漢灘病毒糖蛋白Gn的T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)及其跨種屬驗(yàn)證

孫報(bào)增，秦聰聰，張俊琦，王永凱，張文標(biāo)，劉瑞波，白天原，張志輝，張宇絲，楊琨,2,3，姜東伯,2,4*

1空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，陜西 西安 710032；2空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物武器損傷防治藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710032；3空軍醫(yī)科大學(xué)唐都醫(yī)院風(fēng)濕科，陜西 西安 710032；4空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室，陜西 西安 710032

漢坦病毒屬(Hantavirus)屬于布尼亞病毒科，包括漢灘病毒(Hantaan virus，HTNV)、多布拉-貝爾格萊德病毒、普馬拉病毒和首爾病毒等，其在歐亞大陸主要引起腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)[1-2]。HFRS 以鼠類等嚙齒類動(dòng)物為主要傳染源，表現(xiàn)為發(fā)熱、出血、急性腎功能損傷等。我國是HTNV 所致HFRS 的主要疫源地，占全球感染病例的70%～90%，發(fā)病率和病死率均較高[3]。HTNV 為三股單負(fù)鏈RNA 病毒，由S、M 和L片段組成，分別編碼RNA 依賴性RNA 聚合酶(RdRp)、糖蛋白(GP)及核衣殼蛋白(NP)[4]。其中GP構(gòu)成HTNV 的主要抗原，同時(shí)可被加工分解成包膜糖蛋白-N 末端(Gn)及包膜糖蛋白-C 末端(Gc)，構(gòu)成病毒吸附蛋白，能夠識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞表面受體，刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在病毒對(duì)機(jī)體細(xì)胞的侵襲及感染過程中發(fā)揮重要作用，因此可作為HFRS 疫苗研究的潛在靶點(diǎn)[5]。然而，在現(xiàn)有的表位研究中，篩選鑒定的限制性表位不全面，針對(duì)表位的研究比較單一，不能全面揭示表位特性。同時(shí)，尋找人類的表位較困難，難以開展相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，而前期研究發(fā)現(xiàn)，采用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的方法具有全面準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)效益高的優(yōu)勢(shì)[6-8]。因此，本研究對(duì)Gn 進(jìn)行了系統(tǒng)分析，以探索主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-Ⅰ、Ⅱ類表位免疫反應(yīng)性的相關(guān)規(guī)律，指導(dǎo)新型HFRS 表位疫苗的研發(fā)，預(yù)防漢坦病毒的跨物種傳播風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 Gn 蛋白序列獲取 從UniProt 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)檢索HTNV 76-118 株Gn 蛋白序列(PRO_0000036816)[9]，氨基酸序列從aa1至aa649。

1.2 Gn蛋白表位親和力預(yù)測(cè)

1.2.1 預(yù)測(cè)工具的選取 利用5 種預(yù)測(cè)算法，包括IEDB(http://tools.iedb.org/mhci/)[10]、 SMMPMBEC(https://github.com/ykimbiology/smmpmbec)[11]、NetMHCpan 4.1(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCpan-4.1)[12]、SYFPEITHI(http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm)[13]、Rankpep(http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html)[14]全長(zhǎng)無偏倚地獲得高親和力的表位候選肽，并對(duì)HTNV Gc 蛋白序列進(jìn)行序列寡肽分割，計(jì)算MHC-Ⅰ類分子與9 肽表位之間的親和力；利用4 種預(yù)測(cè)算法，包括IEDB、NetMHC Ⅱpan3.2(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? NetMHCIIpan-3.2)[12]、SYFPEITHI、Rankpep來預(yù)測(cè)MHC-Ⅱ類分子與15肽表位之間的親和力。

