陽(yáng)情姚，曾 潔，張衛(wèi)權(quán)，寧 月，李 檬，李湛華，劉 梅，熊晶晶，黃永坤

（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，云南 昆明 650032）

微生物群是特定環(huán)境中所有微生物的集合，在人體不同部位各不相同，研究發(fā)現(xiàn)人體微生物群在代謝、免疫和內(nèi)分泌等系統(tǒng)中發(fā)揮重要作[1-4]。胎盤是母親與胎兒之間重要的紐帶，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)產(chǎn)婦合并妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）時(shí)，胎盤組織中的菌群組成和結(jié)構(gòu)可能會(huì)發(fā)生改變[5-6]，而這種菌群的改變可能會(huì)導(dǎo)致不良的結(jié)果[7-8]。

近年來(lái)，GDM 的發(fā)生率逐漸升高，預(yù)防GDM 的發(fā)生、防治其并發(fā)癥已成為臨床研究的重要任務(wù)。本研究通過(guò)16S rDNA 技術(shù)檢測(cè)和分析足月兒母親的胎盤菌群DNA，探討妊娠期糖尿病與正常足月兒母親之間的胎盤菌群的差異，為研究和防治妊娠期糖尿病提供新思路和參考數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

收集了30 例2018 年2～9 月期間在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科分娩的足月孕婦胎盤組織。嚴(yán)格按照以下入組標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)產(chǎn)婦妊娠期間是否伴有妊娠期糖尿病進(jìn)行分組后得到妊娠期糖尿病組（A 組）4 例（A1～A4）與正常足月兒組（B 組）6例（B1～B6）。

（1）產(chǎn)婦的納入及排除標(biāo)準(zhǔn)[9]：納入標(biāo)準(zhǔn):規(guī)律產(chǎn)檢，年齡為20～45 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有多胎妊娠、慢性高血壓、內(nèi)分泌失調(diào)、鏈球菌感染、胎膜早破、腫瘤和其他嚴(yán)重母體疾??；②伴有吸煙、飲酒、濫用藥物等不良習(xí)慣等。（2）新生兒的納入及排除標(biāo)準(zhǔn)[10]：納入標(biāo)準(zhǔn)：37 周≤胎齡 <42 周。排除標(biāo)準(zhǔn)：①胎齡 <37 周或≥42 周；②伴有出生重度窒息、敗血癥等嚴(yán)重疾病史。

本研究通過(guò)昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[倫理批號(hào)：（2023）倫理L 第38 號(hào)]，所有研究對(duì)象均簽署了知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集由專人收集母嬰的臨床數(shù)據(jù)特征。包括母嬰病史、年齡和孕前BMI、胎齡、出生體重、出生方式、出生時(shí)的身長(zhǎng)及頭圍、新生兒評(píng)分和臍動(dòng)、靜脈PH 及乳酸等實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果等。

1.2.2 胎盤標(biāo)本的采集由專人收集標(biāo)本，胎盤娩出后，將近臍端的羊膜用無(wú)菌剪剪除，另?yè)Q一把無(wú)菌剪剪取下方的絨毛狀胎盤膜約1 cm3，隨后放入無(wú)菌試管中，并立即保存到-80℃冰箱。所有操作在產(chǎn)后/剖宮產(chǎn)術(shù)后1 h 內(nèi)完成，整個(gè)過(guò)程遵循無(wú)菌操作原則。

1.2.3 胎盤組織中細(xì)菌DNA 的提取及測(cè)序見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)菌DNA 的提取及illumina 測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程圖Fig.1 Experimental flow chart of bacterial DNA extraction and illumina sequencing

1.2.4 對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行生物信息學(xué)處理按97%相似度進(jìn)行聚類，得到代表物種的OTU，隨后使用Qiime 軟件進(jìn)行分析，通過(guò)與16S 數(shù)據(jù)庫(kù)（RDP，http://rdp.cme.msu.edu）進(jìn)行比對(duì)、分類后得到OTU 豐度表，分別在門（Phylum）水平選取豐度前十五、屬（Genus）水平選取豐度前二十的物種進(jìn)行統(tǒng)計(jì)繪制菌落結(jié)構(gòu)柱狀圖并根據(jù)豐度表進(jìn)行樣本及組間物種的分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 一般情況

