羅哌卡因?qū)θ私Y(jié)腸癌順鉑耐藥細(xì)胞株順鉑敏感性的增強(qiáng)作用及其機(jī)制

趙文博，曾煉，胡鵬超，程欣冉，羅輝宇

1 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院麻醉科，湖北襄陽 441000；2 湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

結(jié)直腸癌（CRC）在我國癌癥相關(guān)死因中躍居第四位［1］。順鉑是臨床上CRC 的一線治療藥物，但隨著腫瘤細(xì)胞對化療藥物耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，導(dǎo)致CRC患者復(fù)發(fā)和死亡率居高不下。據(jù)統(tǒng)計(jì)，Ⅰ期結(jié)直腸癌的5 年相對生存率為90%，而發(fā)生化療耐藥導(dǎo)致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的Ⅳ期CRC 5 年相對生存率僅為14%［2］。腫瘤耐藥的機(jī)制至今尚不完全清楚，在諸多耐藥機(jī)制中細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平被認(rèn)為與腫瘤細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。一般情況下癌細(xì)胞常表達(dá)高水平抗氧化蛋白以清除過量的ROS，避免細(xì)胞發(fā)生氧化性死亡，進(jìn)而耐藥性增強(qiáng)［3］。因此促進(jìn)ROS 堆積誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激失衡可能成為逆轉(zhuǎn)癌癥耐藥的新方向。鐵死亡為近年新發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞死亡形式，是一種鐵依賴形式的非凋亡性細(xì)胞死亡，由胱氨酸耗盡和大量脂質(zhì)過氧化控制的膜損傷引起。鐵死亡發(fā)生后細(xì)胞內(nèi)升高的ROS 水平和線粒體膜電位下降共同導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞氧化應(yīng)激的失衡和抗氧化能力的減弱。由于許多化療藥物如順鉑，主要通過損傷腫瘤細(xì)胞DNA 來發(fā)揮治療作用，而耐藥腫瘤細(xì)胞中抗氧化蛋白表達(dá)升高阻礙了順鉑誘導(dǎo)的DNA 損傷，并加速已損傷DNA 修復(fù)，最終使腫瘤免于損傷甚至死亡。因此通過誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡可能成為治療腫瘤耐藥的一種潛在治療方法。核紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（Nrf-2）是一類驅(qū)動各種抗氧化劑相關(guān)基因表達(dá)的蛋白質(zhì)，主要參與體內(nèi)的抗氧化作用。谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）是鐵死亡的核心調(diào)控蛋白，可清除ROS 等過氧化物來避免細(xì)胞受到氧化應(yīng)激性損傷，當(dāng)Nrf-2/GPX4 蛋白表達(dá)受到抑制時能夠誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生［4］。溶質(zhì)載體家族7 成員11（SLC7A11）是鐵死亡的抑制因子。Nrf-2、GPX4、SLC7A11 均為鐵死亡相關(guān)蛋白，在鐵死亡的誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。近年，局麻藥羅哌卡因可減少全麻用藥并緩解外科手術(shù)產(chǎn)生的急性疼痛，因而常被用于癌癥患者圍術(shù)期治療。臨床研究［5］表明，羅哌卡因?qū)Π┌Y患者的預(yù)后有改善作用。然而，羅哌卡因能否增強(qiáng)CRC 順鉑耐藥細(xì)胞株對順鉑的敏感性尚不清楚。2020 年3 月—2023 年6 月，我們觀察了羅哌卡因?qū)θ私Y(jié)腸癌細(xì)胞株順鉑敏感性的增強(qiáng)作用，并探討了其作用機(jī)制是否與由Nrf-2、GPX4、SLC7A11 及線粒體膜電位水平降低、ROS 水平升高誘導(dǎo)的鐵死亡有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑、儀器 人結(jié)腸癌LOVO 細(xì)胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司。鹽酸羅哌卡因購自宜昌人福藥業(yè)股份有限公司；順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司；胎牛血清購自美國Gibco 公司；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液購自美國Gibco公司；胰酶細(xì)胞消化液、SDS-PAGE凝膠試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液購自中國沈陽萬類生物公司；CCK-8 試劑盒、AnnexinV-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞核染料Hoechst 33258、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG 購自中國上海碧云天生物科技有限公司；線粒體膜電位檢測試劑盒JC-1 和H2DCFDA 綠色熒光探針購自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；DyLight 488 綠色熒光Ⅱ抗、GAPDH 抗體購自Abcam 公司；MMP-9 抗體購自中國武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；GPX4 抗體、Nrf-2抗體和SLC7A11 抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；Fe2+檢測試劑盒購自日本Dojind 公司。二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo）、生物安全柜（中國力康）、IX70 倒置熒光顯微鏡（日本Olympus）、多功能熒光酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices）。流式細(xì)胞儀（美國BD）、蛋白質(zhì)免疫印跡電泳槽和轉(zhuǎn)膜槽（美國Bio-rad）、高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf）。