1.2.2 MHC-Ⅰ類限制性表位的預(yù)測(cè)與篩選 對(duì)IEDB推薦的人類白細(xì)胞抗原(HLA)-Ⅰ類亞型等位基因及Allel Frequency[15]網(wǎng)站(http://www.allelefrequencies.net/)中各地區(qū)基因頻率＞10%的HLA基因型進(jìn)行親和力分析，包括HLA-A1(-A*0101、HLA-A*2601、-A*3001、-A*3002)、HLA-A2(HLA-A*0201、-A*0203、-A*0206、-A*0207、-A*0212、-A*6802)、HLA-A3(HLA-A*0301、 -A*1101、 -A*3001、 -A*3101、 -A*3301、 -A*6801)、 HLA-A24(HLA-A*2301、 -A*2402、 -A*2407、-A*3201)、HLA-A*3303、HLA-A*3108、HLA-A*3401、HLA-B7(HLA-B*0702、-B*3501、-B*5101、-B*5301)、HLA-B8(HLA-B*0801)、 HLA-B*1301、 HLA-B*1405、HLA-B15(HLA-B*1501、-B*1502、-B*1506、-B*1512、-B*1521)、 HLA-B*1807、 HLA-B*3508、 HLA-B*3903、HLA-B44(HLA-B*4001、-B*4002、-B*4006、-B*4402、-B*4403、 -B*4404)、 HLA-B46(HLA-B*4601)、 HLAB50(HLA-B*5001)、 HLA-B*5110、 HLA-B*5201、HLA-B*5502、 HLA-B*5601、 HLA-B58(HLA-B*5701、-B*5801)。上述基因型覆蓋了超過99.3% 人群的MHC-Ⅰ類亞型。以每種算法結(jié)果中前2%的預(yù)測(cè)表位為候選優(yōu)勢(shì)表位，至少在3 種預(yù)測(cè)算法結(jié)果中出現(xiàn)的表位作為優(yōu)勢(shì)表位[16]。

1.2.3 MHC-Ⅱ類限制性表位的預(yù)測(cè)與篩選 MHC-Ⅱ類分子包括4 個(gè)HLA-Ⅱ超家族：DRB1(DRB1*0101、DRB1*0301、DRB1*0304、DRB1*0401、DRB1*0405、DRB1*0407、DRB1*0412、DRB1*0701、DRB1*0704、DRB1*0802、DRB1*0803、DRB1*0901、DRB1*1101、DRB1*1104、DRB1*1201、DRB1*1202、DRB1*1301、DRB1*1302、DRB1*1304、DRB1*1401、DRB1*1402、DRB1*1408、DRB1*1409、DRB1*1501、DRB1*1502、DRB1*1503、DRB1*1602)，DRB3/4/5(DRB3*0101、 DRB3*0202、 DRB4*0101、 DRB5*0101)，DQA1/DQB1(DQA1*0501/DQB1*0201、 DQA1*0501/DQB1*0301、DQA1*0301/DQB1*0302、DQA1*0401/DQB1*0402、DQA1*0101/DQB1*0501、DQA1*0102/DQB1*0602)，DPB1(DPB1*0101、DPB1*0201、DPB1*0401、DPB1*0402、DPB1*0501、DPB1*1401)。上述基因型覆蓋了超過98%人群的MHC-Ⅱ類亞型，且在Allel Frequency 網(wǎng)站(http://www.allelefrequencies.net/)中各地區(qū)的基因型頻率＞10%。以每種算法結(jié)果中前2%的預(yù)測(cè)表位為候選優(yōu)勢(shì)表位，至少在2種預(yù)測(cè)算法結(jié)果中出現(xiàn)的表位作為優(yōu)勢(shì)表位。

1.3 HTNV Gn MHC-Ⅰ/Ⅱ類限制性表位的免疫原性分析 高親和力肽不能充分誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，因此需對(duì)優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行免疫原性分析[17]。免疫原性由氨基酸序列所決定。本研究采用VaxiJen v2.0(http：//www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html)[18]計(jì)算9肽、15肽表位的免疫原性，以評(píng)分＞0.5為陽性標(biāo)準(zhǔn)，即該表位被視為強(qiáng)免疫原性，否則為不具有免疫原性。

為進(jìn)一步探究高親和力、強(qiáng)免疫原性的優(yōu)勢(shì)表位跨人群、物種的交叉免疫反應(yīng)性，將各個(gè)基因型篩選出來的高親和力、強(qiáng)免疫原性的優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行對(duì)比分析，15 肽表位用其核心9 肽來表示，并采用Excel繪制三維柱狀圖。

