SDH、NADH-TR染色在先天性巨結(jié)腸中的應(yīng)用及臨床意義

王凌燕,張麗麗,任會(huì)強(qiáng),白玉坤,張 萌,安會(huì)波

先天性巨結(jié)腸(hirschsprung’s disease, HD)為小兒外科常見的消化道畸形,發(fā)病率為新生兒的1/5 000,是由于腸神經(jīng)系統(tǒng)胚胎期發(fā)育障礙引起的遠(yuǎn)端腸管黏膜下及肌層無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞[1]。目前,其發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。病理診斷方法包括HE染色、酶組織化學(xué)染色、免疫組化染色等,但各染色方法均存在不足,研究新的染色方法對(duì)HD病理診斷具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用SDH、NADH-TR染色,同時(shí)結(jié)合HE和免疫組化S-100、Calretinin染色對(duì)HD進(jìn)行病理診斷,并探討其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年9月～2022年11月臨床診斷為HD的術(shù)中冷凍組織69例及對(duì)應(yīng)手術(shù)切除腸管標(biāo)本69例(其中手術(shù)切除腸管標(biāo)本中38例為新鮮標(biāo)本,先部分取材用于SDH、NADH-TR染色,再將剩余標(biāo)本固定;余31例腸管標(biāo)本術(shù)后直接固定)?；純耗挲g2個(gè)月～4歲,中位年齡6個(gè)月,男童54例,女童15例。所有切片均經(jīng)兩位高年資病理醫(yī)師復(fù)核。

1.2 試劑與方法(1)收集HD術(shù)后新鮮腸管標(biāo)本38例,分段取材,OCT包埋劑包埋,將盛有異戊烷的小燒杯放入裝有液氮的大保溫杯中,待裝有異戊烷的小燒杯內(nèi)杯底及周壁出現(xiàn)白色糊狀,將組織冰托放入小燒杯中,約20 s取出,用Cryotome PSE型恒冷切片機(jī)(美國(guó)Thermo公司)在-20 ℃下3 μm厚切片,黏附于載玻片上,進(jìn)行SDH、NADH-TR染色,切片置于染色液中37 ℃孵育40 min,蒸餾水沖洗,甘油明膠封固。其中SDH染色液配制方法:0.2 mol/L琥珀酸鈉5 mL+0.2 mol/L磷酸緩沖液5 mL+NBT(氯化硝基四氮唑蘭)10 mg,攪拌至完全溶解;NADH-TR染色液配制方法:Tris-HCl 20 mL(pH 7.4)+NBT(氯化硝基四氮唑蘭)20 mg+NADH CoI還原型16 mg,攪拌至完全溶解。(2)69例冷凍組織和對(duì)應(yīng)手術(shù)切除標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定,分段取材,行HE和免疫組化S-100、Calretinin染色,S-100、Calretinin抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司,免疫組化染色采用EnVision法。

1.3 結(jié)果判讀S-100、Calretinin陽(yáng)性定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核,以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色、黃色時(shí)為陽(yáng)性,Calretinin表達(dá)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,不表達(dá)于無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的神經(jīng)纖維,S-100同時(shí)表達(dá)于神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及神經(jīng)纖維,在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中呈“空泡狀”,在神經(jīng)纖維中均勻著色。當(dāng)神經(jīng)纖維束最大徑≥40 μm時(shí)定義為粗大神經(jīng)纖維。SDH、NADH-TR染色在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈顆粒狀藍(lán)色,細(xì)胞核不著色,神經(jīng)纖維呈均勻藍(lán)色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HD中HE染色本組術(shù)中冷凍組織狹窄段HE染色見粗大神經(jīng)纖維69例,均未見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。術(shù)后切除石蠟標(biāo)本狹窄段見粗大神經(jīng)纖維69例,其中偶見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞2例,冷凍與石蠟組織符合率97.10%。冷凍組織擴(kuò)張段肌間見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞者65例,4例擴(kuò)張段未見明確神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,再次送檢見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。術(shù)后石蠟組織切除標(biāo)本擴(kuò)張段見神經(jīng)節(jié)細(xì)胞69例,其中5例偶見粗大神經(jīng)纖維,冷凍與石蠟組織符合率為92.75%。