1.2 結(jié)腸癌順鉑耐藥LOVO/DDP 細(xì)胞株的構(gòu)建及順鉑、羅哌卡因干預(yù)濃度的篩選 采用1 μg /mL 的順鉑與進(jìn)入對數(shù)生長期的LOVO 細(xì)胞共同培養(yǎng)24 h 后，更換不含順鉑的培養(yǎng)液，待細(xì)胞穩(wěn)定生長后傳代，重復(fù)上述步驟 5 次后，將順鉑濃度更換為2 μg /mL，繼續(xù) 重復(fù)上 述 操作 5 次，再更 換為5 μg/mL 的順鉑處理細(xì)胞 3 次。直至LOVO 細(xì)胞株在 5 μg /mL 濃度下穩(wěn)定生長和傳代，將其命名為LOVO/DDP細(xì)胞株。

將LOVO 及LOVO/DDP 細(xì) 胞 分 別 以1×105個/mL 接種于6 孔板中并加入2 mL /孔RPMI-1640培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁后，置于倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。光鏡下LOVO 細(xì)胞呈長梭形，有突起，散在生長；而LOVO/DDP 細(xì)胞呈近圓型，少突起，成團(tuán)生長。采用CCK-8 法檢測不同濃度（0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L）順鉑處理以上兩種細(xì)胞48 h 后，LOVO 細(xì)胞中存活率分別為100.00% ± 2.09%、100.66% ± 2.47%、93.15% ±2.21%、37.51% ± 3.33%、13.05% ± 1.47%，LOVO/DDP 細(xì) 胞 存 活 率 分 別 為99.50% ± 1.21%、98.79% ± 1.47%、96.62% ± 1.19%、（94.61% ±0.89%）%、（60.51% ± 3.13%）%、（25.47% ± 1.88%。結(jié)果表明低濃度順鉑處理結(jié)腸癌細(xì)胞株48 h后，LOVO 細(xì) 胞 株 的 存 活 率 降 低（P<0.01），而LOVO/DDP 細(xì)胞株的存活率無明顯變化（P>0.05）。隨順鉑濃度升高，LOVO 細(xì)胞活力明顯下降，IC50 為0.927 μmmol/L；在低濃度順鉑作用下，LOVO/DDP 細(xì)胞活力下降不明顯，在高濃度順鉑處理后細(xì)胞活力才下降，IC50為2.493 μmmol/L。上述結(jié)果表明，與LOVO/DDP細(xì)胞株相比，LOVO 細(xì)胞株對順鉑更敏感。結(jié)腸癌順鉑耐藥細(xì)胞株構(gòu)建成功。選擇兩種結(jié)腸癌細(xì)胞株存活率差異最為顯著的順鉑干預(yù)濃度1.0 μmol/L 作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用順鉑的濃度。

