丁紅霞,景素琴,范佩麗,許 濤,劉少貞,宋 晶*

(1. 南風(fēng)化工集團股份有限公司 技術(shù)中心,山西 運城 044000;2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院,山西 太谷 030801)

消化酶活力是反映動物消化生理機能的一項重要指標(biāo),其活力高低決定動物對營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的能力,決定著動物生長發(fā)育的速度。水產(chǎn)動物的消化酶活力研究已有幾十年歷史,其會受溫度、pH值[1]、鹽度[2]、光照[3]、金屬離子[4]等環(huán)境因子的影響,也會隨著生長期[5]、晝夜節(jié)律[6]、家系[7]、餌料[8]、饑餓狀況[9-10]而變化,目前國內(nèi)外對多種經(jīng)濟甲殼類的主要消化酶活性及各種影響因子進行了詳細的研究[11],關(guān)于不同型消化酶的提取和酶動力學(xué)等方面的研究也越來越受到重視[12]。

鹵蟲(Artemiasalina)隸屬于甲殼綱(Crustacea),鰓足亞綱(Branchiopoda),無甲目(Anostraca),是一種重要的天然餌料,廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)育種、觀賞魚飼料加工、保健品等行業(yè)。其營養(yǎng)價值豐富,干卵和成蟲蛋白質(zhì)含量都超過50%,并富含多種氨基酸、維生素、礦質(zhì)元素、不飽和脂肪酸。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的擴大,苗種行業(yè)的不斷發(fā)展,僅僅依靠從自然界捕撈鹵蟲和蟲卵,遠遠不能滿足市場需求,因此,國內(nèi)外很多機構(gòu)都致力于實現(xiàn)鹵蟲的全人工養(yǎng)殖[13]。要開發(fā)適合于鹵蟲的餌料,就先要了解其消化酶種類和動力學(xué)特征。水產(chǎn)動物生境和食性各異,消化酶的種類和活力可能有很大差異,鹵蟲是混鹽水體中最有代表性的生物餌料,目前尚無此類研究。研究對鹵蟲的各種消化酶均進行了測定,也對各種消化酶的特性進行了探索,旨在為鹵蟲的消化生理研究和集約化養(yǎng)殖飼料的研發(fā)提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和預(yù)處理

實驗所用鹵蟲成體來自南風(fēng)化工集團的鹵蟲養(yǎng)殖基地,于2018-07～08采捕。鹵蟲樣品經(jīng)過停食和換水,保證消化道內(nèi)無食物。鹵蟲成體個體微小,難于解剖提取消化道和消化腺,故進行全蟲測定。將所取樣品加10倍數(shù)體積預(yù)冷重蒸水,在玻璃勻漿器中勻漿,充分研碎后用冷凍離心機(TGL-16GR,上海安亭)以4 000 r/min,離心5 min,取上清液備用以測定消化酶活力。

1.2 消化酶的測定方法

采用福林—酚法測定胃蛋白酶和類胰蛋白酶活力,胃蛋白酶反應(yīng)體系為檸檬酸緩沖液(pH值=3.0),類胰蛋白酶反應(yīng)體系為硼砂-NaOH緩沖液(pH值=9.8)。采用淀粉—碘比色法測定淀粉酶活力,采用比色法測定脂肪酶活力(A054-1,南京建成)。采用3,5-二硝基水楊酸法測定纖維素酶活力。酶液蛋白濃度用考馬斯亮藍法測定(A045-2,南京建成)。所有酶活指標(biāo)測定都采用3個重復(fù),以比活力(全活力與蛋白含量的比值)進行比較。

1.3 不同鹽度、溫度、pH值下鹵蟲各消化酶的測定

對生活于不同鹽度高鹽水體中的鹵蟲,進行消化酶活力測定,池水的鹽度分別為14.0%、16.0%和19.4%。鹽度先用比重計粗測,采水回實驗室后又以光學(xué)鹽度計校準(zhǔn),鹽度變化范圍不超過0.2%。

