陸偉東，李煒康，肖仔君

（1.韶關(guān)學(xué)院 化學(xué)與土木工程學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005；2.韶關(guān)學(xué)院 食品學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

小球藻（Chlorellasp.）是一類單細(xì)胞微生物. 小球藻能利用陽(yáng)光和CO2進(jìn)行光合作用，合成碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪和色素并釋放出O2［1］. 與高等植物相比，小球藻具有生長(zhǎng)速度快、碳水化合物產(chǎn)率高、可在廢水和荒漠地培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)［2］. 小球藻碳水化合物是制備生物乙醇的理想原料［3］. 因此，近年來(lái)廢水培養(yǎng)小球藻及提取小球藻碳水化合物是生物燃料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［4］. 目前，微藻碳水化合物提取方法主要有：硫酸溶液提取法［5］，微波、超聲、臭氧輔助鹽酸溶液提取法［6-8］，高壓放電輔助溶劑提取法［9-10］，離子液體提取法等［11］. 與揮發(fā)性有機(jī)溶劑相比，離子液體具有低揮發(fā)性、高選擇性和性質(zhì)可調(diào)等優(yōu)點(diǎn). 但是離子液體的制備過(guò)程復(fù)雜，且大多存在生物毒性. 低共熔溶劑（Deep eutectic solvents，DES）是一類由氫鍵給體和氫鍵受體按一定的化學(xué)計(jì)量比組成的二組分或者三組分的凝固點(diǎn)明顯低于各個(gè)組分純物質(zhì)熔點(diǎn)的低共熔混合物. DES 具有與離子液體相似的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)DES 的制備過(guò)程簡(jiǎn)單、100%原子經(jīng)濟(jì)性、生物相容性也高于離子液體. 因此，DES 在生物質(zhì)預(yù)處理及物質(zhì)提取與分離［12］、綠色化學(xué)［13］、藥物溶解［14］等領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì). 如在微藻生物質(zhì)預(yù)處理輔助油脂提取方面，浙江大學(xué)課題組研究了DES 輔助水熱法提取微藻油脂，證實(shí)DES 能促進(jìn)微藻生物質(zhì)解聚和溶解，進(jìn)而提高油脂提取效率［15］. 筆者報(bào)道了用多種DES預(yù)處理小球藻生物質(zhì)強(qiáng)化小球藻油脂提取，探究了DES 預(yù)處理強(qiáng)化小球藻油脂提取的微觀機(jī)理［16］. 但是，適用于小球藻碳水化合物提取的DES、DES 提取小球藻碳水化合的影響因素及其機(jī)理和提取液抗氧化性尚未清楚. 筆者將從適用于小球藻碳水化合物提取的DES 篩選入手，考查提取的影響因素及其原因，并對(duì)DES 提取液的抗氧化性進(jìn)行測(cè)定. 為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)DES 在小球藻代謝物提取的應(yīng)用提供技術(shù)支撐，也為DES 在其他生物活性物質(zhì)的提取與分離提供借鑒.

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

主要材料有小球藻粉（購(gòu)自青島科海生物有限公司）、氯化膽堿、草酸、葡萄糖、抗化血酸等，所用試劑均為分析純. 主要儀器有高速離心機(jī)（湖南湘儀）和紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）DES 制備：分別將氫鍵供體和氫鍵受體按照一定摩爾比加入圓底燒瓶中，在80 ℃恒溫加熱攪拌2 h 左右，得到無(wú)色透明液體，冷卻至室溫. 所有的樣品使用前均先在80 ℃的真空干燥箱中干燥24 h.

（2）DES 提取小球藻碳水化合物：精準(zhǔn)稱量0.1 g 藻粉，按一定料液比加入DES 并置于水浴鍋中加熱.提取完畢后混合液離心（5 000 r·min-1，10 min）得上清液，上清液用于碳水化合物含量的測(cè)定.

（3）小球藻及DES 提取液中碳水化合物含量測(cè)定：小球藻及DES 提取液中碳水化合物含量測(cè)定參考Zhao 等的實(shí)驗(yàn)方法并作了一定的修改［7］. 具體步驟為：稱取20 mg 左右小球藻粉，放置于10 mL 的玻璃離心管中，加入5 mL 0.5 mol·L-1的硫酸溶液，100 ℃條件下水解4 h，冷卻至室溫后離心（3 500 r·min-1，5 min），重復(fù)上述步驟3 次，所得上清液定容，用于小球藻總碳水化合物含量測(cè)定. 碳水化合物含量測(cè)定過(guò)程為：取樣品，加入苯酚和濃硫酸溶液進(jìn)行反應(yīng)，顯色后于490 nm 測(cè)定吸光度，計(jì)算出樣品碳水化合物含量. 碳水化合物提取率為小球藻DES 提取液中碳水化合物含量與小球藻樣品中碳水化合物含量的百分比.