將LOVO 及LOVO/DDP 細(xì) 胞 分 別 以1×105個/mL 接種于6 孔板中并加入2 mL /孔RPMI-1640培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁后加入0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L 羅哌卡因處理以上兩種細(xì)胞48 h 后，采用CCK-8 法檢測不同濃度羅哌卡因作用后LOVO及LOVO/DDP 細(xì)胞株存活率。結(jié)果LOVO 細(xì)胞株中存活率分別為100.00% ± 1.25%、98.57% ± 2.08%、97.47% ± 1.59%、92.24% ± 3.69%、63.41% ±3.44%、33.18% ± 0.92%，LOVO/DDP細(xì)胞存活率分別為100.00% ± 2.36%、99.75% ± 6.83%、95.46% ±4.14%、90.27% ± 4.60%、76.93% ± 1.66%、45.70% ±5.68%。結(jié)果顯示低濃度的羅哌卡因處理 LOVO 細(xì)胞和 LOVO/DDP 細(xì)胞株，細(xì)胞株活力無明顯變化（P>0.05），僅羅哌卡因濃度大于 1.0 mmol/L 時，兩種結(jié)腸癌細(xì)胞株活力發(fā)生下降，呈劑量依賴性。CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低濃度羅哌卡因?qū)?LOVO 細(xì)胞和 LOVO/DDP 細(xì)胞存活率無明顯影響。與單獨(dú)順鉑1.0 μmmol/L 作用相比，1 mmol/L 羅哌卡因聯(lián)合1.0 μmmol/L 順鉑作用后 LOVO/DDP 細(xì)胞存活率由94.61% ± 0.89%下降為62.95% ± 5.85%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。由于1 mmol/L 以上濃度的羅哌卡因?qū)?xì)胞毒性較強(qiáng)易掩蓋羅哌卡因的增敏作用，因此我們選擇 1 mmol/L的羅哌卡因用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 LOVO 和 LOVO/DDP 細(xì)胞株分組及羅哌卡因干預(yù) 將LOVO 和LOVO/DDP 兩種細(xì)胞分別設(shè)立4個組別，分別為羅哌卡因組 + 順鉑組、羅哌卡因組、順鉑組、對照組。對照組加入細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；羅哌卡因組加入細(xì)胞培養(yǎng)液和1 mmol/L 濃度羅哌卡因培養(yǎng)；順鉑組加入細(xì)胞培養(yǎng)液和1.0 μmol/L 濃度順鉑培養(yǎng)；羅哌卡因聯(lián)合順鉑組加入細(xì)胞培養(yǎng)液后再同時加入1.0 μmol/L 濃度順鉑及1 mmol/L 濃度羅哌卡因培養(yǎng)。

1.4 各組增殖、遷移能力的觀察 采用平板克隆實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞株增殖能力。取上述各組細(xì)胞株，均勻接種于6 孔板中，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞孵育箱中。培養(yǎng)14 d 后，用4%多聚甲醛固定15 min，洗滌2 次，用0.1%結(jié)晶紫染色15 min 后洗滌多余染料，觀察細(xì)胞株克隆形成數(shù)并拍照。

采用Transwell實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞株遷移情況：取上述各組細(xì)胞株，接種于含無血清培養(yǎng)基的Transwell的上室中，并在下室中加入600 μL含 10% FBS的培養(yǎng)基，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，培養(yǎng)48 h 后，用 4%多聚甲醛固定細(xì)胞，再用 0.1% 結(jié)晶紫染色30 min，用PBS洗 3 遍。在顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。

采用Western blotting 法檢測細(xì)胞遷移蛋白MMP-9。取上述各組細(xì)胞，通過裂解液破碎離心加熱提取蛋白質(zhì)樣品，然后上樣。 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗（MMP-9，1∶2 000） 4 ℃ 過夜。次日洗膜3次后，加HRP 標(biāo)記的二抗（山羊抗兔IgG，1∶2 000）室溫孵育120 min，加入超特敏ECL 進(jìn)行顯色，采用Image J軟件測定條帶灰度值進(jìn)行分析。

