周有容，尹一鳴，黃祥良，胡譽(yù)懷，何俏軍

1.浙江大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310058

2.浙江大學(xué)智能創(chuàng)新藥物研究院，浙江 杭州 310018

吉列替尼（Gilteritinib）屬于第二代FLT3新型分子靶向抑制劑，目前已在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)被批準(zhǔn)應(yīng)用于FLT3突變的復(fù)發(fā)性或難治性（藥物難治）急性髓性白血病成人患者的標(biāo)準(zhǔn)化治療［1］。與接受化療的患者比較，接受吉列替尼治療的患者無(wú)進(jìn)展生存期顯著延長(zhǎng)，白細(xì)胞數(shù)全部或部分恢復(fù)正常水平的患者顯著增多，展現(xiàn)出極好的治療效果［2］。然而，臨床研究結(jié)果顯示，約36%的患者在吉列替尼治療期間出現(xiàn)了皮疹［3］，雖多數(shù)患者表現(xiàn)較輕，但仍有部分患者會(huì)發(fā)展為較為嚴(yán)重的急性發(fā)熱性嗜中性皮膚?。⊿weet 綜合征）［4-6］，影響患者的生活質(zhì)量，甚至不得不中止治療，最終導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。目前對(duì)吉列替尼皮膚毒性的治療策略和管理手段十分有限，只能通過(guò)局部或全身應(yīng)用類固醇等手段加以緩解，無(wú)法從根本上解決問(wèn)題。

皮膚主要由表皮、真皮、皮下組織構(gòu)成，皮疹是由于表皮或淺層真皮異常引起的皮膚疾病。由于真皮淺層中富含大量毛細(xì)血管，因此藥物可以通過(guò)毛細(xì)血管轉(zhuǎn)運(yùn)最終直接作用于表皮深層細(xì)胞，而表皮深層細(xì)胞主要為角質(zhì)形成細(xì)胞。角質(zhì)形成細(xì)胞通過(guò)分化、向外遷移至表皮取代表皮脫落的細(xì)胞，同時(shí)也會(huì)分泌各種構(gòu)成細(xì)胞緊密連接的基礎(chǔ)角蛋白，對(duì)于維持表皮的正常生理功能至關(guān)重要［7］。諸多小分子激酶抑制劑可以通過(guò)影響角質(zhì)形成細(xì)胞的命運(yùn)來(lái)誘導(dǎo)皮膚毒性的發(fā)生，例如直接誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)細(xì)胞的過(guò)度分化、遷移和角化不完全等［8-11］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)，多種天然化合物可以通過(guò)調(diào)控氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、免疫失調(diào)和DNA損傷等方式改善受損的皮膚［12-13］。如黃芪、瓜蔞、當(dāng)歸中提取到的活性成分芒柄花素對(duì)炎癥性皮膚病具有保護(hù)作用［14］；丹參酮ⅡA 抑制中波紫外線照射引起的人表皮形成細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯與DNA 損傷基因的轉(zhuǎn)錄以及信號(hào)通路分子磷酸化，減少紫外線輻照造成的人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的損傷［15］；黃芪甲苷可以加速創(chuàng)面組織的恢復(fù)和血管生成，緩解糖尿病導(dǎo)致的皮膚缺損［16］；甘草素增強(qiáng)抗氧化能力保護(hù)長(zhǎng)波紫外線誘導(dǎo)的人角質(zhì)形成細(xì)胞氧化損傷［17］；對(duì)已經(jīng)受損的皮膚，天然冰片可以通過(guò)誘導(dǎo)表皮細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)受傷部位皮膚的再生，從而達(dá)到修復(fù)皮膚屏障的作用［18］。基于此，文本聚焦于探索吉列替尼誘發(fā)皮膚毒性的機(jī)制以及天然化合物能否改善吉列替尼皮膚毒性展開(kāi)研究，以期為臨床解決吉列替尼皮膚毒性尋找一種安全有效的干預(yù)策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑與儀器

人角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。6周齡C57BL/6J雄性小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。所有小鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境條件中飼養(yǎng)，自動(dòng)光照，每12 h明暗交替，動(dòng)物自由飲水，自由攝食。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及相關(guān)處理均已通過(guò)浙江大學(xué)智能創(chuàng)新藥物研究院動(dòng)物管理委員會(huì)審查（DW22072902 和DW202211211521）。