所測溫度范圍為15～60 ℃,組距為5 ℃。高于室溫的溫度在恒溫水浴鍋中獲得,低于室溫的溫度以水為介質(zhì)在低溫循環(huán)槽(DC-5006,上海慈弦)中獲得,各組溫差均可控制在0.5 ℃以內(nèi)。

所測定的pH值范圍為2.0～12.0,組距為1,依賴5組不同的緩沖對實現(xiàn)[14],各組pH值的變化范圍不超過0.1。具體緩沖對的選用見表1。

表1 不同pH的緩沖系表Tab.1 The list of buffer system to different pH ranges

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用Excel軟件處理并制圖, SPSS18.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA),以新復(fù)極差法(Duncan’s test)檢驗不同鹽度、溫度、pH值下消化酶比活力差異,顯著水平為0.05。

2 研究結(jié)果

2.1 不同鹽度下鹵蟲的各種消化酶活力

結(jié)果表明,鹵蟲體內(nèi)具有多種消化酶,包括胃蛋白酶、類胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶。除了纖維素酶,其余四種消化酶都表現(xiàn)出較高的活力,尤其是類胰蛋白酶。隨著鹽度的升高,各種消化酶的活力出現(xiàn)了不同程度的下降,但大多差異不顯著,只有鹽度19.4%時,脂肪酶活力顯著低于鹽度14.0%和16.0%(見圖1)。

圖1 不同鹽度下鹵蟲的各種消化酶活力Fig.1 The digestive enzyme activities in A. salina at different salinities注:P表示胃蛋白酶(Pepsin);T表示類胰蛋白酶(Tryptase);A表示淀粉酶(Amylase);L表示脂肪酶(Lipase);C表示纖維素酶(Cellulase)。上方的小寫字母表示消化酶活力在不同鹽度下的顯著性,字母相同為處于同一顯著水平。

2.2 不同溫度下鹵蟲的各種消化酶的活力

結(jié)果表明,溫度對鹵蟲消化酶活力有較大影響,不同種類的酶比活力差異較大(見圖2)。類胰蛋白酶在40～60 ℃活力較高,在50 ℃附近達到峰值,胃蛋白酶在35～50 ℃活力較高,在45 ℃附近達到峰值;鹵蟲以類胰蛋白酶為主消化蛋白質(zhì)。淀粉酶和脂肪酶在溫度較低時也有明顯活力,其最適作用溫度分別是25 ℃和30 ℃,在50 ℃和45 ℃難以檢出活力。纖維素酶的比活力不高,在30～60 ℃方能檢出活力,45～55 ℃活力較高。

圖2 不同溫度下鹵蟲的各種消化酶活力Fig.2 The digestive enzyme activities in A. salina at different temperatures注:P表示胃蛋白酶(Pepsin);T表示類胰蛋白酶(Tryptase);A表示淀粉酶(Amylase);L表示脂肪酶(Lipase);C表示纖維素酶(Cellulase)。

圖3 不同pH值下鹵蟲的各種消化酶活力Fig.3 The digestive enzyme activities in A.salina at different pH values

2.3 不同pH值下鹵蟲的各消化酶的活力

結(jié)果表明,鹵蟲的消化酶只會作用于特定的pH值區(qū)間。胃蛋白酶是酸性蛋白酶,只在pH值2.0～6.0檢出活力,3.0是其活力峰值,酶活力向兩側(cè)遞減,pH值2.0～4.0區(qū)間均有較高活力。類胰蛋白酶作用的pH值范圍較大,7.0～9.0是其活力最強的作用區(qū)間。淀粉酶和脂肪酶在中性條件下活力最高,酶活力向兩側(cè)遞減。纖維素酶的比活力不高,僅在pH值4.0～8.0能夠檢出,pH值5.0附近活力值最大,但與其他pH值差異不顯著。