1.5 各組細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞術(shù)。取上述各組細(xì)胞，按常規(guī)操作步驟上流式細(xì)胞儀檢測。凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞/細(xì)胞總數(shù) ×100%。

1.6 各組細(xì)胞線粒體膜電位的觀察、ROS及亞鐵離子的檢測 采用JC-1線粒體膜電位染色法。取上述各組細(xì)胞，吸走培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞。加入線粒體膜電位試劑盒中JC-1 工作液，置于培養(yǎng)箱孵育30 min后，用PBS再次清洗細(xì)胞2遍，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞。再用Hoechst 33258 標(biāo)定細(xì)胞核，置于熒光顯微鏡下拍照，觀察熒光強(qiáng)度，并計(jì)算JC-1多聚體紅色熒光與單體綠色熒光的比值 ［JC-1（Red/Green）］。

采用熒光染色法測定ROS。取上述各組細(xì)胞在培養(yǎng)箱37 ℃條件下孵育 30 min，用PBS 洗滌細(xì)胞2遍，再用4%多聚甲醛固定15 min 后加入H2DCFDA綠色熒光探針10 min，隨后使用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2遍，再次使用Hoechst 33258標(biāo)記細(xì)胞核，避光染色5 min。置于熒光顯微鏡下拍照，觀察熒光強(qiáng)度，并計(jì)算相對熒光強(qiáng)度。采用免疫熒光法檢測亞鐵離子，最后置于熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.7 各組鐵死亡相關(guān)蛋白Nrf-2、GPX4、SLC7A11的檢測 取上述各組細(xì)胞，按Western blotting 試劑盒操作步驟操作檢測Nrf-2、、GPX4、SLC7A11 蛋白，結(jié)果以灰度值表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8進(jìn)行制圖和統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。 以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組增殖、遷移能力及凋亡情況 LOVO 細(xì)胞中，與對照組比較，順鉑組LOVO 細(xì)胞株形成的克隆體數(shù)明顯減少，羅哌卡因組克隆體形成數(shù)無差異，順鉑聯(lián)合羅哌卡因組細(xì)胞株克隆體數(shù)減少；與順鉑組比較，順鉑聯(lián)合羅哌卡因組細(xì)胞株克隆體數(shù)進(jìn)一步下降。在LOVO/DDP 細(xì)胞株中，與對照組比較，順鉑組、羅哌卡因組細(xì)胞株克隆體數(shù)目下降不明顯，順鉑聯(lián)合羅哌卡因組細(xì)胞株克隆體形成數(shù)減少；與順鉑組比較，順鉑聯(lián)合羅哌卡因組細(xì)胞株克隆體數(shù)明顯減少（圖1）。

圖1 羅哌卡因、順鉑單獨(dú)及聯(lián)合干預(yù)后LOVO及LOVO/DDP細(xì)胞株克隆體

LOVO細(xì)胞株和LOVO/DDP細(xì)胞株中，與對照組相比，順鉑組和羅哌卡因組遷移細(xì)胞株數(shù)目均減少，羅哌卡因聯(lián)合順鉑組遷移細(xì)胞株數(shù)減少；與順鉑組比較，羅哌卡因聯(lián)合順鉑組遷移細(xì)胞株數(shù)減少（見圖2）。

圖2 羅哌卡因、順鉑及聯(lián)合用藥后遷移的LOVO與LOVO/DDP細(xì)胞株

LOVO 細(xì)胞株中，羅哌卡因組 + 順鉑組、羅哌卡因組、順鉑組、對照組MMP-9 蛋白水平分別為0.55 ± 0.13、1.08 ± 0.09、0.75 ± 0.08、1.34 ±0.07，與對照組比較，順鉑組MMP-9 蛋白水平降低（t=5.67，P<0.05），羅哌卡因組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與順鉑組比較，羅哌卡因組 + 順鉑組MMP-9 蛋白差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。LOVO/DDP 細(xì)胞株中，羅哌卡因組 + 順鉑組、羅哌卡因組、順鉑組、對照組MMP-9 蛋白水平分別為0.34 ± 0.04、0.88 ± 0.01、0.60 ± 0.01、1.30 ± 0.05，與對照組比較，順鉑組、羅哌卡因組MMP-9 蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與順鉑組比較，羅哌卡因組 + 順鉑組MMP-9 蛋白水平降低（t=4.43，P<0.05）。

