張娟，李翔宇，竇勇*，原雪峰，周文禮，尚東維

（1.天津農(nóng)學院 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室，天津 300384；2.天津天食水產(chǎn)科技發(fā)展有限公司，天津 300150；3.天津現(xiàn)代天驕農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，天津市生態(tài)綠色飼料重點實驗室，天津 301801；4.天津食品集團有限公司，天津 300074）

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種綠藻門的單細胞微藻，其生活史主要有兩個階段，分別是游動細胞階段和不動細胞階段。游動細胞階段依靠兩條頂生等長的鞭毛進行運動，細胞富含葉綠素，呈綠色；不動細胞階段沒有鞭毛不能運動，細胞內(nèi)合成并積累蝦青素，呈紅色。蝦青素（astaxanthin，ASTA）是一種脂溶性類胡蘿卜素，是迄今為止在自然界有機體中發(fā)現(xiàn)的抗氧化能力最強的物質(zhì)[1]，因其具有清除自由基、提高機體免疫力的作用，目前被用作保健品輔料和食品添加劑[2-4]。此外蝦青素還有良好的著色效果，可以進入生物體并貯存在組織中，中國人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2003 年318 號公告中指定天然蝦青素為水產(chǎn)動物唯一著色劑[5-6]。雨生紅球藻不動孢子內(nèi)蝦青素含量可以占到細胞干重的1.5%～4.0%，且蝦青素均為具有高生物活性的（3S，3'S）異構(gòu)體，目前雨生紅球藻被公認為自然界中生產(chǎn)天然蝦青素的最佳生物。

自然條件下雨生紅球藻合成蝦青素的效率和對底物、能源的利用率都很低，無法支撐蝦青素的工業(yè)化生產(chǎn)，因此調(diào)節(jié)環(huán)境因子進行人工誘導成為提高雨生紅球藻產(chǎn)蝦青素能力的常用方法。光照是微藻生命活動不可缺少的環(huán)境因子，合理調(diào)制光照條件可以促進雨生紅球藻積累蝦青素，同時不產(chǎn)生額外污染，是生產(chǎn)藻源蝦青素經(jīng)濟有效的手段。研究表明，不同光照對雨生紅球藻的誘導效果不同[7]，紅光利于雨生紅球藻生長，而藍光有助于雨生紅球藻積累蝦青素，此外連續(xù)光照較光暗交替更利于蝦青素積累[4]。Ma 等[8]使用150 μmol/（m2·s） 的白光發(fā)光二極管（light-emitting diode，LED）和70 μmol/（m2·s）的藍光LED 對雨生紅球藻進行照射，發(fā)現(xiàn)兩種光照條件下微藻細胞內(nèi)的蝦青素和總脂肪酸含量顯著上升，與色素合成及脂質(zhì)積累相關(guān)的多種基因表達量也明顯上調(diào)。目前的研究多集中于單一光照對雨生紅球藻積累蝦青素的影響，混合光照的作用鮮見報道。本研究探索了藍光混合白光條件下雨生紅球藻光系統(tǒng)Ⅱ（photosystem Ⅱ，PSII）光化學活性和積累色素含量的變化，以期為優(yōu)化光照組合提高藻源蝦青素產(chǎn)量提供一定的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

KOH、甲醇、乙醇、丙酮（均為分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司。

雨生紅球藻（H.pluvialis）來自天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點實驗室藻種室，使用改良Bold 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Bold’s basal medium，BBM）培養(yǎng)，12 h/12 h 明暗交替，溫度（22±1）℃。

1.2 儀器與設(shè)備

血細胞計數(shù)板（718620）：普蘭德（上海）貿(mào)易有限公司；紫外-可見分光光度計（TU-1810）：北京普析通用儀器有限責任公司；浮游植物分類熒光儀（IMAGING-PAM）：德國WALZ 有限公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗設(shè)計