吉列替尼（分子式C29H44N8O3，貨號(hào)146621）為大連美侖生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；天然化合物庫(kù)來(lái)源于浙江大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理轉(zhuǎn)化平臺(tái)，詳細(xì)化合物見(jiàn)參考文獻(xiàn)［19］；冰片（分子式C10H18O，貨號(hào)T00517，主要成分為右旋龍腦）為上海陶素生化科技有限公司產(chǎn)品；（2-羥丙基）-β-環(huán)糊精（分子式C63H112O42）為上海阿拉丁生化科技股份有限公司產(chǎn)品；Ki-67 為美國(guó)Proteintech 公司產(chǎn)品；一步法TUNEL 檢測(cè)試劑盒（綠色熒光）、青霉素和鏈霉素粉末為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；HE 染色試劑盒為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；DMEM 培養(yǎng)液為杭州科易生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；胎牛血清為美國(guó)Hyclone 公司產(chǎn)品；NAC（分子式C5H9NO3S）為上海麥克林生化科技股份有限公司產(chǎn)品；c-PARP為杭州華安生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；β-肌動(dòng)蛋白為杭州戴格生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；Western Lightning ECL 化學(xué)發(fā)光底物試劑盒為珀金埃爾默股份有限公司產(chǎn)品；PI/Annexin V 雙染凋亡試劑盒為杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；生物胞素Alexa FluorTM488為賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品。蛋白免疫印跡裝置為美國(guó)Bio-Rad 公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品；低速離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf 公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀購(gòu)自帝肯（上海）實(shí)驗(yàn)器材有限公司；流式細(xì)胞儀為美國(guó)Beckman Coulter 公司產(chǎn)品；掃片機(jī)為寧波舜宇儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)思路

首先采用快速毒性模型造模方式在體內(nèi)造模，通過(guò)組織病理學(xué)檢測(cè)手段分析吉列替尼所致皮膚毒性的機(jī)制。再通過(guò)人角質(zhì)形成細(xì)胞采用蛋白質(zhì)印跡法、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合PI/Annexin Ⅴ雙染法、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合DCFH-DA 染色法、免疫熒光技術(shù)等技術(shù)觀察吉列替尼所致皮膚毒性的機(jī)制。最后通過(guò)人角質(zhì)形成細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)篩選出干預(yù)吉列替尼皮膚毒性的天然化合物，并進(jìn)一步在人角質(zhì)形成細(xì)胞和小鼠模型中驗(yàn)證。

1.3 體內(nèi)研究

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) （1）吉列替尼致皮膚損害實(shí)驗(yàn):取16 只C57BL/6J 雄性小鼠，隨機(jī)分為溶媒對(duì)照組和吉列替尼模型組，每組8只。參照吉列替尼的臨床推薦劑量（口服120 mg/d），根據(jù)Meeh-Rubner方程計(jì)算小鼠等效劑量約20 mg·kg-1·d-1，為了縮短吉列替尼皮膚毒性發(fā)生所需時(shí)間，給予小鼠三倍臨床等效劑量（60 mg·kg-1·d-1）。吉列替尼模型組:將吉列替尼分散于環(huán)糊精中，每天灌胃給藥1 次，連續(xù)給藥28 d；溶媒對(duì)照組:給予不含吉列替尼的等量環(huán)糊精溶液。各組給藥容量均為5 mL/kg。

（2）天然化合物干預(yù)實(shí)驗(yàn):取36 只C57BL/6J雄性小鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、吉列替尼對(duì)照組、冰片對(duì)照組和冰片+吉列替尼組，每組9 只。吉列替尼對(duì)照組每天1 次灌胃給予60 mg/kg 吉列替尼，連續(xù)給藥28 d；冰片對(duì)照組每天1次灌胃給予150 mg/kg冰片，連續(xù)給藥28 d；冰片+吉列替尼組將吉列替尼和冰片同時(shí)分散于環(huán)糊精中，灌胃給藥，給藥劑量與吉列替尼對(duì)照組或冰片對(duì)照組一致，連續(xù)給藥28 d；空白對(duì)照組每天給予不含吉列替尼和/或冰片的等量環(huán)糊精溶液處理。各組給藥容量為5 mL/kg。