3 討論

3.1 鹵蟲體內(nèi)消化酶的種類

水產(chǎn)動物體內(nèi)消化酶的種類和其食性密切相關(guān),多種水產(chǎn)動物在特定發(fā)育階段,尤其是食性變化期,消化酶活力會隨之變動。草食性甲殼動物幼體為適應(yīng)低能量的餌料,通常維持較高消化酶活性,加快食物轉(zhuǎn)化,但其同化作用較低;肉食性甲殼動物幼體消化酶活性通常較低;通過延長高能食物的滯留時間,以最大限度地提高甲殼動物的同化效率[15]。

鹵蟲(A.salina)是典型的被動濾食生物,只能濾食50 μm以下的顆粒,對大小5～16 μm的顆粒有較高的攝食率,在天然環(huán)境中主要以細菌、微藻和有機碎屑等為食,其食物隨地域、季節(jié)等變化,具有很大的隨機性。因其個體微小,難于對消化道和消化腺體進行分離,故以整體勻漿的方法進行測定,結(jié)果表明,鹵蟲體內(nèi)具有多種消化酶,包括胃蛋白酶、類胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶。5種主要消化酶,都表現(xiàn)出一定的活力,這同對蝦蟹類的消化酶種類的研究結(jié)果相似。和其他的甲殼動物一樣,類胰蛋白酶是最主要的消化酶[16-17]。

整體取樣測定發(fā)現(xiàn)纖維素酶活力較低,鹵蟲可能僅具微弱的消化酶活力,也不排除酶活力來自消化道微生物的可能。纖維素酶其實不是一種單一的消化酶,而是一類能夠降解β-1,4-葡萄糖苷鍵酶的總稱,包括各有作用的C1酶、Cx酶和β-葡萄糖苷酶。對于甲殼類體內(nèi)是否含有纖維素酶,不同研究者的測定結(jié)果各異,這可能與測定方法和底物的選擇有關(guān)[18]。雖然大多甲殼類水產(chǎn)動物沒有表現(xiàn)出較高的纖維素酶活力,但對在飼料中添加纖維素酶可促進畜產(chǎn)和魚類生長已得到證實,纖維素酶能夠?qū)⒗w維素分解為葡萄糖參與代謝,也有助于破壞植物源飼料的胞壁結(jié)構(gòu)[19]。

3.2 鹽度對鹵蟲體內(nèi)各種消化酶活力的影響

一些水生生物對鹽度有較強的適應(yīng)能力,這種適應(yīng)又可以分為主動調(diào)節(jié)型和被動適應(yīng)型,鹵蟲就屬于后者[20]。伴隨著化工生產(chǎn)和自然季候變化,鹽湖中的鹽度并不穩(wěn)定,鹵蟲能較好地適應(yīng)混鹽水體中的多種鹽度。之前關(guān)于鹽度對水生生物消化酶活力影響的研究,主要集中于洄游種類、河口種類、潮間帶—灘涂種類和鹽堿性水體種類。

在實驗室進行此類研究,一般需要對實驗動物進行馴化,但是暫養(yǎng)水平的參差不齊、動物的適應(yīng)性較差、馴化時間難以確定等因素會大大影響實驗結(jié)果,目前對哈氏仿對蝦(Parapenaeopsishardwickii)、凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)、日本蟳(Charybdisjaponica)等蝦蟹類[21-23]和以單環(huán)刺螠[24]為代表的螠形動物的相關(guān)研究表明,動物在等滲環(huán)境中,滲透調(diào)節(jié)代謝耗能最少,用于生長及其他生理過程的能量轉(zhuǎn)換效率最高;在非等滲環(huán)境中,要消耗體內(nèi)儲存的能量,來適應(yīng)水體的鹽度變化。鹽水中的豐富離子也會成為動物消化酶活力的激活劑或者抑制劑。鹽度對消化酶活力的影響是一個復(fù)雜的綜合作用。實驗中,并未對鹵蟲進行長期的鹽度馴化,直接選取了自然條件下鹽度較為穩(wěn)定的3種鹽度水體(14.0%、16.0%、19.4%)中的鹵蟲進行酶活力測定。結(jié)果表明,隨著鹽度的升高,各種消化酶的活力出現(xiàn)了下降,但大多差異不顯著,只有鹽度19.4%時,脂肪酶活力顯著低于鹽度14.0%和16.0%。