1.4 HTNV Gn MHC-Ⅰ/Ⅱ類限制性表位的保守性預(yù)測(cè) 為了確定HTNV 76-118毒株Gn序列中優(yōu)勢(shì)表位的進(jìn)化保守性，采用Blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)[19]工具預(yù)測(cè)高親和力、強(qiáng)免疫原性的9肽和15肽表位的種間種內(nèi)保守性。其中，種間保守的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為除漢坦病毒(HTNV，taxid：1980471)、人(Human，taxid：9606)、鼠(Mouse，taxid：10088)外的正漢坦病毒(Orthohantavirus，taxid：1980442)，而種內(nèi)保守評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為除漢灘病毒76-118 株(Hantaan virus 76-118，taxid：11602)、人(Human，taxid：9606)、鼠(Mouse，taxid：10088)外的漢灘病毒(Hantaan hantavirus，taxid：1980471)。在分析結(jié)果中，若E值＜10-5，則認(rèn)為保守。本實(shí)驗(yàn)選擇種間、種內(nèi)均保守的表位作為候選靶標(biāo)。

1.5 雙向聚類分析 MHC 分子多態(tài)性和表位肽多樣性構(gòu)成了pMHC 相互作用的差異性。為了將其中的關(guān)系可視化，利用TBtools[20]對(duì)MHC-Ⅰ、Ⅱ基因型與HTNV Gn 表位親和力的排名進(jìn)行雙向?qū)哟尉垲?。親和力排序數(shù)據(jù)通過以2為底的對(duì)數(shù)和Z得分標(biāo)準(zhǔn)化處理之后，用Complete 方法進(jìn)行歐氏距離的雙向?qū)哟尉垲?。分析包?7 個(gè)MHC-Ⅰ類分子與HTNV Gn 9 肽的相互作用及51 個(gè)MHC-Ⅱ類分子與HTNV Gn 15肽表位的相互作用。

1.6 模擬pMHC分子對(duì)接

1.6.1 HTNV Gn 9肽與MHC-Ⅰ類分子模擬對(duì)接HPEPDOCK(http://huanglab.phys.hust.edu.cn/hpepdock/)[21]是一種新型的網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，通過輸入9 肽優(yōu)勢(shì)表位序列與MHC-Ⅰ類分子PDB 格式文件即可模擬pMHC對(duì)接并獲得對(duì)接模型。使用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)即可獲得相關(guān)的MHC-Ⅰ類分子3D 結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)[HLA-A0206(3OXR)、 HLA-A2402(5WWJ)、 HLA-A0101(4NQX)、 HLA-B5301(1A1N)、HLA-B4001(6IEX)、 HLA-B5801(5V5L)、 HLA-B0801(3X13)、H2Kb(6JQ3)、H2-Ld(6L9M)]。對(duì)高親和力、強(qiáng)免疫原性和種間種內(nèi)均保守的9 肽優(yōu)勢(shì)表位與上述MHC-Ⅰ類分子模擬對(duì)接，觀察對(duì)接形式及相應(yīng)的對(duì)接分?jǐn)?shù)。每個(gè)9肽與MHC-Ⅰ類分子對(duì)接會(huì)產(chǎn)生100 個(gè)模擬結(jié)構(gòu)，前10 個(gè)被選為高置信度對(duì)接結(jié)果。將高置信度對(duì)接結(jié)果數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，絕對(duì)值高于總體中位數(shù)的數(shù)量稱為可結(jié)合核心數(shù)；對(duì)接分?jǐn)?shù)絕對(duì)值最高者稱為最優(yōu)核心結(jié)合力。將上述兩種數(shù)據(jù)利用RStudio制作出氣泡圖。

