體種茶樹(shù)中采取單株選育法選育出的3個(gè)茶樹(shù)品種（系）鮮葉分別制成紅茶和綠茶，分別測(cè)定茶樣中的氨基酸、茶多酚、咖啡堿、可可堿、茶色素及兒茶素等含量，并結(jié)合感官審評(píng)結(jié)果對(duì)所加工的茶樣進(jìn)行品質(zhì)比較分析，以期為云南‘可可茶’資源的篩選及低咖啡堿茶產(chǎn)品的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來(lái)自于云南省臨滄市鳳慶縣滇紅集團(tuán)茶樹(shù)種質(zhì)資源圃，系滇紅集團(tuán)于2000年利用廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供的‘可可茶’群體種插穗扦插繁殖之后，再根據(jù)茶樹(shù)的不同性狀進(jìn)行多次單株選育培育成的3個(gè)不同的茶樹(shù)品種（系）。分別按照一芽二、三葉標(biāo)準(zhǔn)采摘3個(gè)茶樹(shù)品種（系）鮮葉按照傳統(tǒng)紅茶與綠茶工藝制成紅茶和綠茶樣。

1.2 儀器及試劑

1.2.1 主要儀器

ShimaDzu UV2550紫外分光光度儀，日本島津；Thermo Fisher UltiMateTM 3000超高效液質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)。

1.2.2 主要試劑

甲酸、乙腈、乙醇、乙酸乙酯、草酸、碳酸氫鈉、正丁醇、茚三酮、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、氯化亞錫、谷氨酸、可可堿、超純水等。

1.3 試驗(yàn)方法

游離氨基酸含量測(cè)定參照GB/T 8312—2013；茶色素含量測(cè)定參照NY/T 3675—2020；可可堿含量測(cè)定參照GB/T 8314—2013。

兒茶素含量測(cè)定采用HPLC法，具體測(cè)定條件如下：色譜柱為ACQUTITY UPLC?HSS T3色譜柱（2.1 mm×150 mm i.d.，1.8 μm）和HSS T3保護(hù)柱（10 mm×2 mm i.d.）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈，梯度洗脫條件見(jiàn)表1；流速為0.3 mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣體積為1 μL；樣品分析時(shí)間為10 min。

表1 流動(dòng)相的梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution procedures for mobile phases

質(zhì)譜條件：選用Thermo Fisher Q-Exactive高分辨四極桿靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀；離子源為電噴霧（HESI）正離子掃描方式；載氣體流速為40 L/min；輔助氣流速為10 L/min；噴霧電壓為3.5 kV（正離子）和3.4 kV（負(fù)離子）；毛細(xì)管溫度為320℃；掃描模式為Full MS/dd-MS2（TopN）模式，掃描范圍為60～900 m/z；分辨率為70 000/15 000；NCE電壓為20 kV、40 kV、60 kV；數(shù)據(jù)采集軟件為XcaliburTM（Thermo Fisher）。

2 結(jié)果與分析

2.1 品質(zhì)成分含量

由表2可看出，3種茶樹(shù)制成紅茶的茶多酚含量差異較小，2號(hào)茶樹(shù)茶多酚含量最高；氨基酸含量差異較大，其中1號(hào)茶樹(shù)紅茶樣氨基酸含量最高（4.0%），3號(hào)茶樹(shù)紅茶樣氨基酸含量最低（2.5%）；2號(hào)和3號(hào)茶樹(shù)紅茶的酚氨比（分別為4.89與4.92）顯著高于1號(hào)茶樹(shù)紅茶（2.55）。兒茶素含量方面，3個(gè)茶樹(shù)紅茶樣的兒茶素含量均小于2%，其中1號(hào)茶樹(shù)紅茶樣的兒茶素總量顯著高于2號(hào)和3號(hào)茶樹(shù)的紅茶，其中主要是EGC含量（1.11%）顯著高于2號(hào)茶樹(shù)紅茶（0.19%）和3號(hào)茶樹(shù)紅茶（0.27%）。茶色素方面，3個(gè)茶樹(shù)品種（系）的紅茶均以茶紅素和茶褐素為主，茶褐素含量差異較大。其中，1號(hào)茶樹(shù)的紅茶茶褐素含量最高（7.9%），2號(hào)茶樹(shù)的紅茶茶褐素含量最低（5.4%）?？傮w上來(lái)看，3個(gè)茶樹(shù)的紅茶茶色素總量差異不顯著。3個(gè)茶樹(shù)的紅茶均含有咖啡堿和可可堿，其中咖啡堿含量為0.12%～0.19%，可可堿含量為0.10%～0.16%，均分別符合低咖啡堿茶樹(shù)種質(zhì)資源及低咖啡堿茶的要求。