使用培養(yǎng)至對數(shù)生長期的雨生紅球藻進行試驗，各試驗組的初始細胞密度均設(shè)置為5×105個/mL。混合光照處理組為54 μmol/（m2·s） 白光基礎(chǔ)上增加藍光（主波長為455.8 nm，峰值波長為450.3 nm），藍光的光照強度設(shè)置為18、36、54、72 μmol/（m2·s），對照組為54 μmol/（m2·s）白光，各試驗組設(shè)置3 次平行。每天搖晃培養(yǎng)瓶6 次，防止藻細胞出現(xiàn)沉積。

試驗周期為27d，每3d 取樣測定雨生紅球藻細胞密度、葉綠素含量、PSII 光化學活性參數(shù)以及蝦青素含量。

1.3.2 藻細胞密度的測定

采用血細胞計數(shù)板法測定藻細胞密度，試驗每隔3 d 取樣，在光學顯微鏡下每個樣品計數(shù)3 次，取平均值。其中細胞總數(shù)為A，計數(shù)板為80 小格，稀釋倍數(shù)為D。藻細胞密度含量（T，105個/mL）參照下式計算。

1.3.3 葉綠素熒光參數(shù)的測定

使用浮游植物分類熒光儀測定葉綠素熒光參數(shù)，在測定開始前將所得樣品暗處理15 min，直接測得可變熒光（Fv）、最大熒光（Fm）、平行組可變熒光（Fv’）、平行組最大熒光（Fm’）、葉綠素a（Chla），繼而得出有效光能轉(zhuǎn)化效率（Yield）、最大光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）、實際光能轉(zhuǎn)化效率（electron transport rate，ETR）的值[9-12]。

1.3.4 葉綠素含量的測定

參照鄭小惲等[13]的方法，采用分光光度計法，分別測定645 nm 和663 nm 處乙醇提取液的吸光度（A645、A663），每隔3 d 取藻液一次，5 000 r/min 離心10 min，保留沉淀，即藻泥。按1∶50（g/mL）料液比，在藻泥中加入95%乙醇，避光浸提24 h 至藻體發(fā)白，5 000 r/min 離心10 min 后取上清液，測定其A645和A663。依據(jù)下式計算葉綠素含量（C，mg/L）。

1.3.5 雨生紅球藻中蝦青素（astaxanthin，ASTA）含量的測定

參照韋韜等[14]以及李嘉儀等[15]的方法測定蝦青素含量。取5 mL 藻液進行離心，棄上清液，加入5 mL 超純水清洗，重復2 次。然后用5 mL 的5%氫氧化鉀+30%甲醇溶液破壞葉綠素5 min，棄上清液后加5 mL超純水清洗兩次。棄去上清液后在收集到的藻泥中加入2 mL 丙酮，用細胞破碎儀處理10 min，后4 ℃離心15 min（10 000 r/min），保留上清液，測定其A480，重復以上操作，直至藻團呈白色，色素提取完全為止。依據(jù)下式計算蝦青素含量（X，mg/L）。

式中：D 為稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對獲得的試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，利用Duncan’s 多重比較法檢驗平均值的差異顯著性，顯著性水平設(shè)定為P=0.05，用EXCEL 2007 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合光照對雨生紅球藻細胞密度的影響

在白光一定的條件下，混合藍光對雨生紅球藻細胞密度的影響如圖1 所示。

圖1 混合藍光對雨生紅球藻細胞密度的影響Fig.1 Effects of mixed blue light on cell density of Haematococcus pluvialis

如圖1 所示，總體藻細胞密度隨著時間延長，混合藍光試驗組和白光對照組的差距逐漸減小。在第9 天之后，試驗組的藻細胞密度整體呈下降趨勢，表明混合藍光對雨生紅球藻細胞具有逆境脅迫作用。說明藍光對雨生紅球藻細胞密度具有脅迫影響并能抑制雨生紅球藻的生長，且整體來看36 μmol/（m2·s）強度的光照抑制性更強。