1.6.2 HTNV Gn 15肽與MHC-Ⅱ類分子模擬對(duì)接使用EpiDOCK(http://www.ddg-pharmfac.net/epidock/EpiDockPage.html)[22]工具對(duì)具有高親和力、強(qiáng)免疫原性和種間種內(nèi)保守性的人鼠共同的15肽優(yōu)勢(shì)表位與MHC-Ⅱ類分子進(jìn)行模擬對(duì)接。15肽表位被作為7個(gè)9肽核心進(jìn)行分子模擬對(duì)接，將得到的預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)減去閾值即為對(duì)接分?jǐn)?shù)，對(duì)接分?jǐn)?shù)＞0則認(rèn)為是真正的結(jié)合物。每種情況的結(jié)合分?jǐn)?shù)最大值稱為最優(yōu)核心結(jié)合力，絕對(duì)值高于總體中位數(shù)的數(shù)量稱為可結(jié)合核心數(shù)。將上述兩種數(shù)據(jù)利用RStudio制作出氣泡圖。

1.7 質(zhì)粒疫苗和滅活疫苗 二價(jià)HFRS 滅活疫苗(HANPUWEI?)由中國長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司生產(chǎn)。該疫苗由倉鼠腎細(xì)胞中滅活和純化的HTNV 和SEOV 制成(中國無單價(jià)HFRS 疫苗)。質(zhì)粒pVAX-Gn疫苗為本課題組在先前的研究中合成[23-24]。

1.8 動(dòng)物分組及免疫 20只無特定病原體的近交系8 周齡雌性BALB/c 小鼠購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。BALB/c小鼠位于MHC單倍型H2-d內(nèi)。將小鼠隨機(jī)分為滅活疫苗組(n=10)與pVAX-Gn 疫苗組(n=10)。滅活疫苗組小鼠接種50 μl 1：5 稀釋的二價(jià)滅活疫苗(長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司，參照說明書確定免疫劑量)，pVAX-Gn 疫苗組小鼠注射50 μl 質(zhì)粒pVAX-Gn 疫苗，均為每3 周注射1 次，共注射2 次。第1 次免疫后5 周通過吸入CO2處死小鼠，采用ELISpot實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞免疫反應(yīng)性。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)在無病原體、安靜的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，用標(biāo)準(zhǔn)飼料和過濾水喂養(yǎng)，每周更換墊料，小鼠均正常進(jìn)食、飲水，確保10 h以上的連續(xù)夜間時(shí)間以維持晝夜節(jié)律。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)獲空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)審批(2021-1201)，實(shí)驗(yàn)過程符合國家及單位有關(guān)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定。