LOVO 細(xì)胞株中，與對照組細(xì)胞株比較，順鉑組凋亡細(xì)胞率升高、存活率下降，羅哌卡因組細(xì)胞凋亡率、存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，羅哌卡因聯(lián)合順鉑組細(xì)胞凋亡率升高、存活率下降（t=18.49，P<0.01）；與順鉑組比較，羅哌卡因聯(lián)合順鉑組細(xì)胞凋亡率升高、存活率下降（t=10.95，P<0.01）。LOVO/DDP 細(xì)胞株中，與對照組相比，順鉑組、羅哌卡因組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與順鉑組、羅哌卡因組比較，順鉑聯(lián)合羅哌卡因組細(xì)胞凋亡率升高（t=18.29，P<0.01），見表1。

表1 LOVO和LOVO/DDP中各組細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率（%， ± s）。

表1 LOVO和LOVO/DDP中各組細(xì)胞存活率、細(xì)胞凋亡率（%， ± s）。

組別LOVO細(xì)胞株細(xì)胞存活率細(xì)胞凋亡率羅哌卡因 + 順鉑組羅哌卡因組順鉑組53.42 ± 2.86 12.46 ± 3.63 29.69 ± 1.92對照組LOVO/DDP細(xì)胞株40.97 ± 4.05 89.03 ± 0.32 68.63 ± 2.56 93.67 ± 0.78 5.81 ± 0.82羅哌卡因 + 順鉑組26.07 ± 1.30羅哌卡因組順鉑組7.58 ± 0.69 12.81 ± 0.73對照組71.34 ± 1.03 91.21 ± 0.42 85.68 ± 0.57 93.16 ± 1.35 6.28 ± 1.38

2.2 LOVO 細(xì)胞株及LOVO/DDP 細(xì)胞株中各組線粒體膜電位、ROS 及亞鐵離子水平比較 在LOVO細(xì)胞株和LOVO/DDP 細(xì)胞株中，與對照組比較，羅哌卡因組、順鉑組及羅哌卡因聯(lián)合順鉑組JC-1 多聚體紅色熒光與單體綠色熒光的比值［JC-1（Red/Green）］均降低，并且以羅哌卡因聯(lián)合順鉑組下降最為顯著（t分別為64.77、9.98，P均<0.01），見表2。

表2 LOVO細(xì)胞株及LOVO/DDP細(xì)胞株中各組線粒體膜電位、ROS及亞鐵離子水平

在LOVO 細(xì)胞株和LOVO/DDP 細(xì)胞株中，與對照組比較，羅哌卡因組、順鉑組及羅哌卡因聯(lián)合順鉑組ROS 水平升高，以羅哌卡因聯(lián)合順鉑組為著（t分別為37.13、59.53，P<0.01），見表2。

亞鐵離子染色結(jié)果顯示，在LOVO細(xì)胞株和LOVO/DDP細(xì)胞株中，與對照組相比，羅哌卡因組、順鉑組、羅哌卡因聯(lián)合順鉑組Fe2+熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)，且以羅哌卡因聯(lián)合順鉑組增強(qiáng)最為顯著（P<0.01），見表2。