2.2 混合光照對雨生紅球藻最大光能轉(zhuǎn)化效率（Fv/Fm）的影響

在熒光測定中，可變熒光（Fv）與最大熒光（Fm）的比值Fv/Fm 為最大光能轉(zhuǎn)化效率，體現(xiàn)了植物PSII 潛在的最大光合能力。Fv/Fm 在植物正常生理狀態(tài)下，變化非常小，幾乎不受物種和生長條件的影響，但在脅迫條件下該參數(shù)會明顯降低[16-17]。植物利用的光能極為有限，當植物吸收的光能超出利用范圍時，會出現(xiàn)光抑制和光破壞現(xiàn)象[18]。為防止該現(xiàn)象損傷植物的光合系統(tǒng)，植物自身形成了保護系統(tǒng)[19]。因此，F(xiàn)v/Fm 是反映微藻生長態(tài)勢的一個關(guān)鍵性指標。圖2 為雨生紅球藻的Fv/Fm 值在27 d 內(nèi)的變化情況。

圖2 雨生紅球藻的最大光能轉(zhuǎn)化效率變化Fig.2 Changes of maximum light energy conversion efficiency of Haematococcus pluvialis

由圖2 可知，增加不同光照強度藍光的處理組的Fv/Fm 參數(shù)整體上都低于白光對照組，這表明蝦青素主要以蝦青素酯的形式存在，所以Kobayashi 等[20]推測蝦青素能清除活性氧分子，從而保護光合器官和光合色素，保護其不被氧自由基傷害[18-19]。就混合光照處理組的Fv/Fm 整體來看，從試驗開始第0 天到第9 天之間呈現(xiàn)下降趨勢，但在第18 天有回升現(xiàn)象，說明雨生紅球藻的PSII 反應中心經(jīng)過一段時間后對白光產(chǎn)生了依賴，且隨時間的延長，雨生紅球藻的保護機制越發(fā)成熟。試驗第27 天，不同光照強度的試驗組與試驗第0 天比較，F(xiàn)v/Fm 分別升高了0.120、0.130、0.010、0.001。結(jié)果說明在固定白光的條件下混合不同強度的藍光處理組對雨生紅球藻加強了保護作用，并且36 μmol/（m2·s）的處理組Fv/Fm 值改變幅度最大。

2.3 混合光照對雨生紅球藻有效光能轉(zhuǎn)化效率的影響

有效光能轉(zhuǎn)換效率可以反映PSII 反應中心在有部分關(guān)閉的情況下實際原初光能捕獲效率，葉片不需經(jīng)過暗適應在光下可直接測得[21]。有效光能轉(zhuǎn)換效率升高說明混合光照的光保護系統(tǒng)存在，能避免氧自由基破壞光合器官和光合色素[22]?；旌瞎庹諏τ晟t球藻光能轉(zhuǎn)化效率的影響如圖3 所示。

圖3 雨生紅球藻的實際光能轉(zhuǎn)化效率變化Fig.3 Changes of actual light energy conversion efficiency of Haematococcus pluvialis

由圖3 可知，在固定白光時，混合不同光照強度藍光試驗組的有效光能轉(zhuǎn)換效率在9、12、21、24、27 d 整體上高于對照組，這表明混合光照強化了雨生紅球藻的實際光和能力。到試驗的第27 天，雨生紅球藻混合藍光光照強度為18、54 μmol/（m2·s）組的Yield 值與第0 天相比分別上升了22%、9%，其他光照強度均呈現(xiàn)下降趨勢，說明18、54 μmol/（m2·s）光照強度的混合藍光對于升高PSII 的實際光合能力更加明顯。

2.4 混合光照對雨生紅球藻的表觀光合電子傳遞效率（ETR）的影響

表觀光合電子傳遞效率又稱非循環(huán)光合電子傳遞效率，是反映植物PSII 反應中心活性與光合電子傳遞效率的重要指標，轉(zhuǎn)折點的大小可以反映植物對光強敏感度的強弱[23-24]。混合光照對雨生紅球藻表觀光合電子傳遞效率的影響變化如圖4 所示。