（4）抗氧化性測(cè)定：小球藻DES 提取液、小球藻水提取液和抗壞血酸的超氧化物清除能力和羥基的清除能力測(cè)定參考孫利芹的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行［17］.

2 結(jié)果與分析

2.1 DES 篩選

DES 的結(jié)構(gòu)決定了其物理化學(xué)性質(zhì)，DES 的物理化學(xué)性質(zhì)顯著影響其對(duì)小球藻碳水化合物提取效率. 筆者合成了11 種DES 并將其用于小球藻碳水化合物提取. 同時(shí)作為對(duì)比，還測(cè)定了水和1 mol·L-1草酸溶液提取小球藻碳水化合物的提取率. 結(jié)果如圖1 所示，DES 對(duì)小球藻碳水化合物的提取率在36.79%~79.41%之間. 其中氯化膽堿/草酸（1∶1，摩爾比，下同）對(duì)小球藻碳水化合物提取率最高（79.41%），高于相同提取條件下水的提取率（40.37%）和1 mol·L-1草酸水溶液的提取率（50.44%）. 其主要原因可能為氯化膽堿/草酸（1∶1）是強(qiáng)酸性DES 且能與小球藻細(xì)胞壁中的纖維素和半纖維素形成氫鍵，降低了纖維素和半纖維的鍵能，有利于小球藻細(xì)胞壁中的纖維素和半纖維素水解［16］. 因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用氯化膽堿/草酸（1∶1）來(lái)提取小球藻碳水化合物.

圖1 不同DES 對(duì)碳水化合物的提取率

2.2 提取溫度對(duì)碳水化合物提取率的影響

溫度能顯著影響化學(xué)反應(yīng)速率和物質(zhì)擴(kuò)散速率. 固定反應(yīng)時(shí)間為60 min，液固比20∶1（v/m，下同），分別測(cè)定溫度為30、40、50、60、70、80 ℃時(shí)小球藻碳水化合物提取率. 由圖2 可以看出，隨著提取溫度升高，DES 對(duì)小球藻碳水化合物的提取率顯著增加. 提取溫度為30 ℃時(shí)，提取率為51.60%. 當(dāng)提取溫度升至80 ℃時(shí)，碳水化合物的提取率為81.19%，提高了約30%. 其主要原因是隨著提取溫度的增加，小球藻細(xì)胞壁纖維素和半纖維素等碳水化合物快速水解. 同時(shí)，溫度的提高也有利于小球藻細(xì)胞內(nèi)碳水化合物向溶劑擴(kuò)散［18］. 由于提取溫度也是影響小球藻胞內(nèi)物質(zhì)穩(wěn)定性和生物活性的主要因素，且提取溫度是小球藻生物煉制能耗的主要部分. 因此，筆者不考查更高提取溫度，后續(xù)實(shí)驗(yàn)的提取溫度采用80 ℃.

圖2 提取溫度對(duì)提取率的影響

2.3 提取時(shí)間對(duì)碳水化合物提取率的影響

固定提取溫度80 ℃，液固比20∶1，考查不同提取時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）對(duì)DES 提取小球藻碳水化合物效率的影響. 由圖3 可知，隨著提取時(shí)間從10 min增加至30 min，DES 對(duì)小球藻碳水化合物的提取率顯著增加（從47.04%增加至72.47%）. 此結(jié)果與Yirgu 等采用微波輔助稀鹽酸提取柵藻（Scenedesmussp.）碳水化合物相似［6］. 其主要原因是開(kāi)始提取階段，小球藻細(xì)胞碳水化合物含量與DES 相中碳水化合物濃度存在較大差異，有利于提取. 當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)30 min 后再進(jìn)一步延長(zhǎng)提取時(shí)間，DES 對(duì)小球藻碳水化合物提取率增加不顯著. 主要原因是經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)提取時(shí)間后，DES 相中碳水化合物的濃度增加明顯，固液相碳水化合物的濃度差顯著變小，碳水化合物向DES 相擴(kuò)散的速率也顯著降低［19］. 綜合考慮提取率和提取成本，30 min 為較佳的提取時(shí)間.