2.3 LOVO 細(xì)胞株及LOVO/DDP 細(xì)胞株中鐵死亡相關(guān)蛋白Nrf-2、GPX4、SLC7A11水平比較 在LOVO細(xì)胞株中，與對照組相比，羅哌卡因組、順鉑組、羅哌卡因聯(lián)合順鉑組Nrf-2、GPX4、SLC7A11 蛋白水平均下降（tNrf-2分別為4.63、11.84、26.82，tGPX4分別為4.11、12.28、14.78，tSLC7A11分 別 為7.24、8.70、14.78， P均<0.01）；與順鉑組相比，羅哌卡因聯(lián)合順鉑組Nrf-2、GPX4、SLC7A11 蛋白水平降低（t分別為8.54、3.17、6.14，P均<0.01）。在LOVO/DDP細(xì)胞株中，與對照組相比，順鉑組GPX4 蛋白下降（t=8.58，P<0.01）、羅哌卡因組GPX4 蛋白下降（t=3.28，P<0.05），順鉑組及羅哌卡因組Nrf-2、SLC7A11 蛋白表達(dá)水平下降（tNrf-2分別為12.08、8.49，tLSLC7A11分別為5.57、4.49，P均<0.01），羅哌卡因聯(lián)合順鉑組Nrf-2、GPX4、SLC7A11 蛋白水平均下降（t分別為25.33、11.37、11.26，P<0.01）；與順鉑組相比，羅哌卡因聯(lián)合順鉑組細(xì)胞株中Nrf-2、GPX4、SLC7A11 蛋 白 水 平 下 降（t分 別 為9.73、7.56、7.17，P均<0.01），見表3、圖3。

表3 LOVO和LOVO/DDP細(xì)胞株中各組GPX4、Nrf-2、SLC7A11蛋白水平（ ± s）

表3 LOVO和LOVO/DDP細(xì)胞株中各組GPX4、Nrf-2、SLC7A11蛋白水平（ ± s）

組別LOVO細(xì)胞株Nrf-2蛋白GPX4蛋白SLC7A11蛋白羅哌卡因 + 順鉑組羅哌卡因組順鉑組對照組LOVO/DDP細(xì)胞株0.17 ± 0.03 0.75 ± 0.06 0.49 ± 0.05 0.97 ± 0.03 0.33 ± 0.04 0.76 ± 0.02 0.51 ± 0.02 0.89 ± 0.04 0.71 ± 0.03 1.04 ± 0.04 0.87 ± 0.06 1.40 ± 0.06羅哌卡因 + 順鉑組羅哌卡因組順鉑組對照組0.51 ± 0.04 1.14 ± 0.03 0.93 ± 0.05 1.44 ± 0.04 0.34 ± 0.07 1.07 ± 0.08 0.70 ± 0.02 1.39 ± 0.11 0.63 ± 0.06 1.10 ± 0.01 1.01 ± 0.04 1.28 ± 0.06

圖3 LOVO和LOVO/DDP細(xì)胞株Nrf-2、SLC7A11及GPX4表達(dá)的Western blotting電泳圖

3 討論

CRC 是常見的胃腸道惡性腫瘤，此病好發(fā)于40歲以上中老年人，男性多于女性。CRC 早期常無明顯臨床表現(xiàn)或僅有排便習(xí)慣和糞便性狀的改變，因此難以及時發(fā)現(xiàn)。當(dāng)患者出現(xiàn)全身明顯癥狀時常已到晚期，預(yù)后很差［6］。盡管目前治療方案多樣，但順鉑仍是CRC 患者重要的治療藥物，順鉑在治療初期能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但是隨著其廣泛使用，CRC 逐漸產(chǎn)生對順鉑的耐藥性［7］。因此解決CRC的順鉑耐藥性成為亟待解決的科研問題。