2.2 HD中S-100、Calretinin的表達(dá)術(shù)后切除標(biāo)本免疫組化染色顯示,S-100在肌間粗大神經(jīng)纖維中68例呈陽(yáng)性(68/69,98.55%),在肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中67例呈“空泡狀”陽(yáng)性(67/69,97.10%);Calretinin在肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核不均勻陽(yáng)性(67/69,97.10%),在部分肌間粗大神經(jīng)纖維中表現(xiàn)為點(diǎn)灶狀陽(yáng)性(2/69,2.90%)。

2.3 HD中SDH、NADH-TR染色本組收集術(shù)后切除新鮮腸管38例行SDH、NADH-TR染色,SDH染色顯示粗大神經(jīng)纖維呈均勻淡藍(lán)色(37/38,97.37%)(圖1),腸壁肌間(圖2)和黏膜下(圖3)神經(jīng)叢內(nèi)間質(zhì)呈均勻淡藍(lán)色,神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)呈細(xì)顆粒狀深藍(lán)色,細(xì)胞核不著色(36/38,94.74%)。NADH-TR染色中粗大神經(jīng)纖維呈均勻藍(lán)色(36/38,94.74%)(圖4),腸壁肌間(圖5)和黏膜下(圖6)神經(jīng)叢內(nèi)間質(zhì)呈均勻藍(lán)色,神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)呈細(xì)顆粒狀深藍(lán)色,細(xì)胞核不著色(37/38,97.37%),且組織NADH-TR染色較SDH深,不同發(fā)育階段的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)著色面積不同。

2.4 HD中各染色之間的相關(guān)性分析在粗大神經(jīng)纖維染色中,S-100、SDH、NADH-TR染色的陽(yáng)性率分別為98.55%、97.37%、94.74%,各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中,S-100、Calretinin、SDH、NADH-TR染色的陽(yáng)性率分別為97.10%、97.10%、94.74%、97.37%,各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

HD患兒結(jié)腸遠(yuǎn)段黏膜下及肌間神經(jīng)叢中的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如,形成“肥大神經(jīng)叢”結(jié)構(gòu)。研究認(rèn)為其與神經(jīng)嵴干細(xì)胞的遷移、發(fā)育、存活異常有關(guān)[1],也有研究認(rèn)為,腸道神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的不足可以通過(guò)局部神經(jīng)嵴細(xì)胞的增殖和分化來(lái)代償[2]。細(xì)胞增殖所需的能量主要由線粒體內(nèi)有氧呼吸提供。線粒體還參與細(xì)胞分化、細(xì)胞信號(hào)傳遞和細(xì)胞凋亡等過(guò)程,并擁有調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期的能力。因此,觀察線粒體酶的表達(dá)對(duì)研究HD的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如與能量代謝之間的關(guān)系有重要意義。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用SDH、NADH-TR兩種酶組織化學(xué)法進(jìn)行觀察,其中SDH為線粒體三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶,是連接氧化磷酸化與電子傳遞的樞紐之一[3];可作為三羧酸循環(huán)運(yùn)行強(qiáng)度的檢測(cè)指標(biāo)[4]。NADH定位于線粒體中,為有氧代謝電子傳遞鏈中的酶,作為供氫體,可反應(yīng)三羧酸循環(huán)、細(xì)胞色素系統(tǒng)和其他氧化代謝途徑的利用情況[5]。NADH-TR染色使無(wú)色的四唑鹽還原為不溶性的藍(lán)紫色,在線粒體上沉淀下來(lái),使線粒體染成深藍(lán)色,染色的深淺可顯示線粒體內(nèi)NADH脫氫酶含量的多少[6]。此前上述兩項(xiàng)組織化學(xué)染色常用于神經(jīng)肌肉組織活檢診斷中。有研究表明HD狹窄段SDH活性升高[7];國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見NADH-TR在HD組織標(biāo)本中的報(bào)道。