符合納入標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)象基本特征，見(jiàn)表1。2 組間嬰兒性別、分娩方式、臍動(dòng)脈pH 及乳酸、臍靜脈pH 及乳酸、母親年齡、胎齡、出生體重、身長(zhǎng)及頭圍間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；妊娠期糖尿病組（A 組）母親孕前BMI 高于正常足月兒組（B 組），組間母親孕前BMI 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 A 組與B 組母嬰一般情況比較（）Tab.1 Comparison of maternal and infant general conditions between group A and B（）

表1 A 組與B 組母嬰一般情況比較（）Tab.1 Comparison of maternal and infant general conditions between group A and B（）

1為Fisher確切概率法計(jì)算的P值，*P <0.05。

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)結(jié)果

經(jīng)過(guò)16S rDNA 基因高通量測(cè)序，10 個(gè)樣本共得到601 794 條有效序列（Clean Reads），平均有效序列數(shù)為60 179.4 條，其中最大序列數(shù)為64 431 條，最少序列數(shù)為55 961 條。

2.3 胎盤菌群OTU 聚類及物種注釋分析

2.3.1 OTU 聚類分析按97%相似度進(jìn)行聚類，各樣本OUT 數(shù)量柱狀圖，平均每個(gè)樣本含有171.4 個(gè)OTU 數(shù)，2 組OTU 數(shù)量，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖2a。所有樣本共檢測(cè)出783個(gè)OTU，其中妊娠期糖尿病組有427 個(gè)OTU，特有OTU 數(shù)為154 個(gè)，而正常足月兒組有576 個(gè)，特有的OTU 為303 個(gè)，2 組共有OUT 數(shù)量為273 個(gè)，見(jiàn)圖2b。

圖2 OTU 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖（a）和OTU Venn 圖（b）Fig.2 Statistical chart of otu data（a）and OTU Venn chart（b）

2.3.2 物種豐度分析（1）門水平上的物種豐度分析：在門水平上，全樣本豐度明顯占優(yōu)勢(shì)的菌門有Proteobacteria（變形菌門）、Actinobacteria（放線菌門）、Firmicutes（厚壁菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Verrucomicrobia（疣微菌門）、Fusobacteria（梭桿菌門）、Deinococcus-Thermus（異常球菌-棲熱菌門）等，其中變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門的豐度占總樣本豐度的95%以上，見(jiàn)圖3。

圖3 門水平菌落結(jié)構(gòu)柱狀圖Fig.3 Barplot of colony structure at phylum level

（2）屬水平上的物種豐度分析 在屬水平上，全樣本豐度明顯占優(yōu)勢(shì)的菌屬有Arthrobacter（節(jié)細(xì)菌屬）、Pseudomonas（假單胞菌屬）、Bacteroides（多形桿狀菌屬）、Deiftia、Brevundimonas（短波單胞菌屬）、Lactobacillus（乳桿菌屬）、Chryseobacterium、Acinetobacter（不動(dòng)桿菌屬）、Klebsiella（克雷伯氏桿菌屬）、Stenotrophomonas（單胞菌屬）、Sphingobacterium（鞘氨醇桿菌屬）、Escherichia/Shigella（埃希氏菌屬/志賀氏菌屬）等，見(jiàn)圖4。

圖4 屬水平菌落結(jié)構(gòu)柱狀圖Fig.4 Barplot of colony structure at genus level

2.3.3 物種豐度聚類熱圖根據(jù)物種豐度信息，選取豐度前二十的物種，對(duì)樣本和物種進(jìn)行聚類，并繪制成熱圖。2 組間物種組成及豐度相似，每個(gè)物種在各樣本中的豐度如下圖所示，見(jiàn)圖5。

圖5 屬水平物種豐度熱圖Fig.5 Heatmap of species abundance at genus level

橫向聚類表示該物種在各樣本中的豐度相似情況，縱向聚類表示所有物種在不同樣本間表達(dá)的相似情況，距離越近，枝長(zhǎng)越短，說(shuō)明越相似；2 到-2 對(duì)應(yīng)顏色變化表示物種豐度逐漸降低。