1.9 ELISpot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證表位的細(xì)胞免疫反應(yīng)性 由于其生產(chǎn)中固有的困難，僅對(duì)HTNV Gn上所預(yù)測(cè)出的5 個(gè)15 肽表位進(jìn)行合成(ChinaPeptides，中國上海)，用20 μg/ml 的PBS 稀釋單個(gè)肽用于γ 干擾素(INF-γ)ELISpot 分析，4 ℃條件下在包被有IFN-γ 特異性捕獲抗體的ELISpot板上過夜。通過吸入CO2處死小鼠并解剖脾臟組織，研磨制成(0.1～2.0)×106個(gè)/ml 濃度的單細(xì)胞懸液。紅細(xì)胞裂解后，沖洗脾細(xì)胞并重新懸浮。在室溫下用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基封閉ELISpot板2 h后，將1×106個(gè)脾細(xì)胞添加至每個(gè)孔中，用終濃度為5 μg/ml 的合成Gn 肽刺激脾細(xì)胞，并將平板在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，其中，陰性對(duì)照為完整的培養(yǎng)基，陽性對(duì)照為10 μg/ml 的刀豆蛋白A(Con A)。孵育后，將培養(yǎng)板用去離子水和PBST(含0.05% Tween-20的PBS)分別洗2～3 次，孔內(nèi)加入100 μl 終濃度為2 μg/ml 生物素化抗IFN-γ抗體，室溫孵育2 h。用PBST洗滌后加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶(streptavidin-HRP)室溫孵育1 h。PBST 洗4 次后加入AEC(DAKEWEI，China)底物顯色，并用去離子水洗滌終止反應(yīng)。待96孔板風(fēng)干后用CTL ELISpot讀取器(美國CTL公司)對(duì)板中的斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。所有結(jié)果均顯示為每106個(gè)脾細(xì)胞的斑點(diǎn)形成單位(SFU)平均值。采用GraphPad Prism 9繪制條形圖。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 9 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究中僅ELISpot 實(shí)驗(yàn)涉及到統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，各組數(shù)據(jù)均以±s 表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HTNV Gn上小鼠H-2和人HLA-Ⅰ、Ⅱ類限制性表位的親和力、免疫原性及保守性分析 表1 列出了預(yù)測(cè)工具SMMPMBEC、IEDB、NetMHCⅡpan3.2、NetMHCpan4.1、SYFPEITHI、Rankpep 預(yù)測(cè)的Gn 優(yōu)勢(shì)表位數(shù)目。重新計(jì)算排除重復(fù)9 肽和15 肽后，在H-2亞型中獲得了61個(gè)優(yōu)勢(shì)表位，在HLA-Ⅰ亞型中得到234個(gè)優(yōu)勢(shì)表位，HLA-Ⅱ亞型中得到212個(gè)優(yōu)勢(shì)表位。在H-2 亞型中，H-2-Kb 優(yōu)勢(shì)表位數(shù)目最多，有12 個(gè)9 肽。在HLA-Ⅰ類亞型中，HLA-B7 優(yōu)勢(shì)表位數(shù)目最多，有27 個(gè)9 肽。在同等條件下，免疫原性強(qiáng)的表位更有可能充分誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。表1 列出了小鼠和人對(duì)Gn的強(qiáng)免疫原性表位數(shù)目。排除重復(fù)的表位后，在H-2 亞型中獲得了23 個(gè)強(qiáng)免疫原性優(yōu)勢(shì)表位，在HLA-Ⅰ亞型中獲得了110 個(gè)強(qiáng)免疫原性優(yōu)勢(shì)表位，HLA-Ⅱ亞型中獲得了42個(gè)強(qiáng)免疫原性優(yōu)勢(shì)表位。

表1 小鼠H-2 和人HLA 分子對(duì)Gn 表位的親和力、免疫原性和保守性分析結(jié)果Tab.1 Analysis results of affinity, immunogenicity and conservation of mouse H-2 and human HLA molecules to Gn epitopes

采用Blastp工具預(yù)測(cè)上述高親和力、強(qiáng)免疫原性9肽和15肽優(yōu)勢(shì)表位的種間種內(nèi)保守性，結(jié)果如表1所示。篩選獲得MHC-Ⅰ類限制性表位6 個(gè)，MHC-Ⅱ類表位81 個(gè)。其中，上述MHC-Ⅰ、Ⅱ類限制性表位中存在3個(gè)交叉表位。

各個(gè)基因型篩選出來的高親和力、強(qiáng)免疫原性優(yōu)勢(shì)表位比對(duì)結(jié)果顯示，DRB1基因型與各個(gè)基因型的高親和力、強(qiáng)免疫原性表位均有重疊，與H2-A、H2-E基因型的重疊數(shù)目最多(圖1)，而H2-Ld、DPB1等基因型與其他基因型重疊表位較少。

圖1 HTNV Gn上各MHC超家族高親和力、強(qiáng)免疫原性表位的交叉反應(yīng)性Fig.1 Cross-reactivity of MHC superfamilies with high affinity and strong immunogenicity on HTNV Gn

