基于HPLC-Q-TOF-MS技術(shù)分析益氣生津袋泡茶的化學(xué)成分及入血成分

王宏蕾 肖 薇 吳劍坤

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100010

益氣生津袋泡茶由西洋參、生黃芪、麥冬、石斛等 十味中藥組成，為一種茶散劑[1]，具有益氣養(yǎng)陰、生津止渴，潤(rùn)肺清胃，滋腎寧心的功效，為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，由王為蘭、夏軍及毛克臣三位中醫(yī)藥專(zhuān)家在糖尿病氣陰虧虛的中醫(yī)病機(jī)研究基礎(chǔ)上研制而成，臨床應(yīng)用30 余年。研究證實(shí)，其在改善糖代謝及治療干燥綜合征等方面取得了較好的效果[2-5]。但是目前尚未開(kāi)展其化學(xué)成分相關(guān)研究，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)仍不明確。分析入血成分可快速、準(zhǔn)確地解析中藥藥效物質(zhì)，也是中藥質(zhì)量標(biāo)志物篩選的重要依據(jù)，是快速確定中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)的有效途徑之一[6-8]?；诖?，鑒定益氣生津袋泡茶的化學(xué)成分及入血成分成為重中之重。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)以其快捷、高靈敏度、高分辨率等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于中藥原型成分與代謝產(chǎn)物的鑒別[9-11]。因此，本研究采用HPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)對(duì)益氣生津袋泡茶的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，并在此基礎(chǔ)上對(duì)其入血成分進(jìn)行分析表征，以期為益氣生津袋泡茶的質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Agilent 1200 型高效液相色譜柱儀（美國(guó)Agilent公司）；TripleTOF 5 600 四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（美國(guó)AB Sciex 公司）；BT25S 型電子分析天平（精度0.01 mg，德國(guó)Sartorius 公司）；BSA6202S 電子分析天平（精度0.01 g，Sartorius 公司）；1-15PK 型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）；CM-12 型水浴氮吹儀（北京成萌偉業(yè)科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

益氣生津袋泡茶為首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院自制；毛蕊異黃酮葡萄糖苷（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：140326）；人參皂苷Re（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：P27N6F6512）；甜菜堿、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110894-201604、110704-201223、110703-201128）；哈巴俄苷、哈巴苷、毛蘭素（南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：D22052910、D22062177、D21080111）。色譜級(jí)甲酸、甲醇和乙腈（美國(guó)Fisher 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 周齡SPF 級(jí)SD 雄性大鼠6 只，體重280～300 g，購(gòu)于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK（京）2019-0010，質(zhì)量合格證號(hào)為：No.110324221103743637。本研究涉及的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方案已得到北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（BUCM-4-2022061502-2062）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 益氣生津袋泡茶水提物制備稱(chēng)取益氣生津袋泡茶內(nèi)容物100.13 g，加8 倍量去離子水，回流提取2次，每次30 min，紗布濾過(guò)，合并兩次提取液，50℃水浴蒸至稠膏狀，轉(zhuǎn)移至50 ml 量瓶中，離子水定容，得生藥濃度為2 g/ml 的水提物稠膏，-20℃保存。分析前，取稠膏適量，稀釋40 倍，0.22 μm 濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2 灌胃液制備取“2.1.1”項(xiàng)制備的水提物稠膏適量，用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液制成生藥質(zhì)量濃度為1 g/ml 的混懸液，4℃儲(chǔ)存，作為灌胃液備用。

2.1.3 混合對(duì)照品溶液制備 分別精密稱(chēng)取9.78 mg 毛蕊異黃酮葡萄糖苷、8.93 mg 甜菜堿、9.34 mg 人參皂苷Rb1、10.02 mg 人參皂苷Rg1、9.53 mg 人參皂苷Re、9.64 mg 哈巴俄苷、9.71 mg 哈巴苷、11.33 mg 毛蘭素，加甲醇超聲溶解并稀釋?zhuān)瞥蓾舛燃s為10 μg/ml 的混合對(duì)照品溶液。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

采用隨機(jī)數(shù)字表法將6 只大鼠分為給藥組與空白組，每組3 只。給藥組灌胃4 ml 益氣生津袋泡茶灌胃液，空白組灌胃4 ml 生理鹽水，2 次/d，連續(xù)給藥，第4 天上午給藥2 h 后麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈采血并置于4℃以備后續(xù)處理分析。

2.3 血漿樣品處理

血漿樣品分裝于離心管中，4℃，3 500 r/min 離心15 min（離心半徑為10 cm，下同），取上清液，加入等體積乙腈沉淀蛋白，渦旋混勻2 min，4℃10 000 r/min離心10 min，吸取上清液用氮吹儀吹干，加50%甲醇200 μl 復(fù)溶，4℃，10 000 r/min 離心10 min，取上清液上樣分析。

2.4 色譜條件與質(zhì)譜條件

2.4.1 色譜條件WatersXselectHSST3C18色譜柱（50mm×2.1 mm，2.5 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～3 min，15%B；3～6 min，15%B →35%B；6～17 min，35%B→65%B；17～18 min，65%B→95%B；18～22 min，95%B；22～23 min，95%B→15%B；23～27 min，15%B。柱溫40℃，流速0.3 ml/min，進(jìn)樣體積3 μl。