近年，越來越多研究證實(shí)，局麻藥可直接或間接影響腫瘤的進(jìn)展。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，局麻藥可抑制腫瘤復(fù)發(fā)，目前認(rèn)為這種效應(yīng)是多種因素共同調(diào)節(jié)的結(jié)果［8-9］。研究表明，局麻藥羅哌卡因可以通過調(diào)節(jié)Ras 和RhoA 信號通路、整合素ITGα2 和ITGβ1、Wnt/β-連環(huán)蛋白、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、細(xì)胞凋亡相關(guān)途徑和細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶ERK、非編碼RNA、Na+通道、脫氧核糖核酸去甲基化、NF-κB 途徑、MMP-9、PI3K/AKT 途徑及JNK 途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，并且大多數(shù)與腫瘤的化療敏感性有關(guān)［10］。雖然羅哌卡因在腫瘤治療中直接增敏作用的相關(guān)研究十分缺乏，但是已有研究表明同樣屬于酰胺類麻醉藥的利多卡因和布比卡因這兩種可局麻藥能夠通過抑制細(xì)胞內(nèi)RASSF1A 甲基化水平，使RASSF1A 表達(dá)增加，進(jìn)而增強(qiáng)順鉑對肝癌HepG2 和BEL-7402細(xì)胞的毒性作用［11］。根據(jù)以上研究，我們推測羅哌卡因具有增強(qiáng)腫瘤化療敏感性的潛能。研究［12］報(bào)道，羅哌卡因可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS 的生成增多，從而促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡發(fā)生。因此羅哌卡因與細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生是否存在聯(lián)系以及在腫瘤治療中是否具有藥效關(guān)系值得研究。

本研究通過體外建立的人結(jié)腸癌順鉑耐藥LOVO/DDP 細(xì)胞株不僅形態(tài)上與LOVO 細(xì)胞株存在明顯差異，而且顯著減弱了順鉑的細(xì)胞毒作用，說明發(fā)生順鉑耐藥的 LOVO/DDP 細(xì)胞株與順鉑敏感的LOVO 細(xì)胞株相比，改變顯著且耐藥特性突出。本研究中CCK-8 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因單獨(dú)處理時1 mmol/L 及以下濃度時對兩種結(jié)腸癌細(xì)胞株均無明顯細(xì)胞毒作用，僅當(dāng)濃度超過1 mmol/L 時可直接損失腫瘤細(xì)胞，說明低濃度羅哌卡因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞株無直接治療效果；而與之前單獨(dú)順鉑處理相比，1 mmol/L 羅哌卡因聯(lián)合1 μmol/L 順鉑處理兩種結(jié)腸癌細(xì)胞株后，LOVO 細(xì)胞株存活率進(jìn)一步下降；LOVO/DDP 細(xì)胞株在1 μmol/L 順鉑處理后存活率無明顯改變，1 mmol/L 羅哌卡因聯(lián)合1 μmol/L 順鉑處理后，細(xì)胞存活率發(fā)生明顯下降。通過以上結(jié)果并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道中羅哌卡因在腫瘤治療中的作用，我們認(rèn)為低濃度羅哌卡因雖無直接的細(xì)胞毒性作用，但其可能具有潛在的對化療藥物的增敏作用。通過平板克隆實(shí)驗(yàn)、Transwell 實(shí)驗(yàn)、MMP-9 表達(dá)檢測和流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)順鉑聯(lián)合羅哌卡因增強(qiáng)了對結(jié)腸癌細(xì)胞株尤其是LOVO/DDP 細(xì)胞株增殖和遷移的抑制及促凋亡作用。這說明羅哌卡因或許能成為一種腫瘤治療中的輔助藥物或增敏劑。羅哌卡因?qū)樸K具有增敏作用，但其作用機(jī)制仍尚不清楚。

鐵死亡是近年新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式。已有研究［13-14］證實(shí)，鐵死亡的發(fā)生能夠增強(qiáng)已耐藥腫瘤細(xì)胞對順鉑、多柔比星及紫杉醇等多種抗癌藥物的敏感性。目前認(rèn)為，鐵死亡能夠增強(qiáng)其他常規(guī)抗癌治療的敏感性是由于其通過調(diào)控GPX4、SLC7A11、Nrf-2 等蛋白表達(dá)水平加速了細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的耗竭和ROS 的堆積，從而導(dǎo)致細(xì)胞處于氧化應(yīng)激性失衡的敏感狀態(tài)，進(jìn)而在遇到其他化療藥物后更易于死亡。然而，到目前為止鐵死亡在癌癥化療敏感性方面的研究仍有限，需要更多研究加以補(bǔ)充。

