染色法構建對超臨界CO2提取沙棘籽油的過程分析

周 雅, 周雪華, 謝雨波, 嚴曉陽, 王 芳,, 鄧 剛

(浙江省特色經(jīng)濟植物生物技術研究重點實驗室;浙江師范大學化學與生命科學學院1,金華 321004) (浙江師范大學行知學院理學院2,蘭溪 321100)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)屬胡頹子科沙棘屬落葉灌木,截至2022年在我國種植總面積約為1.273×106hm2,約占世界沙棘種植總面積的55%[1]。成熟的沙棘果年產(chǎn)量為50～60萬t,并且將以每年10%～20%的速度增長,其加工后約產(chǎn)生13.8萬t的沙棘籽[2]。沙棘籽富含油脂,油脂質量分數(shù)為8%～20%[3],并且沙棘籽油具有抗氧化、抗菌、促進傷口愈合及抑制心血管疾病等多種生理活性[4],因而在醫(yī)藥、食品、日用化工等領域均有廣泛應用[5-7]。

超臨界CO2提取可以從沙棘籽中獲取無污染、純天然的沙棘籽油[8],相比于傳統(tǒng)的提取工藝如機械壓榨法[9]、溶劑提取法[10],該法避免了有機溶劑消耗、熱降解和萃取時間長等弊端,確保了產(chǎn)品的質量,符合綠色發(fā)展趨勢[11]。研究加壓提取過程中物料內(nèi)容物的分布及含量變化,進而構建油脂釋放動力學,對深入了解提取機理、優(yōu)化工藝及提高油脂品質等方面均有非常重要的意義。隨著油脂染色技術、顯微顯影技術的迅猛發(fā)展[12-15],油脂的可視化顯影可以識別并精準定量植物[14]、動物[16]、微生物[17]中的油脂。特別是Mehlem等[16]采用了油紅O對肝細胞中的脂質進行了特異性染色,并構建了分析定量方法,用于病理研究,證實了油紅O相比于其他特異性脂溶性染料,染色后觀察到的脂滴邊界更清晰,且無背景干擾[18,19]。此外,Lopez-ordaz等[14]用油紅O染色法對天然蓖麻種子胚乳細胞進行了顯影,證實了細胞內(nèi)脂質體形變及脂質去除。然而,前期研究表明,常規(guī)ORO染色應用于顯影粉碎干燥后果蔬籽料內(nèi)油脂時,脂滴經(jīng)常發(fā)生移位,且染色極易過染或不充分,無法滿足對物料內(nèi)脂滴可視化顯影分析的需求。

研究分析ORO常規(guī)染色法用于顯影干物料中沙棘籽油存在的一些問題,對一些關鍵步驟進行改進,新構建ORO逐級染色法,優(yōu)化新方法的染色間隔時間,調(diào)整其染色級數(shù)和染液濃度,以獲取最佳的籽油顯影,創(chuàng)建相應的油脂定量方法,評價該方法的精密度和準確性,應用ORO逐級染色法直觀地分析了超臨界CO2提取沙棘籽油的過程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘籽采購自甘肅省張掖市民樂縣,于55 ℃鼓風干燥至恒重,經(jīng)機械研磨后,過40目標準篩,選取粒徑范圍為400～500 μm的顆粒進行后續(xù)的研究,真空密封后置于-20 ℃避光儲藏。

油紅O染料(Biological Stain);CO2氣體(純度≥99.9%);Tissue-Tek OCT冷凍包埋劑;乙醚、異丙醇等均為分析純。

油紅O染液的配制:稱取0.5 g油紅O溶解于100 mL異丙醇中,配制成質量濃度5 mg/mL的油紅O母液,使用體積分數(shù)60%異丙醇對油紅O母液進行稀釋,得到不同濃度的油紅O工作液。

1.2 實驗儀器

HELIX超臨界天然產(chǎn)物萃取裝置,CM1950冷凍切片機,BX53光學顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 ORO常規(guī)染色法和逐級染色法

ORO常規(guī)染色法:使用包埋劑對沙棘籽樣品進行包埋,冷凍至-20 ℃,切片,厚度為25 μm。在切片上滴加20 μL 2 mg/mL ORO工作液,靜置3 min后,傾斜去除染液,沖洗切片3次,加蓋玻片進行顯影觀察。

ORO逐級染色法:在樣品切片上,滴加10 μL 60%異丙醇,浸潤1～2 min。然后滴加2 μL的ORO工作液進行第一級的滴染,間隔一定時間后顯影,觀察脂滴是否充分上染,重復染色步驟進行逐級染色,直至染色充分。