2.4 含水量對(duì)碳水化合物提取率的影響

氯化膽堿/草酸（1∶1）在常溫下黏度較高，不利于物質(zhì)擴(kuò)散. 因此，固定提取溫度80 ℃，提取時(shí)間60 min，液固比20∶1，通過(guò)在氯化膽堿/草酸（1∶1）中加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蒸餾水（5%、10%、15%和20%），考查蒸餾水的加入量對(duì)小球藻碳水化合物提取率的影響. 作為對(duì)照，同時(shí)也測(cè)定未加水的DES 對(duì)小球藻碳水化合物的提取率. 由圖4 可以看出，未加水的氯化膽堿/草酸（1∶1）對(duì)小球藻碳水化合物的提取率為79.40%，蒸餾水添加量為5%時(shí)，提取率增加至81.13%. 當(dāng)蒸餾水的添加量超過(guò)5%后，碳水化合物的提取率顯著下降，當(dāng)蒸餾水的添加量增加至20%時(shí)，碳水化合物的提取率僅為66.06%. 其主要原因是少量的蒸餾水加入可以降低DES 的黏度，有利于碳水化合物從藻細(xì)胞擴(kuò)散到溶液相. 但是，過(guò)量的水加入DES，會(huì)破壞DES 的氫鍵結(jié)構(gòu)，不利于DES 形成超分子結(jié)構(gòu)并與藻細(xì)胞壁的纖維素、半纖維素形成氫鍵提高藻細(xì)胞壁的通透性［20］.

2.5 超氧化物的清除能力

超氧化物是含有超氧離子（O2-）的一類化合物.它是一種活性氧，若生物體內(nèi)O2-產(chǎn)生過(guò)量或體內(nèi)過(guò)氧化物歧化酶活力下降，都將會(huì)給機(jī)體造成損傷［21］.采用鄰苯三酚在堿性條件下產(chǎn)生的O2-，并測(cè)定小球藻DES 提取液、小球藻水提取液和抗壞血酸水溶液對(duì)O2-的清除能力，結(jié)果如圖5 所示. 可以看出，隨著小球藻DES 提取液質(zhì)量濃度提高，其超氧化物清除率快速增加，當(dāng)小球藻DES 提取液為0.2 mg·mL-1時(shí)，超氧化物清除率為97.56%，繼續(xù)增加小球藻DES 提取液質(zhì)量濃度，超氧化物清除率變化不顯著. 此外還可以看出，小球藻DES 提取液的超氧化物清除率均比相同質(zhì)量濃度下的小球藻水提取液和抗壞血酸水溶液的超氧化物清除率高. 其主要原因是DES 提取液對(duì)小球藻碳水化合物的提取率要顯著高于水的提取率，而小球藻多糖中存在大量的羥基和硫酸基團(tuán)，可與O2-反應(yīng)，從而清除O2-［21］.

圖5 超氧化物的清除率

2.6 羥基的清除能力

羥基自由基（·OH）具有極高的氧化活性. 它能引起生物體的病變. 因此，·OH 清除率常被用于評(píng)價(jià)抗氧化劑的抗氧化性［21-22］. 分別對(duì)不同質(zhì)量濃度的小球藻DES 提取液和抗壞血酸的清除自由基效率進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果如圖6 所示. 可以看出，當(dāng)小球藻DES 提取液的質(zhì)量濃度低于0.5 mg·mL-1時(shí)，提取液對(duì)羥基自由基清除率呈緩慢增加的趨勢(shì)，且小球藻DES 提取液對(duì)羥基自由基的清除率與同質(zhì)量濃度的抗壞血酸對(duì)羥基自由基的清除率相當(dāng). 當(dāng)小球藻DES 提取液的質(zhì)量濃度高于0.5 mg·mL-1時(shí)，提取液對(duì)羥基自由基清除率顯著增加，小球藻DES 提取液對(duì)羥基自由基的清除率顯著高于同質(zhì)量濃度的抗壞血酸對(duì)羥基自由基的清除率. 當(dāng)小球藻DES 提取質(zhì)量液濃度為3.2 mg·mL-1時(shí)，其對(duì)羥基自由基的清除率高達(dá)93.38%，同質(zhì)量濃度的抗壞血酸對(duì)羥基自由基的清除率僅為28.14%.

圖6 提取液對(duì)羥基自由基的清除能力

3 結(jié)論

當(dāng)提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為60 min 和水添加量為5%時(shí)，氯化膽堿/草酸（1∶1）低共熔溶劑對(duì)小球藻碳水化合物的提取率達(dá)到81.3%，顯著高于水提法的提取率（40.37%）. 此外，小球藻氯化膽堿/草酸（1∶1）提取液的超氧化物清除能力和自由基清除能力也顯著高于同質(zhì)量濃度的小球藻水提取液和抗壞血酸的超氧化物清除能力和羥基清除能力. 但是，由于低共熔溶劑的沸點(diǎn)與常規(guī)溶劑相比較高，回收存在一定的困難，因此仍需對(duì)目標(biāo)化合物分離與純化進(jìn)行進(jìn)一步的研究.