有研究［15］發(fā)現(xiàn)，羅哌卡因可以誘導(dǎo)線粒體裂變蛋白DRP1，產(chǎn)生ROS 并引起線粒體功能障礙，包括線粒體膜電位降低、細(xì)胞色素C 氧化酶活性增強(qiáng)和ATP 產(chǎn)生。因此羅哌卡因是否也通過此機(jī)制即線粒體的改變及ROS 的產(chǎn)生增多，在腫瘤治療中發(fā)揮了增敏作用需要進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類似，羅哌卡因處理后兩種結(jié)腸癌細(xì)胞株內(nèi)線粒體膜電位均發(fā)生了下降且細(xì)胞內(nèi)ROS 水平及亞鐵離子明顯增多，羅哌卡因聯(lián)合順鉑組最為明顯。而線粒體形態(tài)和功能的改變、ROS 的積累及亞鐵離子增多已被證實(shí)是鐵死亡發(fā)生的標(biāo)志，降低的線粒體膜電位和細(xì)胞內(nèi)增多的ROS，為人結(jié)腸癌細(xì)胞株鐵死亡發(fā)生創(chuàng)造了有利條件。

Nrf-2 是一種轉(zhuǎn)錄因子，與kelch 樣ECH 關(guān)聯(lián)蛋白1（Keap1）和抗氧化反應(yīng)元件（Are）一起，調(diào)節(jié)抗氧化蛋白的表達(dá)，保護(hù)細(xì)胞免受由ROS 引起的應(yīng)激性損傷［16］。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS 水平升高， Keap1-Nrf-2 復(fù)合體分解而抑制Nrf-2 泛素化，然后Nrf-2 轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核并與Are 結(jié)合，誘導(dǎo)抗氧化蛋白的表達(dá)。在CRC 的耐藥機(jī)制中，GPX4 的過度表達(dá)會導(dǎo)致化療藥物效果下降，最終誘導(dǎo)癌細(xì)胞耐藥的發(fā)生。此外，細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的GPX4 還可通過調(diào)節(jié)ROS 水平來影響腫瘤上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，與患者預(yù)后不佳密切相關(guān)［17］。GPX4 表達(dá)或功能的下降可增強(qiáng)化療藥物對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的易感性［18-20］。已有研究證實(shí)，抑制Nrf-2 的表達(dá)能夠增強(qiáng)CRC 細(xì)胞和肝癌細(xì)胞等對順鉑、阿霉素、索拉非尼的敏感性［21-23］。SLC7A11不僅是鐵死亡的有效靶標(biāo)，在多種腫瘤耐藥的治療中，SLC7A11 也扮演重要的角色，包括肺腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤等等。我們對鐵死亡核心調(diào)控蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)羅哌卡因聯(lián)合順鉑顯著抑制了Nrf-2、GPX4 及SLC7A11 的表達(dá)。以上結(jié)果提示羅哌卡因與順鉑聯(lián)合用藥可能是通過調(diào)控Nrf-2、GPX4 及SLC7A11 蛋白，降低線粒體膜電位及促進(jìn)ROS 積累，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡，從而增強(qiáng)人結(jié)腸癌順鉑耐藥細(xì)胞株的順鉑敏感性。

總之，羅哌卡因可增強(qiáng)人結(jié)腸癌順鉑耐藥細(xì)胞株順鉑敏感性，其作用機(jī)制可能與由 Nrf-2、GPX4、SLC7A11 及線粒體膜電位水平降低、ROS水平升高誘導(dǎo)的鐵死亡有關(guān)。然而，目前我們的研究局限于體外實(shí)驗(yàn)，對羅哌卡因誘導(dǎo)鐵死亡在腫瘤耐藥過程中的作用機(jī)制了解仍十分有限，還需進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和臨床觀察進(jìn)行多方面驗(yàn)證。