2.2 HTNV Gn 9 肽、15 肽表位與MHC-Ⅰ、Ⅱ類分子的雙向?qū)哟尉垲惤沂究缁蛐烷g交叉免疫反應(yīng)性

2.2.1 HTNV Gn 9 肽與MHC-Ⅰ類分子的相互作用關(guān)系 如圖2所示，57個(gè)MHC-Ⅰ Gn類分子被分為3組：HLA-Ⅰ亞型組、交叉反應(yīng)組(HLA 主要)及交叉反應(yīng)組(H2 主要)。在HLA-Ⅰ亞型組中，HLA-A3201與HLA-B58(-B5701、-B5801)得分相似，表明HLAA3201 基因型在提呈HTNV Gn 抗原過程中表現(xiàn)出HLA-B58 樣特征；HLA-A2601 與HLA-A3401 歸屬于同一類別，兩個(gè)基因型得分相似；HLA-B4601 與HLA-B15(-1502，-1513，-1521)得分相似，表明HLAB4601 基因型在提呈HTNV Gn 抗原過程中表現(xiàn)出HLA-B15 樣特征；HLA-A6801、HLA-A3301、HLAA0301、HLA-A1101 得分相似，歸屬于同一類別；HLA-B0801、HLA-B1405、HLA-B3903 得分歸屬于同一類；HLA-B5301 與HLA-B3501、HLA-B3508歸屬于同一類別。對(duì)于交叉反應(yīng)組(H2 主要)，H2-Ld 得分與HLA-B0702相似，歸屬于同一類；H2-Db、H2-Dd和H2-Kb得分體現(xiàn)出在鼠種內(nèi)提呈HTNV Gn的相似性。在交叉反應(yīng)組(HLA 主要)中，H2-Kd 得分與HLA-A24(-A2301、-A2402、-A2407)相似，表明MHC在提呈9肽表位上的跨基因型相似性。

2.2.2 HTNV Gn 15 肽與MHC-Ⅱ類分子的相互作用關(guān)系 圖3顯示了不同MHC-Ⅱ亞型間的差異。51個(gè)MHC-Ⅱ類分子被分為3組：HLA-Ⅱ亞型組、交叉反應(yīng)組(HLA主要)及交叉反應(yīng)組(H2主要)。在HLA-Ⅱ亞型組中， DRB1(-0407、 -0412、 -0803、 -1402、-1409、-0304、-0301、-0101、-0202、-1202、-1401、-1408、 -1104、 -1301、 -1304) 和 HLA-DQA10101-DQB10501、 HLA-DPA10103(-DPB10101、 -DPB10201、-DPB10401、-DPB10402)歸屬于同一類別，上述基因型得分相似；DRB1(-1302、-1201、-1501)和HLADQA10501-DQB10201、 HLA-DQA10301-DQB10301、HLA-DQA10401-DQB10402、HLA-DQA10501-DQB10301 基因型相近，表明其在提呈HTNV Gn 抗原過程中表現(xiàn)出相同的特征；DRB1(-0704、-1602、-0701、-0101、-0901、-0401、-0405、-0802)和HLADPA10103-DPB11401 歸屬于同一類別，基因型得分相似。對(duì)于交叉反應(yīng)組(H2 主要)，H2-IAd 得分與HLA-DQA10102-DQB10602相似，歸屬于同一類，具有相似的抗原呈遞結(jié)果。在交叉反應(yīng)組(HLA 主要)中，H2-IEK與DRB0101基因型得分相似。