圖4 雨生紅球藻的表觀光合電子傳遞效率變化Fig.4 ETR changes of Haematococcus pluvialis

由圖4 可知，在白光條件下混合不同藍光處理組的ETR 值在12、21、24、27 d 整體高于對照組，說明混合藍光有利于發(fā)揮雨生紅球藻PSII 反應中心的活性，同時也使光合電子傳遞效率上升。試驗第27 天時，與試驗第0 天相比18 μmol/（m2·s） 和54 μmol/（m2·s）照度組分別升高了21%和5%，說明18 μmol/（m2·s）和54 μmol（/m·2s）光照強度的混合藍光對增高ETR 的作用更加明顯。

2.5 混合光照對雨生紅球藻積累蝦青素的影響

混合不同光照強度藍光對雨生紅球藻積累蝦青素含量的影響見圖5。

由圖5 可知，隨時間的延長，蝦青素含量整體上呈現(xiàn)緩慢上升態(tài)勢，但是試驗第0 天對照組和試驗組之間變化不顯著。在第24 天處理組蝦青素含量大幅增長，且達到最高峰，此時18 μmol/（m2·s）光照強度的藍光處理組的蝦青素含量達最大值，為7.32 mg/L，是對照組的1.27 倍。由圖5 可以看出，混合藍光可明顯促進雨生紅球藻積累蝦青素，盡管峰值在18 μmol/（m2·s）光照強度組，但從不同時間點綜合分析來看54 μmol/（m2·s）光照強度的藍光對蝦青素積累的作用更強。

在白光固定的條件下混合藍光對微藻的生長具有抑制作用，試驗時間內(nèi)，54 μmol/（m2·s）光照強度的藍光組，雨生紅球藻單位細胞內(nèi)蝦青素含量累積的速度整體比其他試驗組高。通過對比不同光照強度藍光下雨生紅球藻積累蝦青素高峰期（24 d）總蝦青素產(chǎn)量的變化，得出結(jié)果為總蝦青素的含量顯著比對照組高。但總蝦青素產(chǎn)量并不能反映單細胞合成蝦青素的能力，在本研究中根據(jù)測得的總蝦青素產(chǎn)量和雨生紅球藻的細胞密度數(shù)值，來計算單位細胞蝦青素的含量[25-26]。

2.6 混合光照對蝦青素和葉綠素比值的影響

利用蝦青素和葉綠素的比值可以了解蝦青素與葉綠素之間的關(guān)系，還可以對經(jīng)過不同光照強度藍光照射的雨生紅球藻中蝦青素含量的變化作進一步的分析?；旌瞎庹諏ξr青素和葉綠素比值的影響如圖6所示。

圖6 混合不同光照強度藍光對蝦青素/葉綠素的影響Fig.6 Effects of blue light with different illumination on astaxanthin/chlorophyll

由圖6 可知，葉綠素的變化沒有規(guī)律，該變化說明在蝦青素的積累過程中無過分消耗葉綠素的現(xiàn)象[27]。圖5 中蝦青素隨培養(yǎng)時間的延長呈上升趨勢，54 μmol/（m2·s）的藍光積累效果最好。但在圖6 中，蝦青素和葉綠素的比值整體呈上升趨勢，蝦青素和葉綠素的比值在前21 d 幾乎無明顯變化。分別從不同時間點單獨分析，在3、6、9、21、24、27 d 時54 μmol/（m2·s）的藍光光照強度在蝦青素積累中最為明顯。其中第24 天試驗組蝦青素和葉綠素的比值達到峰值，綜合可得藍光照強度為54 μmol/（m2·s）時可加強雨生紅球藻積累蝦青素的能力。

3 討論

光是環(huán)境中重要的信號因子，對微藻的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用，光不僅提供光合作用所需要的能量，自身也蘊含光質(zhì)、光強和光周期等信息[28-31]。微藻通過光受體分子感知光照信號，并通過信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)調(diào)控多種生理過程，包括形態(tài)建成、生物節(jié)律、趨光性以及次級代謝產(chǎn)物合成與積累等[32]。