給藥周期結(jié)束后處死小鼠，對(duì)小鼠腹部及腋下皮膚進(jìn)行觀察拍照后，取小鼠腋下至腹部皮膚組織，放入10%磷酸緩沖福爾馬林溶液（pH=7.4）中，充分固定皮膚組織后，進(jìn)行組織脫水，石蠟包埋，并用切片機(jī)進(jìn)行組織切片（厚度5 μm）。

1.3.2 HE染色法觀察皮膚組織病理學(xué)變化 將石蠟組織切片放置在二甲苯及不同濃度梯度乙醇中去蠟。去蠟的切片置于蘇木素染液中染色2 min 后浸沒(méi)于鹽酸乙醇溶液中分化2 s。用自來(lái)水沖洗后將石蠟切片浸沒(méi)于伊紅溶液中染色1 min，隨后用自來(lái)水沖洗。將切片在不同濃度梯度乙醇中脫水后移至二甲苯中，中性樹(shù)膠封片。采用掃片機(jī)掃描并采集染色結(jié)果。最外層不含細(xì)胞核的部分為角質(zhì)層，其內(nèi)透明部分為透明層，中間富含細(xì)胞核且較厚部分為顆粒層和棘層，進(jìn)一步往內(nèi)細(xì)胞核排列較為緊密的部分是基底層，基底層以內(nèi)則為真皮層，其中真皮層中還分布有毛囊和皮脂腺等附屬器官。

1.3.3 TUNEL 檢測(cè)觀察細(xì)胞凋亡 組織切片先脫蠟水化，使用10 mmol/L Tris-鹽酸緩沖液（pH=7.4）將不含DNA 酶的蛋白酶K 的濃度稀釋至20 μg/mL，每片滴加50 μL 至完全覆蓋組織，在37 ℃恒溫下孵育20 min。用PBS 洗三次。每張切 片 按TdT 酶5 μL、熒 光 標(biāo) 記 液45 μL 配 制TUNEL 檢測(cè)工作液。在恒溫37 ℃條件下孵育1 h。棄去TUNEL 檢測(cè)液，用PBS 洗三次，棄去PBS，每片滴加15 μL 抗熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片封片，隨后將玻片平放于通風(fēng)櫥中風(fēng)干12 h。熒光顯微鏡拍照采集圖像并保存。與細(xì)胞核共定位且呈綠色的部分代表TUNEL 檢測(cè)染色陽(yáng)性區(qū)域，表征發(fā)生凋亡的細(xì)胞。

1.3.4 抗Ki-67 抗體免疫組織化學(xué)染色觀察細(xì)胞增殖激活情況 組織切片先脫蠟水化后在乙二胺四乙酸中熱修復(fù)抗原表位20 min，在室溫下用過(guò)氧化物酶阻斷液去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性10 min，用10%山羊血清封閉20 min。用Ki-67抗體（按1∶5000 稀釋）4 ℃下孵育過(guò)夜，并進(jìn)行皮膚組織切片。次日，用PBS 洗滌兩次，每次5 min，用HRP 標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h。再次洗滌，用DAB 孵育4 min，洗凈DAB，蘇木精復(fù)染8 min，1%鹽酸乙醇分化2 s，流水沖洗至無(wú)色。封片后用掃片機(jī)掃描染色結(jié)果。與細(xì)胞核共定位且呈現(xiàn)明顯棕褐色的部分代表Ki-67 陽(yáng)性區(qū)域，表征細(xì)胞增殖的激活。

1.4 體外研究

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù) （1）吉列替尼體外造模實(shí)驗(yàn):將貼壁生長(zhǎng)的HaCaT 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中，并將培養(yǎng)器皿放置在37 ℃、5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中可額外添加1%雙抗（100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL 鏈霉素）。吉列替尼模型組分別給予不同濃度吉列替尼（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μmol/L 或0.5、1.0、2.0 μmol/L）；正常對(duì)照組則不給予吉列替尼。

（2）NAC 拮抗實(shí)驗(yàn):將HaCaT 細(xì)胞分為空白對(duì)照組、吉列替尼對(duì)照組、NAC 對(duì)照組和NAC 拮抗組。吉列替尼對(duì)照組僅給予1 μmol/L 吉列替尼；NAC 對(duì)照組僅給予2 mmol/L NAC；NAC 拮抗組同時(shí)給予1 μmol/L 吉列替尼和2 mmol/L NAC；空白對(duì)照組不給藥處理。