2.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源；分別采用正、負(fù)離子模式檢測(cè)；質(zhì)量掃描范圍為m/z 100～1 300；噴霧電壓4 500 V；離子化溫度500℃；碰撞能量35 eV；氣簾氣30 psi；噴霧氣和輔助加熱氣分別為40、50 psi；去簇電壓100 V。

2.5 益氣生津袋泡茶提取物中化學(xué)成分鑒定

采用Analyst 1.7 軟件進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集與分析，對(duì)照品溶液與水提物的總離子流圖見(jiàn)圖1。通過(guò)質(zhì)譜裂解碎片分析、對(duì)照品確認(rèn)及相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，共鑒定出17 種化學(xué)成分，包括1 個(gè)生物堿類(lèi)成分、1 個(gè)黃酮苷類(lèi)成分、1 個(gè)甾體皂苷元、2 個(gè)環(huán)烯醚萜苷類(lèi)成分與12 個(gè)人參皂苷類(lèi)成分。鑒定出的化學(xué)成分的詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 益氣生津袋泡茶中成分的鑒定結(jié)果

圖1 總離子流圖

化合物鑒定時(shí)，其中8 個(gè)化合物經(jīng)對(duì)照品比對(duì)后確認(rèn)，剩余9 個(gè)化合物通過(guò)與文獻(xiàn)報(bào)道的質(zhì)量數(shù)與二級(jí)譜數(shù)據(jù)對(duì)比后鑒定。以化合物4 的鑒定過(guò)程為例進(jìn)行詳細(xì)的說(shuō)明。化合物4 在負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z 為783.488 5[M-H]-，元素組成分析，推測(cè)該化合物的分子式為C42H72O13（-0.5 ppm）；其特征離子峰為連續(xù)脫去兩分子葡萄糖生成m/z=621[M-H-Glu]-和459[M-H-2Glu]-，以及苷元上C-20 位脫掉側(cè)鏈后的碎片離子m/z=375[M-H-2Glu-C6H12]-，與人參二醇型皂苷[14]的裂解規(guī)律一致，且二級(jí)譜數(shù)與人參皂苷F2一致[12]，因此推測(cè)該化合物為人參皂苷F2。

2.6 益氣生津袋泡茶入血成分鑒定

給藥組大鼠的血清樣品中共鑒定出8 個(gè)原型吸收入血的成分，分別為甜菜堿、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、哈巴俄苷、擬人參皂苷F11、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、毛蘭素，其中5 個(gè)人參皂苷類(lèi)成分均來(lái)源于西洋參。

3 討論

益氣生津袋泡茶臨床用量為10～30 g 生藥/d，基于人體平均重量60 kg 及人與大鼠劑量換算（系數(shù)6.3），280 g 大鼠給藥劑量應(yīng)為1.5～4.5 g 生藥/d。而本研究中給藥劑量為8 g/d，約為臨床給藥劑量的2倍，是考慮到體內(nèi)血中成分的含量往往很低，目前的技術(shù)存在檢測(cè)困難的問(wèn)題。因此，在保證給藥劑量安全的情況下，通過(guò)提高給藥濃度及3 d 多次給藥的方式，增加血中成分的濃度，以滿足檢測(cè)的要求。此外，由于中藥復(fù)方中化學(xué)成分復(fù)雜，常包含多種類(lèi)型的化學(xué)成分，而有些化學(xué)成分在正、負(fù)離子模式下的響應(yīng)差異較大[15-17]，同時(shí)，復(fù)方中各化學(xué)成分的含量存在顯著差異[18-20]。因此，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)方中化學(xué)成分進(jìn)行較全面的表征，本研究分別采用正、負(fù)離子模式采集，對(duì)益氣生津袋泡茶的主要化學(xué)成分進(jìn)行定性識(shí)別。

目前研究表明，西洋參總皂苷[21-22]及多種人參皂苷單體如人參皂苷Re、Rg1、Rb1、Rg2 等能通過(guò)改善胰島素抵抗，增強(qiáng)葡萄糖攝取，抑制葡萄糖輸出，抑制肝臟糖異生及緩解糖脂代謝等途徑來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體的糖代謝[23-25]。而本研究發(fā)現(xiàn)，益氣生津袋泡茶中含有豐富的人參皂苷類(lèi)成分，且多種皂苷被發(fā)現(xiàn)均能以原型方式入血（如人參皂苷Rb1、Re）。推測(cè)這些成分可能是益氣生津袋泡茶改善糖代謝功效的物質(zhì)基礎(chǔ)。綜上，本研究基于HPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)對(duì)益氣生津袋泡茶中的主要活性成分進(jìn)行快速識(shí)別，為明確其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供了一定的科學(xué)依據(jù)，也為該藥的質(zhì)量控制、劑型改進(jìn)及進(jìn)一步臨床研究奠定了理論基礎(chǔ)。