不同種類微藻的生命活動對光強和光質(zhì)具有明顯的選擇性。研究證實，北方婁氏藻（Lauderia borealis）適宜在45～63 μmol/（m2·s）光強下生長[32]，而王祎哲等[33]發(fā)現(xiàn)，54 μmol/（m2·s）的光強最適合纖細裸藻（Euglena gracilis）生長，而藍光與白光對纖細裸藻生長有顯著促進作用（P＜0.05），藍光條件下細胞內(nèi)色素質(zhì)量濃度達到峰值。另有研究指出，藍光條件下蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）不僅生長效果最佳，而且葉綠素b 合成旺盛[31]。而本試驗發(fā)現(xiàn)白光抑制了雨生紅球藻生長，尤其是試驗后期微藻細胞密度顯著降低，而混合藍光后抑制效果更加明顯，說明不同微藻對光質(zhì)的需求有較大差異，這可能是因為不同微藻細胞內(nèi)存在著差異化的光敏色素，這些色素分子具有不同的光質(zhì)和光強偏好所致[32]。

光照條件不僅影響微藻正常的生命活動，而且影響其細胞內(nèi)次級代謝產(chǎn)物合成與積累。已有文獻證實，不同光質(zhì)對雨生紅球藻的誘導效果不同[7]，紅光有利于雨生紅球藻生長，藍光有助于雨生紅球藻積累蝦青素[4]，本研究的結(jié)果印證了這一結(jié)論。Ma 等[8]使用72 μmol/（m2·s）的藍光對雨生紅球藻進行處理，結(jié)果表明，微藻細胞內(nèi)的蝦青素和總脂肪酸含量顯著上升，與色素合成及脂質(zhì)積累相關(guān)的基因psy、crtO、bkt2、lcy、crtR-B、fata 和dgat 表達量明顯上調(diào)。此外光周期也會影響雨生紅球藻積累蝦青素的過程，有研究說明連續(xù)光照較光暗交替更利于蝦青素積累[4]，江紅霞等[34]發(fā)現(xiàn)微藻細胞內(nèi)的蝦青素含量隨光照強度上升而提高，在270 μmol/（m2·s）條件下連續(xù)照射10 d 微藻細胞內(nèi)的蝦青素水平和抗氧化能力最高。

雨生紅球藻的生活史受環(huán)境影響很大，條件適宜時表現(xiàn)為富含葉綠素的營養(yǎng)細胞，環(huán)境惡劣時表現(xiàn)為累積蝦青素的休眠孢子。本研究設(shè)定的光照條件已成為雨生紅球藻的脅迫因子，可以看到微藻細胞內(nèi)的蝦青素/葉綠素大體呈上升趨勢，這與雨生紅球藻應對和適應惡劣環(huán)境直接相關(guān)。

4 結(jié)論

混合藍光處理組的細胞密度隨試驗時間延長呈整體下降趨勢，說明混合藍光對雨生紅球藻生長具有抑制作用，其中36 μmol/（m2·s）混合藍光的光照強度組對雨生紅球藻的抑制作用最為明顯。

其中藍光試驗組的Fv/Fm、Yield 和ETR 參數(shù)普遍高于對照組，說明脅迫狀態(tài)下，雨生紅球藻光合作用的結(jié)構(gòu)和功能都受到了光損害，植物因此產(chǎn)生自我保護機制。但在研究的第27 天，18、36、54、72 μmol/（m2·s）光照強度組的藍光與試驗第0 天相比，F(xiàn)v/Fm 值整體都有所升高，其中36 μmol/（m2·s）光照強度組變化的數(shù)值最大。

研究表明，藍光光照強度為54 μmol/（m2·s）時對于雨生紅球藻積累蝦青素效果整體強于其他組，盡管18 μmol/（m2·s） 到達峰值時的積累量為7.32 mg/L，但整體看來54 μmol/（m2·s）光照強度的藍光是雨生紅球藻中積累蝦青素最適宜的混合光照強度。