1.3.2 面積占比法的構建

面積占比法:使用Image J圖像數(shù)據(jù)分析軟件(v 1.51j)對ORO逐級染色后的顯影圖像進行處理,通過設定閾值,識別研究區(qū)域內(nèi)的染色脂滴,讀取脂滴的面積占比(AF)。由于冷凍切片厚度一致,沙棘籽物料內(nèi)的油脂含量(SOF),可由公式計算得到:

式中:ρsample為沙棘籽切片密度1.06 g/cm3;ρoil為沙棘籽油密度0.934 g/cm3。

精密度和準確度評價:采用索氏提取法提取沙棘籽油,提取過程中隨機取樣,制備了5個未知油含量的樣本。提取液經(jīng)旋轉蒸發(fā)脫除溶劑,得到沙棘籽油,采用傳統(tǒng)萃取稱重法計算油含量,重復3次取平均值。對各取樣樣本進行包埋、冷凍切片、ORO逐級染色后,采用面積占比法計算得到樣本中的油含量。計算了2種方法測量結果的相對標準偏差(RSD),評價方法的重現(xiàn)性,并對2種方法進行了相關性分析,計算相關系數(shù)R值,評價新構建方法的準確性。

1.3.3 可視化微觀顯影超臨界CO2提取沙棘籽油的過程

稱取100 g沙棘籽粉末,與等體積玻璃珠混合,置于萃取釜,在壓力為30 MPa,溫度為45 ℃及CO2流速為5 L/h的條件下,進行超臨界CO2萃取沙棘籽油,萃取時間為5 h,每隔0.5 h對物料進行取樣,經(jīng)ORO逐級染色后顯影觀察,使用面積占比法計算油含量,繪制了沙棘籽油的提取得率曲線,通過計算獲得提取速率曲線。

2 結果與分析

2.1 ORO常規(guī)染色法顯影干物料存在的問題

ORO常規(guī)染色方法顯影干物料存在的問題如圖1所示。

新鮮的沙棘籽內(nèi)部的油脂通常以封閉囊泡的形式束縛于細胞中,但經(jīng)干燥粉碎后的籽料是一種開放體系,脂滴以游離形式存在于微腔中,采用ORO常規(guī)染色法對其染色時,會出現(xiàn)一些問題。當物料中的油含量較高,所用染液的染料濃度偏低,則脂滴會發(fā)生染色不充分而呈現(xiàn)黃色(圖1a),后繼的洗脫步驟在洗去多余染料的同時,也會帶走少量與脂滴結合的染料。此外,如果染色時間過短,脂滴無法完全和染料融合,也可能發(fā)生染色不充分。當物料中的油含量較低時,所用的染料濃度偏高,則會導致脂滴過染(圖1b),期間如果染色時間過長,染液中的溶劑揮發(fā),ORO染料將會發(fā)生結晶,造成染料板結現(xiàn)象(圖1c)。特別要指出的是,常規(guī)方法的一次性滴加染液的方式及洗脫步驟均會造成脂滴遷移(圖1d)、脂滴損失(圖1e)等現(xiàn)象。由此可知,ORO常規(guī)染色法很難客觀地顯影樣品中的沙棘籽油,因而無法滿足含油物料加工及提取過程中樣本監(jiān)測的要求。

2.2 ORO逐級染色法的染色間隔時間優(yōu)化

ORO逐級染色法是在樣本切片表面分多次滴加微量的染液,以保持物料始終處于浸潤狀態(tài),利于染液對脂滴進行均勻上色,直至染色充分。每次滴加染液后,染料分子在微濕的微環(huán)境中擴散,再與脂滴進行結合而顯色,因而染色間隔時間對顯影的影響較大。分別采用不同染色間隔時間對籽油進行顯影,ORO逐級染色間隔時間的優(yōu)化如圖2所示。當染色間隔時間為1 min時,由于染色間隔時間過短,ORO染料在切片內(nèi)擴散不充分,導致脂滴不能均勻上色,并且多數(shù)脂滴未被充分染色(圖2a)。當染色間隔時間為3 min時,由于染色間隔時間過長,切片內(nèi)部的溶劑逐漸揮發(fā),染料分子向周邊擴散,脂滴呈現(xiàn)不規(guī)則的形態(tài)(圖2c)。最終選擇的適合的染色間隔時間為1.5 min,在此條件下沙棘籽切片中的脂滴可被充分染色而呈現(xiàn)、明亮的紅色(圖2b)。