由于嬰幼兒腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)育未成熟,缺乏典型的細(xì)胞形態(tài),且在合并結(jié)腸炎時(shí)淋巴單核細(xì)胞與神經(jīng)節(jié)細(xì)胞不易鑒別,易導(dǎo)致誤診。因此,目前HD術(shù)中冷凍病理診斷多采用HE染色聯(lián)合乙酰膽堿酯酶(AchE)、甲苯胺藍(lán)等酶組織化學(xué)染色法進(jìn)行診斷。HD術(shù)后最終診斷需經(jīng)石蠟包埋切片,采用HE染色與免疫組化染色相結(jié)合,抗體包括NSE、S-100、PGP9.5、Calretinin等。然而,各染色方法并非完美,如HE染色可鑒別神經(jīng)叢內(nèi)有無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,但對(duì)于涉及細(xì)胞分化和功能改變的觀察有限[8]。研究發(fā)現(xiàn)AchE既存在于膽堿能神經(jīng)元,也存在于非膽堿能神經(jīng)元,假陽(yáng)性率較高[9]。甲苯胺藍(lán)染色可顯示神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)尼氏體的數(shù)量,并且觀察尼氏體的數(shù)量和形態(tài)能反應(yīng)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的成熟程度和功能。但其對(duì)粗大神經(jīng)纖維的判斷并無(wú)特異性[10]。S-100蛋白在狹窄段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失區(qū)域可見強(qiáng)陽(yáng)性的增粗神經(jīng)纖維[11],而在HD擴(kuò)張段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞區(qū)域可見“空泡狀”表現(xiàn),本組中68例肌間粗大神經(jīng)纖維呈強(qiáng)陽(yáng)性,67例神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈“空泡狀”陽(yáng)性;但當(dāng)取材深度不夠時(shí),可能見不到S-100陽(yáng)性的粗大神經(jīng)纖維導(dǎo)致漏診。本組中8例擴(kuò)張段冷凍組織中未見粗大神經(jīng)纖維,但術(shù)后切除擴(kuò)張段腸壁組織中見粗大神經(jīng)纖維,且1例粗大神經(jīng)纖維S-100呈陰性。Calretinin在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中陽(yáng)性,而在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺失的神經(jīng)纖維中陰性[12]。近期有學(xué)者提出Calretinin陽(yáng)性神經(jīng)纖維可以延伸至無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段,因此短段型腸無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞癥直腸黏膜活檢Calretinin染色出現(xiàn)陽(yáng)性神經(jīng)纖維時(shí)應(yīng)警惕假陽(yáng)性[13]。本組有2例Calretinin染色見陽(yáng)性神經(jīng)纖維。由此可見,S-100、Calretinin染色也存在一定的假陽(yáng)性與假陰性。因此,一些病理學(xué)家主張HD的術(shù)前診斷應(yīng)在HE染色的同時(shí)必須有其他染色方法共同診斷,以保證診斷的準(zhǔn)確性,但是應(yīng)用酶組織化學(xué)還是免疫組化尚未統(tǒng)一[14]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)臨床及冷凍診斷為HD的新鮮腸管組織,進(jìn)行SDH、NADH-TR酶組織化學(xué)染色,應(yīng)用異戊烷-液氮快速冷凍法冷凍組織,恒溫冷凍切片進(jìn)行染色。異戊烷-液氮快速冷凍的優(yōu)點(diǎn)在于:首先避免了冷凍造成的冰晶、空泡,其次避免了石蠟包埋引起的酶活性失活。此冷凍方法可應(yīng)用于HD術(shù)中冷凍組織中。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SDH、NADH-TR染色均能清晰地顯示神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)形態(tài)和數(shù)量,且對(duì)比鮮明,能較準(zhǔn)確判斷神經(jīng)叢內(nèi)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量和結(jié)構(gòu),對(duì)研究神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的線粒體酶分布情況提供新思路。同時(shí),可以準(zhǔn)確區(qū)分粗大神經(jīng)纖維及不同發(fā)育節(jié)段的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。SDH與NADH-TR染色對(duì)于粗大神經(jīng)纖維及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的染色陽(yáng)性率與S-100、Calretinin相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且染色更清晰,非特異性著色少。

總之,SDH與NADH-TR具有染色方法簡(jiǎn)便、快速、試劑配制簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)條件易于控制等特點(diǎn),適用于術(shù)中快速冷凍切片檢查,為HD的病理診斷提供新的檢測(cè)方法。