表2 3個(gè)茶樹(shù)品系（種）紅茶的主要理化成分及含量Table 2 Main physicochemical components and contents of three tea varieties (strains) of black tea samples /%

由表3可看出，3個(gè)茶樹(shù)品系（種）制成的綠茶茶多酚含量為15.8%～17.8%，無(wú)明顯差異；氨基酸含量差異較顯著，其中1號(hào)茶樹(shù)制成的綠茶氨基酸含量（3.9%）顯著高于2號(hào)茶樹(shù)和3號(hào)茶樹(shù)制成的綠茶。兒茶素含量方面，3個(gè)茶樹(shù)品系（種）的綠茶兒茶素總量均高于7%，其中1號(hào)茶樹(shù)的綠茶兒茶素總量達(dá)19.24%，顯著高于其余2個(gè)茶樹(shù)品系（種）的綠茶；1號(hào)茶樹(shù)綠茶的EGC和EGCG含量分別高達(dá)8.23%和7.79%。3個(gè)茶樹(shù)品系（種）的綠茶都含有咖啡堿和可可堿，咖啡堿含量為0.12%～0.39%，可可堿含量為0.12%～0.45%，均分別符合低咖啡堿茶種質(zhì)資源與低咖啡堿茶的要求。

表3 3個(gè)茶樹(shù)品系（種）綠茶的主要理化成分及含量Table 3 Main physicochemical components and contents of three tea varieties (strains) of green tea samples

綜上，3個(gè)茶樹(shù)品系（種）加工紅茶和綠茶均含有嘌呤生物堿，咖啡堿和可可堿的含量均低于0.5%，其中綠茶中可可堿和咖啡堿含量均高于紅茶，表明3個(gè)茶樹(shù)品系（種）可作為低咖啡堿茶樹(shù)種質(zhì)資源，可利用加工低咖啡堿茶產(chǎn)品；此外，同一茶樹(shù)品種鮮葉制紅茶可一定程度上降低成品茶中咖啡堿的含量。

2.2 感官品質(zhì)

由表4可看出，3個(gè)茶樹(shù)品系（種）的紅茶外形上差異不大；內(nèi)質(zhì)方面，香氣均以甜香為主，香氣純正且持久性強(qiáng)。滋味以醇為主。其中1號(hào)茶樹(shù)的紅茶香氣最佳，富含花果香，且湯色更亮，顯金圈，這與其豐富的茶黃素含量有關(guān)，表明1號(hào)茶樹(shù)適合加工紅茶。

表4 3個(gè)茶樹(shù)品系（種）制紅茶與綠茶感官審評(píng)Table 4 Sensory quality of black and green tea produced from three tea strains (varieties)

表4結(jié)果表明，3個(gè)茶樹(shù)品系（種）的綠茶外形也相近；香氣都以清香為主，純正持久。2號(hào)茶樹(shù)綠茶滋味濃醇，且有回甘，適合加工綠茶。3號(hào)茶樹(shù)制成的紅茶和綠茶與1號(hào)和2號(hào)茶樹(shù)成品相比，無(wú)突出的特色，但也沒(méi)有明顯的劣勢(shì)，加工綠茶和紅茶均可?？傮w上看，試驗(yàn)中的6個(gè)茶樣在感官上與一般茶樹(shù)制成的樣品沒(méi)有太大差異。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本試驗(yàn)中3個(gè)茶樹(shù)品系（種）分別加工綠茶與紅茶共6個(gè)茶樣中均含有一定量的咖啡堿，但其含量均低于0.5%，3個(gè)茶樹(shù)品系（種）可作為低咖啡堿茶樹(shù)資源。但其可可堿含量遠(yuǎn)低于正?！煽刹琛瘜?duì)可可堿含量的要求，這與高坤等[17]研究結(jié)果存在差異。筆者猜測(cè)可能有以下三個(gè)原因：一是因?yàn)橐N馴化‘可可茶’過(guò)程中可能由于種內(nèi)種外雜交引起了種源不純的問(wèn)題。據(jù)前人研究結(jié)果，在進(jìn)行扦插繁殖時(shí)要注意插穗母樹(shù)選擇[2]。二是因?yàn)榭Х葔A和可可堿含量均屬于數(shù)量性狀，易受茶樹(shù)樹(shù)齡、發(fā)育階段、季節(jié)、氣候條件、土壤條件及其栽培措施的影響而導(dǎo)致性狀不穩(wěn)定。三是因?yàn)楸驹囼?yàn)檢測(cè)過(guò)程中采用的可可堿檢測(cè)方法是按照咖啡堿的測(cè)定方法進(jìn)行，與現(xiàn)行有效的檢測(cè)方法（NY/T 3631—2020）不一致，導(dǎo)致數(shù)據(jù)產(chǎn)生一定誤差。因此，以后應(yīng)借鑒分子標(biāo)記育種方法進(jìn)行更多的試驗(yàn)，包括茶苗的選育及成品茶理化成分的測(cè)定等。