2.3 MHC分子與表位的模擬分子對(duì)接驗(yàn)證親和力

2.3.1 HTNV Gn 9 肽表位與MHC-Ⅰ類分子對(duì)接圖4A 所示為每個(gè)肽-MHC 對(duì)接后的可結(jié)合核心數(shù)及最優(yōu)核心結(jié)合力的氣泡圖，3個(gè)9肽優(yōu)勢(shì)表位均與多個(gè)MHC 分子對(duì)接較好。表位RYKSRCYIF 與HLAB5801、HLA-A0206、HLA-B5301 等基因型對(duì)接的最優(yōu)核心結(jié)合力較為良好，表明該表位與上述基因型分子結(jié)合的牢固程度更高，同時(shí)，該表位與HLAB5801、HLA-A0206、HLA-B5301、HLA-B0801 等基因型分子對(duì)接可結(jié)合核心數(shù)較多，表明其與基因型分子對(duì)接的概率較大； 表位VVYERTYCM、QVVYERTYC與H2-Kb和HLA-B4001基因型對(duì)接情況較弱，表明其與上述基因型分子對(duì)接的概率及對(duì)接牢固程度均較低。此外，HLA-B5801、HLA-A0206、HLA-B5301、HLA-B0801 基因型對(duì)3 個(gè)優(yōu)勢(shì)表位的可結(jié)合核心數(shù)多，表明上述基因型分子對(duì)優(yōu)勢(shì)表位的結(jié)合概率較大?？傮w而言，3 個(gè)優(yōu)勢(shì)表位與人HLA基因型對(duì)接時(shí)的最優(yōu)核心結(jié)合力和可結(jié)合核心數(shù)均優(yōu)于小鼠H-2基因型。如圖4B中b、d所示，分別選取表位RYKSRCYIF 與H2-Kb、QVVYERTYC 與H2-Ld作為對(duì)接優(yōu)良的例子，通過相應(yīng)的對(duì)接模擬結(jié)構(gòu)可以看出，在上述兩個(gè)對(duì)接過程的10種對(duì)接模擬結(jié)構(gòu)中，9 肽均位于MHC 分子抗原結(jié)合槽內(nèi)。選取表位QVVYERTYC 與H2-Kb、表位VVYERTYCM 與H2-Kb作為對(duì)接較差的例子，如圖4B中a、c所示，上述兩種對(duì)接模擬結(jié)果中，多數(shù)9 肽模擬狀態(tài)均位于MHC分子抗原結(jié)合槽外，其中有一個(gè)游離于結(jié)合槽；同樣的情況見于表位VVYERTYCM 與H2-Kb 對(duì)接結(jié)果中。通過比較上述分子對(duì)接模型，從側(cè)面驗(yàn)證了分子模擬對(duì)接存在分子結(jié)構(gòu)上的基礎(chǔ)，與分子對(duì)接結(jié)合可保持一致。

2.3.2 HTNV Gn 15 肽優(yōu)勢(shì)表位與MHC-Ⅱ類分子模擬對(duì)接 如圖5 所示，5 個(gè)MHC-Ⅱ類限制性優(yōu)勢(shì)表位均與多個(gè)MHC基因型分子對(duì)接良好，其中，與表位GGIFNITSSMCLVSK 對(duì)接良好的基因型最多。此外，DPA1*0201/DPB1*0101 基因型與優(yōu)勢(shì)表位對(duì)接結(jié)果均較差。

圖5 HTNV Gn 15肽表位與MHC-Ⅱ類分子對(duì)接分?jǐn)?shù)氣泡圖Fig.5 The bubble map of HTNV Gn 15-mer epitope and MHC-Ⅰ molecule docking

2.4 ELISpot實(shí)驗(yàn)評(píng)估15肽表位與MHC-Ⅱ類分子對(duì)接的細(xì)胞免疫反應(yīng)性 ELISpot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在滅活疫苗組及pVAX-Gn 組中，5 個(gè)表位均可引起脾細(xì)胞分泌IFN-γ(圖6)，提示通過表位篩選促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答確實(shí)行之有效。同時(shí)，兩組的SFU 平均值接近，提示Gn 上的3 個(gè)人鼠共優(yōu)勢(shì)15 肽表位由Gn 和GP全長(zhǎng)所引起的免疫應(yīng)答效果相近。

圖6 5個(gè)15肽表位ELISpot實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.6 ELISpot experiment results of 5 15-mer epitopes

3 討 論

對(duì)于HTNV 的預(yù)防與控制，現(xiàn)有雙價(jià)滅活疫苗已被證實(shí)可誘導(dǎo)抗病毒應(yīng)答，但在中和抗體效價(jià)、細(xì)胞免疫應(yīng)答和長(zhǎng)效免疫記憶方面尚存在不足，同時(shí)在T 細(xì)胞免疫應(yīng)答水平方面也有待提高。本研究以比較免疫學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)原理為基礎(chǔ)，選取可特異性激活抗HTNV 免疫應(yīng)答的Gn 分子為研究對(duì)象，對(duì)9 肽和15 肽表位免疫反應(yīng)性進(jìn)行評(píng)估，最終獲得高親和力、強(qiáng)免疫原性、種間種內(nèi)保守的MHC-Ⅰ類限制性優(yōu)勢(shì)表位6個(gè)，MHC-Ⅱ類限制性優(yōu)勢(shì)表位81個(gè)。使用上述方法可精準(zhǔn)預(yù)測(cè)出HTNV Gn上細(xì)胞免疫反應(yīng)性表位，在短時(shí)間內(nèi)找到具有潛在疫苗作用靶點(diǎn)的抗原表位，極大地節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本。同時(shí)，該方法已用于近年流行的新型冠狀病毒等病毒的研究[25-26]。