2.4 胎盤組織菌群多樣性分析

2.4.1 測(cè)序量的評(píng)估根據(jù)曲線跨度和下降趨勢(shì)可知，每個(gè)樣品中物種的豐富度和均勻度，見(jiàn)圖6；物種積累曲線急劇上升后趨于平緩，說(shuō)明研究中樣本測(cè)序量已經(jīng)能夠反映樣品中絕大多數(shù)的微生物信息，見(jiàn)圖7。

圖6 Rank-abundance 曲線Fig.6 Rank-abundance curves

圖7 物種累積曲線Fig.7 Species accumulation curves

物種的豐富度越高，曲線在橫軸上的跨度越大；曲線下降越平緩，物種分布越均勻。

2.4.2 Alpha 多樣性分析A 組與B 組之間的Alpha 多樣性指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖8。

圖8 組間Alpha 多樣性指數(shù)差異圖Fig.8 Difference diagram of Alpha diversity index between groups

2.4.3 Beta 多樣性分析（1）NMDS 分析A 組與B 組之間胎盤菌群的物種組成有一定差異，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖9。

圖9 Shepard 圖（a）；NMDS 圖（b）Fig.9 Shepard diagram（a）；NMDS diagram（b）

R^2 越大越好/2 個(gè)R^2 值越一致越好；Stress <0.2 說(shuō)明有一定可靠性。

（2）PCoA 分析 A 組與B 組之間胎盤菌群的物種組成有差異，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖10。

圖10 主坐標(biāo)分析PCoA 圖Fig.10 Principal Coordinate Analysis Diagram

2.5 組間物種LEfSe 差異分析

組間具有顯著性差異的物種的進(jìn)化情況，見(jiàn)圖11a；具有顯著性差異的物種有Propionibacteriaceae（丙酸桿菌科）、Propionibacterium（丙酸桿菌屬）、Thermales（棲熱菌目）、Thermaceae（棲熱菌科 ）、Thermus（棲熱菌屬）、Collinsella（柯林斯菌屬）、ClostridiumIV（梭狀芽胞桿屬）、Rikenellaceae、Alistipes（另枝菌屬）、Anaerostipes（厭氧棒狀菌屬）（LDA >2），見(jiàn)圖11b。

圖11 物種進(jìn)化樹(shù)圖（a）；組間 LDA 分值分布圖（b）Fig.11 Phylogenetic tree diagram（a）；Distribution chart of LDA scores between groups（b）

3 討論

GDM 是妊娠期最常見(jiàn)的代謝紊亂疾病，近年來(lái)中國(guó)GDM 患病率呈急劇上升趨勢(shì)（8.1%～24.2%）[11]。GDM 的發(fā)生受到產(chǎn)婦體重、年齡、遺傳和環(huán)境等多方面影響[12-13]，Sun 等[14]發(fā)現(xiàn)孕前BMI 是GDM 的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素，本研究同樣發(fā)現(xiàn)伴有GDM 與正常妊娠相比較，母親孕前BMI差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GDM 妊娠與正常妊娠相比，胎盤大小增加，絨毛不成熟和一系列血管病變[15]，還可能導(dǎo)致胎盤菌群發(fā)生改變[5]，給母體、胎兒及后代帶來(lái)嚴(yán)重的短期和長(zhǎng)期健康危害[16-18]，然而母親的GDM 狀態(tài)如何影響胎盤微生物群的相關(guān)機(jī)制尚不清楚，可能通過(guò)炎癥和氧化應(yīng)激與GDM 誘導(dǎo)的高血糖狀態(tài)相互作用，或通過(guò)口腔-胎盤途徑影響胎盤菌群[5]。目前飲食+身體活動(dòng)干預(yù)是預(yù)防GDM 的主要方法[19]，也有許多針對(duì)GDM 的藥物治療，但越來(lái)越多的證據(jù)表明，孕期使用二甲雙胍這類降糖藥物可能對(duì)胎兒生后產(chǎn)生長(zhǎng)期的不良后果[20-21]。近年來(lái)，益生菌作為一種新的干預(yù)措施，在預(yù)防妊娠期糖尿病上嶄露頭角[22-24]，它能使胰島素抵抗（HOMA-IR）和HOMAB 標(biāo)記物減少并促進(jìn)胰島素的分泌[25]，影響GDM 孕婦的葡萄糖代謝和體重增加[26]，通過(guò)調(diào)節(jié)孕期的微生物組成從而改善產(chǎn)婦健康和妊娠結(jié)局[27]。雖然目前大量研究表明服用益生菌對(duì)GDM 有一定預(yù)防作用，但仍有研究指出益生菌的應(yīng)用會(huì)增加先兆子癇的風(fēng)險(xiǎn)[28]。因而，目前仍然需要個(gè)更多的研究來(lái)揭示在GDM 中起關(guān)鍵作用的菌群、載量及其在誘導(dǎo)疾病中的作用機(jī)制，以及需要更高質(zhì)量、大規(guī)模的臨床試驗(yàn)來(lái)評(píng)估益生菌的最佳劑量和理想細(xì)菌組成，從而促進(jìn)孕期母嬰的健康。