3.3 溫度對鹵蟲體內(nèi)各種消化酶活力的影響

最適溫度的測定是在實驗規(guī)定的反應(yīng)時間條件下進行的,實際上生物體內(nèi)酶起作用的時間會長得多,所以最適溫度只在特定條件下才有意義,但也在一定程度上反映消化酶的耐熱性,通過由此計算而來的活化能的大小可用來比較不同種酶活力的大小。消化酶是酶的一種,酶促反應(yīng)是溫度的函數(shù)。溫度對消化酶活力的影響主要表現(xiàn)在兩個方面,一方面隨著溫度的升高,酶催化反應(yīng)速度加快,致使單位時間內(nèi)酶活力升高;另一方面當(dāng)溫度低于或超過臨界值時,又會引起消化酶變性和失活,從而導(dǎo)致酶活力降低。實驗表明,溫度對鹵蟲消化酶活力有較大影響,不同種類的酶比活力差異較大。類胰蛋白酶在40～60 ℃活力較高,在50 ℃附近達到峰值,胃蛋白酶在35～50 ℃活力較高,在45 ℃附近達到峰值;鹵蟲以類胰蛋白酶為主消化蛋白質(zhì)。淀粉酶和脂肪酶在溫度較低時也有明顯的活力,其最適作用溫度分別是25 ℃和30 ℃,在50 ℃和45 ℃難以檢出活力。纖維素酶作用范圍窄且比活力不高,在30～60 ℃方能檢出活力,45～55 ℃活力較高。鹵蟲的多種消化酶都具有一定的熱穩(wěn)定性,其一般與酶作用溫度的范圍正相關(guān),其熱穩(wěn)定性依次為類胰蛋白酶>胃蛋白酶>淀粉酶≈脂肪酶>纖維素酶。

3.4 pH值對鹵蟲體內(nèi)各種消化酶活力的影響

在酶促反應(yīng)過程中,當(dāng)介質(zhì)緩沖溶液pH值改變時,反應(yīng)速度會有一個最大值,稱最適pH值。其受多種因素的影響,不同的緩沖體系、金屬離子的參與、各種抑制劑的存在都會影響到最適pH值。最適pH值與生物本身消化道pH值常常不一致,甚至有極大的差別,因為消化酶起作用時的最適pH值不僅取決于酶活性中心的性質(zhì),且與底物和介質(zhì)等有關(guān)[25]。一般來說, 生物消化道內(nèi)的pH值條件能夠極大地滿足其不同種消化酶活力的表現(xiàn)。多數(shù)甲殼動物的前腸液呈弱酸性,除了兩種蛋白酶,大部分消化酶的最適pH值與消化道內(nèi)pH值差異不大[20]。實驗結(jié)果表明,鹵蟲的消化酶只會作用于特定的pH值區(qū)間。胃蛋白酶只在pH值2.0～6.0時檢出活力,pH值3.0是其活力峰值,酶活力向兩側(cè)遞減,pH值在2.0～4.0區(qū)間均有較高活力。類胰蛋白酶作用的pH值范圍較大,7.0～9.0是其活力最強的作用區(qū)間。淀粉酶和脂肪酶在中性條件下活力最高,酶活力向兩側(cè)遞減。纖維素酶的比活力不高,僅在pH值4.0～8.0能夠檢出,pH值5.0附近活力值最大,但與其他pH值差異不顯著。