（3）天然化合物篩選實(shí)驗(yàn):將HaCaT 細(xì)胞分為空白對(duì)照組、吉列替尼對(duì)照組和56 種不同的天然化合物干預(yù)組。吉列替尼對(duì)照組僅給予1.0 μmol/L 吉列替尼；56 種不同的天然化合物干預(yù)組則同時(shí)給予1 μmol/L 吉列替尼和這56 種不同天然化合物的相應(yīng)臨床濃度；空白對(duì)照組不給藥處理。

（4）天然化合物干預(yù)實(shí)驗(yàn):將HaCaT 細(xì)胞分為空白對(duì)照組、吉列替尼對(duì)照組、冰片對(duì)照組和冰片+吉列替尼組。吉列替尼對(duì)照組僅給予1.0 μmol/L吉列替尼；冰片對(duì)照組僅給予75 μmol/L冰片；冰片+吉列替尼組同時(shí)給予1.0 μmol/L 吉列替尼和75 μmol/L冰片；空白對(duì)照組不給藥處理。

1.4.2 SRB 染色法檢測(cè)細(xì)胞存活情況 SRB 染色法具體操作步驟參考文獻(xiàn)［20］。將HaCaT 細(xì)胞以4000 個(gè)/孔的密度接種于96 孔板中，并確保試驗(yàn)期間的細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱放置24 h 后，細(xì)胞按照吉列替尼體外造模實(shí)驗(yàn)和天然化合物篩選實(shí)驗(yàn)分別處理，藥物作用一定時(shí)間后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入10%三氯乙酸，在4 ℃固定1 h。棄去三氯乙酸，并用蒸餾水洗滌5 次，放于60 ℃烘箱中干燥。烘干后，96 孔板中每孔加入4 mg/mL的SRB溶液70 μL，室溫靜置染色20 min，棄去SRB 溶液，并用濃度為1%冰醋酸溶液反復(fù)沖洗，再置于60 ℃烘箱中烘干。烘干后每孔加入70 μL 10 mmol/L Tris-base 溶液溶解，將96 孔板置于搖床上振蕩20 min 使結(jié)合細(xì)胞的染料充分溶解，進(jìn)行脫色。用酶標(biāo)儀在515 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的吸光度值。吉列替尼體外造模實(shí)驗(yàn)按下式計(jì)算:給藥處理后細(xì)胞存活率（%）=給藥處理組平均吸光度值/正常對(duì)照組平均吸光度值×100%；天然化合物篩選實(shí)驗(yàn)按下式計(jì)算:干預(yù)效率=不同天然化合物干預(yù)組平均吸光度值/吉列替尼對(duì)照組平均吸光度值。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)（PI/Annexin Ⅴ雙染法）檢測(cè)細(xì)胞死亡方式 將HaCaT細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種于六孔板中。37 ℃、5%二氧化碳下孵育24 h 后，分別按照吉列替尼體外造模實(shí)驗(yàn)和天然化合物干預(yù)實(shí)驗(yàn)處理。藥物作用24 h 后，通過(guò)胰蛋白酶消化收集細(xì)胞至EP 管。細(xì)胞用PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞兩次，400×g離心4 min 后，加入300 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸。在各EP管中加入5 μL Annexin V和10 μL PI，室溫下避光孵育。孵育15 min后，將細(xì)胞用濾膜過(guò)濾至潔凈流式管中。最后，用流式細(xì)胞儀對(duì)濾過(guò)后的細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.4.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白c-PARP的表達(dá) 將HaCaT 細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種于六孔板中。5%二氧化碳培養(yǎng)箱37 ℃孵育24 h 后，分別按照吉列替尼體外造模實(shí)驗(yàn)、NAC拮抗實(shí)驗(yàn)以及天然化合物干預(yù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行處理。藥物作用24 h 后用裂解緩沖液（0.3% NP-40、0.3% TritonX-100、0.25% Leupeptin、0.1% PMSF和0.1% NaVO3）從細(xì)胞中制備蛋白裂解物，并加入適量1×上樣緩沖液制備為蛋白樣本，加熱95 ℃。蛋白樣本分別用8%、10%、12% SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，每個(gè)樣品總蛋白為20 μg，并將凝膠整體轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。然后將剪切的膜封閉1 h 后，與相應(yīng)的一抗、二抗孵育。電泳檢測(cè)c-PARP 和β-肌動(dòng)蛋白。使用ECL 化學(xué)發(fā)光底物試劑進(jìn)行可視化處理，使用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參蛋白，檢測(cè)c-PARP蛋白的相對(duì)表達(dá)量并進(jìn)行歸一化處理。