本研究檢測(cè)的胎盤組織中的微生物群主要由變形菌門、放線菌門、厚壁菌門、擬桿菌門等菌門組成，其中變形菌門的相對(duì)豐度最高，這與Zheng 等[29]、Bassols 等[30]研究結(jié)果一致。屬水平上以節(jié)細(xì)菌屬、假單胞菌屬、多形桿狀菌屬、Deiftia、短波單胞菌屬、乳桿菌屬、Chryseobacterium、不動(dòng)桿菌屬、克雷伯氏桿菌屬、單胞菌屬、鞘氨醇桿菌屬、埃希氏菌屬/志賀氏菌屬等菌屬為主的菌群，Zakis 等[31]、Tang 等[6]及本課題前期研究[10]發(fā)現(xiàn)的菌屬大致相同。

本研究2 組菌群的物種豐度在門、綱水平上無(wú)顯著差異，而在目至屬水平上，發(fā)現(xiàn)棲熱菌目、丙酸桿菌科、棲熱菌科、Rikenellaceae、丙酸桿菌屬、棲熱菌屬、柯林斯菌屬、梭狀芽胞桿屬IV、另枝菌屬、厭氧菌屬的豐度在妊娠期糖尿病組中較正常足月兒組顯著升高，暫未發(fā)現(xiàn)有顯著豐度降低的菌類。Bassols[30]等發(fā)現(xiàn)GDM 婦女的胎盤微生物群中假單胞菌目和不動(dòng)桿菌屬的相對(duì)豐度較低，另一研究[7]發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌屬，Duncaniella，及瘤胃球菌屬在GDM 中顯著升高，Tang 等[6]發(fā)現(xiàn)GDM 婦女的胎盤菌群多樣性增加，其中Anaerotruncus 瘤胃球菌屬、糞球菌屬、副普雷沃菌屬及乳酸桿菌屬的豐度在GDM 中升高，然而韋榮氏菌屬豐度降低。綜上，多個(gè)學(xué)者證實(shí)GDM 婦女的胎盤菌群與正常婦女對(duì)比存在差異，但具體顯著性差異的菌類各不相同，一方面可能樣本量相對(duì)較小，也有可能是胎盤菌群本身的個(gè)體差異。

本研究通過(guò)Illumina MiSeq 測(cè)序系統(tǒng)對(duì)胎盤組織的菌群DNA 進(jìn)行檢測(cè)和分析，嚴(yán)格執(zhí)行無(wú)菌操作，從胎盤組織中成功分離和鑒定了微生物序列，證明了胎盤組織中存在著一定量的細(xì)菌群落DNA，而胎盤菌群的組成、豐度在妊娠期糖尿病與正常足月兒中有顯著性差異，而這些顯著性差異的菌類可能是妊娠期糖尿病的潛在致病菌并長(zhǎng)期影響母嬰的健康。本研究也為全面、準(zhǔn)確地獲得胎盤菌群的信息做出了貢獻(xiàn)，為妊娠期糖尿病婦女的胎盤宏基因組研究奠定了重要的理論基礎(chǔ)。