此外，宋曉虹等[14]以野生不含可可堿的‘可可茶2號(hào)’茶樹(shù)鮮葉為原料制成的紅茶含有較高的茶褐素（7.28%～10.20%）和茶紅素（4.44%～7.55%），兒茶素中以C（1.01%～2.08%）和GCG（0.73%～2.48%）含量較高。本試驗(yàn)結(jié)果紅茶樣的茶褐素（5.4%～7.9%）和茶紅素（6.2%～6.4%）含量較高，但兒茶素指標(biāo)與宋曉虹[14]的研究結(jié)果存在一定的差異。如1號(hào)茶樹(shù)制成的紅茶以EGC為主（1.11%），2號(hào)茶樹(shù)制成的紅茶以EGCG（0.33%）和ECG（0.29%）為主，3號(hào)茶樹(shù)制成的紅茶以EGCG（0.32%）和EGC（0.27%）為主。而在加工的綠茶樣中，3種茶樹(shù)制成的綠茶兒茶素均以EGC（1.54%～8.23%）、EGCG（2.98%～7.79%）和ECG（1.30%～2.34%）含量較高，而C、EC兩種兒茶素含量極低，GCG未檢測(cè)出。這一結(jié)果再次說(shuō)明扦插繁殖苗經(jīng)異地培育后會(huì)影響茶樹(shù)體內(nèi)的次生代謝物種類及含量。選育可穩(wěn)定遺傳且性狀保持不變的‘可可茶’需要純種原材料與大量的時(shí)間，可借鑒分子標(biāo)記中SSR方法與常規(guī)育種相結(jié)合進(jìn)而提高育種效率[18]。

感官品質(zhì)方面，3種茶樹(shù)紅茶的香氣均以甜香帶花果香為主，滋味甜醇，湯色橙黃明亮；綠茶的香氣以清香為主，滋味醇厚回甘，湯色綠黃明亮，與普通茶樹(shù)鮮葉制成的茶樣沒(méi)有顯著差異，這與閆振等[15]的研究結(jié)果一致。閆振等[15]的研究還指出，‘可可茶’鮮葉制成的茶葉在保健功能方面具有突出的保護(hù)缺氧心肌、膳食抗氧化、抗炎和一定的抗腫瘤功效[15]。因此，本試驗(yàn)團(tuán)隊(duì)后期應(yīng)結(jié)合理化成分檢測(cè)、感官審評(píng)和體外抗氧化等多方面進(jìn)行深入探討。

3.2 結(jié)論

以‘可可茶’扦插繁殖方法培育的3個(gè)‘可可茶’后代茶樹(shù)鮮葉制成的紅茶和綠茶感官品質(zhì)符合普通紅茶與綠茶國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；咖啡堿和可可堿含量均低于0.5%，3個(gè)茶樹(shù)品系（種）可作為低咖啡堿茶樹(shù)資源。3個(gè)茶樹(shù)的綠茶茶多酚含量為15.8%～17.8%，紅茶的茶多酚含量為10.2%～13.2%。3個(gè)茶樹(shù)品系（種）的紅茶茶色素以茶褐素（5.4%～7.9%）和茶紅素（6.2%～6.4%）為主，兒茶素均以EGCG和EGC為主；而3個(gè)茶樹(shù)品系（種）的綠茶兒茶素以EGC（1.54%～8.23%）、EGCG（2.98%～7.79%）和ECG（1.30%～2.34%）為主，總體上無(wú)論是加工綠茶還是紅茶的兒茶素均以EGCG和EGC為主。適制性方面，從感官審評(píng)結(jié)果來(lái)看，1號(hào)茶樹(shù)適合加工紅茶，2號(hào)茶樹(shù)適合加工綠茶，3號(hào)茶樹(shù)可加工紅茶和綠茶。本試驗(yàn)結(jié)果可為進(jìn)一步篩選天然低咖啡堿茶樹(shù)種質(zhì)資源提供一定的參考。