1.4.5 流式細(xì)胞術(shù)（DCFH-DA染色法）檢測(cè)活性氧水平 將HaCaT細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種于六孔板中。5%二氧化碳培養(yǎng)箱37 ℃孵育24 h后，分別按照吉列替尼體外造模實(shí)驗(yàn)、NAC 拮抗實(shí)驗(yàn)以及天然化合物干預(yù)實(shí)驗(yàn)處理。藥物作用24 h后，通過(guò)胰蛋白酶消化收集細(xì)胞至EP管。細(xì)胞用無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液潤(rùn)洗細(xì)胞兩次，100×g離心4 min 后，加入1 mL 無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液。按照1∶1000 加入DCFH-DA 探針，37 ℃下避光孵育20 min。100×g離心4 min 后，無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)液潤(rùn)洗細(xì)胞兩次，加入150 μL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液重懸，將細(xì)胞用濾膜過(guò)濾至潔凈流式管中。采用流式細(xì)胞儀對(duì)濾過(guò)后的細(xì)胞進(jìn)行分析，通過(guò)歸一化處理得到DCFH-DA相對(duì)熒光強(qiáng)度。

1.4.6 抗γ-H2AX 抗體免疫熒光觀察細(xì)胞DNA損傷情況 將HaCaT 細(xì)胞以4000 個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，確保試驗(yàn)期間的細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。37 ℃恒溫培養(yǎng)箱放置24 h后，分別按照吉列替尼體外造模實(shí)驗(yàn)和天然化合物干預(yù)實(shí)驗(yàn)處理，藥物作用時(shí)間為24 h。棄去培養(yǎng)基并用新制備的4%多聚甲醛溶液在室溫下固定20 min。用含0.1%Triton X-100的PBS溶液在4 ℃下透化細(xì)胞10 min。用PBS洗滌兩次，每次5 min。用含4%牛血清白蛋白的PBS 溶液封閉30 min，PBS 洗滌兩次，每次5 min。配置一抗γ-H2AX（按1∶200稀釋）在4 ℃下孵育過(guò)夜。PBS 洗滌后，將細(xì)胞與Alexa Fluor 488標(biāo)記的二抗孵育1 h，PBS洗滌兩次，每次5 min，DAPI 染色5 min，置于熒光顯微鏡下觀察。與細(xì)胞核共定位且呈現(xiàn)綠色的部分代表免疫熒光陽(yáng)性區(qū)域，表征發(fā)生DNA損傷的細(xì)胞。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用三個(gè)樣本進(jìn)行重復(fù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。若組別數(shù)為兩組，組間顯著性差異采用Student’st檢驗(yàn)進(jìn)行分析；若組別數(shù)超過(guò)兩組，其組間的顯著性差異采用方差單向分析以及后續(xù)的Dunnett T3檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 吉列替尼可誘導(dǎo)小鼠皮膚病理性改變

相比溶媒對(duì)照組，吉列替尼模型組大體觀察出現(xiàn)不同程度的皮疹，表現(xiàn)為腹部、腋下等皮膚干燥、脫屑、毛發(fā)稀疏，表明造模成功，見(jiàn)圖1。吉列替尼模型組皮膚的表皮部分顯著增厚，角化不全導(dǎo)致角質(zhì)層不連續(xù)且疏松分層，棘層和顆粒層角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，基底層角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖，毛囊增大，皮脂腺增生，見(jiàn)圖2。TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示，吉列替尼模型組可以明顯觀察到棘層和顆粒層角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞核綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，見(jiàn)圖3。吉列替尼模型組平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（33.33±7.41）多于溶媒對(duì)照組（4.33±0.47），表明細(xì)胞DNA發(fā)生了斷裂，即發(fā)生細(xì)胞凋亡。免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，增殖標(biāo)志物Ki-67在吉列替尼模型組中表達(dá)明顯增多，見(jiàn)圖4，陽(yáng)性區(qū)域主要分布在基底層角質(zhì)形成細(xì)胞，表明吉列替尼可促進(jìn)基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖。上述結(jié)果提示，皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖可能與吉列替尼早期引起部分角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡相關(guān)。