人類遺傳因素也可影響對(duì)漢坦病毒的易感性及其所致疾病的嚴(yán)重性[27]。有研究發(fā)現(xiàn)了HTNV 感染患者中HLA基因型的連鎖性，HLA-B*46-DRB1*09和HLA-B*51-DRB1*09 基因型在中國漢族危重HFRS 患者中更常見[28-29]。本研究比較了HLA-Ⅰ類基因型和HLA-Ⅱ類基因型之間HTNV GP 免疫反應(yīng)性表位的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)DRB1基因型與HLA-B15、-B46基因型相同的免疫反應(yīng)性表位較多，提示DRB1-B15、DRB1-B46的化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)相似，具有上述基因的不同地區(qū)、不同種族的人群可能對(duì)漢灘病毒感染具有相近的免疫應(yīng)答反應(yīng)，同一表位引起的效應(yīng)可能相近。同時(shí)，本研究對(duì)小鼠基因型與人類基因型的表位進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，人類DRB1 基因型與小鼠H2-A、H2-E 基因型部分表位更為相近，HLA-A02 基因型與H2-Kd 基因型在提呈HTNV GP 上9 肽表位時(shí)親和力數(shù)據(jù)呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)，提示在不同物種存在對(duì)GP表位相似的反應(yīng)，具有上述基因型的小鼠與人類在漢灘病毒感染及表位免疫刺激后可能產(chǎn)生相近的免疫應(yīng)答反應(yīng)，提示在缺乏人源化轉(zhuǎn)基因小鼠的情況下，使用特定基因型的小鼠可能是實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠杏锰娲颷16,30]。

近年來，隨著生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，工具與算法不斷更新。不同工具和算法的原理大相徑庭，但目的均是對(duì)MHC表位的親和力進(jìn)行模擬分析。本研究將多個(gè)算法進(jìn)行整合運(yùn)用，保證了分析的高準(zhǔn)確率和泛MHC覆蓋率。然而，正因如此，本研究更注重于結(jié)果的獲取，對(duì)其中的算法過程考慮較少，因而衍生出以下問題：(1)不同運(yùn)算過程將賦予表位一些意料之外的特殊內(nèi)涵；(2)多種算法多個(gè)工具同時(shí)使用可造成多重檢驗(yàn)問題；(3)由于多重檢驗(yàn)造成的假陰性、假陽性和過擬合等；(4)生物信息學(xué)算法和數(shù)據(jù)庫的更新及對(duì)表位結(jié)果的影響；(5)調(diào)整工具優(yōu)先級(jí)、參數(shù)設(shè)置以提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率的問題。這些問題背后的含義，將是后續(xù)深入挖掘探索生物信息學(xué)的方向。

綜上所述，本研究預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了HTNV Gn上可激活細(xì)胞免疫反應(yīng)性的表位，證實(shí)在MHC提呈中病毒抗原存在跨基因、種屬、物種的交叉免疫反應(yīng)性。然而，本研究?jī)H在小鼠脾細(xì)胞中進(jìn)行了表位驗(yàn)證，其在人體內(nèi)的免疫反應(yīng)性仍需進(jìn)一步探討。與Dawood[25]、Araújo 等[26]通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)獲得SARSCoV-2 結(jié)構(gòu)蛋白相關(guān)的強(qiáng)免疫原性、種間種內(nèi)保守的候選表位相比，本研究創(chuàng)造性地進(jìn)行種屬交叉分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，提高了抗原優(yōu)勢(shì)表位篩選的系統(tǒng)性和可靠性，為在免疫遺傳學(xué)背景下開發(fā)基于HTNV Gn分子特異性群體免疫保護(hù)性表位疫苗提供了理論基礎(chǔ)。