2.3 ORO逐級染色法中染色級數(shù)和染液濃度的調(diào)整

ORO逐級染色沙棘籽油顯影過程如圖3所示,以相同油含量的同批次物料為例,期間調(diào)整染液濃度和染液級數(shù),直至脂滴均勻充分上色。圖3a列中使用了1 mg/mL低質量濃度染液,在一、二級中脂滴染色不充分,第三級中脂滴充分染色,而第四級物料中脂滴已過染;圖3b列增大染液質量濃度至2 mg/mL后,在一級中脂滴染色不充分,而第三級中脂滴輕度過染,表明此條件下二級染色中脂滴充分染色;使用更高質量濃度3 mg/mL的染液進行滴染,如圖3c列所示,一、二級中脂滴已過染,由此表明使用的ORO染液濃度不宜過高,可針對不同含油量樣本調(diào)整染液濃度,少量多次的滴加染液,從而找到染色充分的級數(shù)。ORO逐級染色過程中,每一級微量的染液能被樣本吸收,能使切片始終處于半浸潤狀態(tài),與常規(guī)染色法相比,不會有染液溢出,也無需洗脫步驟,可真實客觀地呈現(xiàn)干物料中的脂質分布,從而滿足了籽油提取過程中的可視化分析需求。

圖3 ORO逐級染色沙棘籽油顯影過程 (標尺100 μm)

2.4 沙棘籽油面積占比定量法的構建

ORO逐級染色法可對未知油含量樣本中的脂滴進行充分染色,并且客觀顯影其在物料中的分布,基于該方法進一步構建了定量沙棘籽油的面積占比法,并與傳統(tǒng)萃取質量法進行了對比評測分析。分別使用2種方法測定了5個隨機樣本中的油含量,計算了RSD,面積占比法和萃取質量法的對比評價分析如圖4所示,面積占比法的平均標準偏差約為2.49%,略低于萃取質量法的2.74%,說明面積占比法測定油脂含量的重現(xiàn)性更好。然后對2種方法測定結果進行了線性相關性分析,得到2組數(shù)據(jù)的相關系數(shù)高達0.998,呈現(xiàn)嚴格的正相關,表明新構建的面積占比法的準確性與傳統(tǒng)萃取質量法相當,能準確測定沙棘籽物料內(nèi)部的油含量。

圖4 面積占比法和萃取質量法的對比評價分析

2.5 ORO逐級染色法對超臨界CO2提取沙棘籽油的過程分析

在壓力為30 MPa、溫度為45 ℃的條件下進行超臨界CO2萃取沙棘籽油,采用面積占比法繪制提取過程曲線(圖5),并計算了該曲線各點的斜率,得到了相應的提取速率曲線,超臨界CO2提取沙棘籽油的過程分析如圖6所示。提取曲線呈現(xiàn)典型的三階段過程[20]:1) 恒速提取期(CER,0～1 h);2) 減速提取期(FER,1～4 h);3) 擴散提取期(DC,4～5 h)。對各階段的物料進行取樣,經(jīng)ORO逐級染色法進行染色顯影分析。圖6a表明,物料提取前沙棘籽油密集分布于微腔內(nèi),脂滴呈球形,直徑約為5 μm,SOF值接近13.1%;在CER期(圖6b),附著在籽料顆粒內(nèi)表面的沙棘籽油極易被提取,SOF值迅速下降至3.61%,相應的油得率約為9.5%,約占總油脂得率的73.0%,并且油脂以恒定的速率釋放至超臨界流體中;進入FER期后,由圖6c和圖6d可知,籽料顆粒內(nèi)僅有少量脂滴殘留,且脂滴直徑明顯變小,SOF值從2.77%緩慢下降至1.48%,油得率約為11.6%,油提取速率則由恒速期的100 mg/h下降至39 mg/h,該階段仍受對流傳質控制,并且顆料內(nèi)的易提取油已基本提取殆盡;在DC期(圖6e),只有極少量脂滴以結合態(tài)的形式殘留于微腔內(nèi)部,SOF值僅為1.48%,最終油得率為13.1%,該階段主要受擴散傳質控制,相應的油提取速率均小于30 mg/h,這一結果與Han等[21]對紅花籽油提取動力學研究相一致。通過新方法對超臨界CO2提取沙棘籽油的動態(tài)釋放過程進行了綜合分析,可用于闡明加壓流體在各個不同階段的提取作用機制,利于更精準地獲取最優(yōu)的操作條件,提高原料的利用率及有效地降低提取成本。

圖5 沙棘籽油的提取過程

圖6 超臨界CO2提取沙棘籽油的過程分析(標尺100 μm)

3 結論

針對ORO常規(guī)染色法中出現(xiàn)的脂滴遷移、染色不充分等問題,構建了ORO逐級染色法,通過控制染料濃度及染色級數(shù),可客觀地顯影脂滴在物料中的分布,基于此進一步構建了相應的油脂定量方法。采用新染色方法直觀分析了超臨界CO2提取沙棘籽油的CER、FER和DC三階段提取過程,可作為一種研究復雜流體提取動力學有效的輔助手段。ORO逐級染色法可有效地監(jiān)測加工處理過程中籽油在物料內(nèi)部的分布及遷移,實時觀測其含量變化,為籽料為油的提取理論研究及實際生產(chǎn)加工提供可靠的影像學參考。