圖1 吉列替尼模型組與溶媒對(duì)照組小鼠皮膚大體觀Figure 1 Skin appearance of the mice in gilteritinib group and the control group

圖2 吉列替尼模型組與溶媒對(duì)照組皮膚組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE染色）Figure 2 The histopathological changes in skin from mice in gilteritinib group and the control group （HE staining）

圖3 吉列替尼模型組與溶媒對(duì)照組皮膚組織細(xì)胞凋亡情況（TUNEL檢測(cè)）Figure 3 Apoptosis of the skin tissue cells from mice in gilteritinib group and the control group（TUNEL assay）

圖4 吉列替尼模型組與溶媒對(duì)照組皮膚組織Ki-67表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色）Figure 4 Ki-67 expression in the skin from mice in gilteritinib group and the control group（immunohistochemical staining）

2.2 吉列替尼體外可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞死亡和形態(tài)變化

SRB 染色法結(jié)果顯示，不同濃度的吉列替尼分別作用于角質(zhì)形成細(xì)胞24 和48 h 后，隨著濃度不斷升高，作用時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸下降，見(jiàn)圖5。考慮到吉列替尼的最大血藥濃度為0.56 μmol/L，選取三個(gè)濃度梯度（0.5、1.0、2.0 μmol/L）進(jìn)行后續(xù)研究。

圖5 不同濃度吉列替尼作用后HaCaT細(xì)胞存活率Figure 5 The survival rates of HaCaT cells after treated with different concentrations of gilteritinib

光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在不同濃度吉列替尼作用24 h 后，相比正常對(duì)照組，吉列替尼模型組貼壁細(xì)胞數(shù)明顯下降，且隨著吉列替尼濃度升高，角質(zhì)形成細(xì)胞數(shù)逐漸減少。同時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)變圓和皺縮等細(xì)胞凋亡形態(tài)特征，見(jiàn)圖6。提示吉列替尼會(huì)誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞死亡和形態(tài)變化。

圖6 不同濃度吉列替尼作用后HaCaT細(xì)胞在顯微鏡下所見(jiàn)Figure 6 Observation of HaCaT cells treated with different concentration of gilteritinib under microscope

2.3 吉列替尼體外可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡

不同濃度吉列替尼作用下凋亡角質(zhì)形成細(xì)胞數(shù)逐漸增多，見(jiàn)圖7和表1。

表1 吉列替尼模型組與正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)比較Table 1 Comparison of apoptosis related indicators between gilteritinib groups and the control group（±s，n=3）

表1 吉列替尼模型組與正常對(duì)照組細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)比較Table 1 Comparison of apoptosis related indicators between gilteritinib groups and the control group（±s，n=3）

與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01.c-PARP:切割型多腺苷二磷酸核糖聚合酶；γ-H2AX:磷酸化組蛋白H2AX.

組 別正常對(duì)照組吉列替尼模型組0.5 μmol/L 1.0 μmol/L 2.0 μmol/L凋亡率（%）3.82±2.23 c-PARP蛋白相對(duì)水平1.00 γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)2.67±1.25 8.67±2.05 16.33±1.70**26.33±3.68**9.57±5.15 17.09±4.56*24.74±3.92**2.47±0.62 4.90±2.88*5.05±1.19**

圖7 吉列替尼模型組與正常對(duì)照組流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果Figure 7 Flow cytometry results of the gilteritinib groups and the control group

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，角質(zhì)形成細(xì)胞在不同濃度吉列替尼作用24 h 后，凋亡標(biāo)志蛋白c-PARP蛋白表達(dá)水平隨藥物濃度的升高而上調(diào)，見(jiàn)圖8和表1。免疫熒光結(jié)果顯示，代表DNA雙鏈斷裂發(fā)生的標(biāo)志物γ-H2AX 的水平在吉列替尼作用后顯著上調(diào)，見(jiàn)圖9和表1。上述結(jié)果提示，吉列替尼可誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生凋亡。

圖8 吉列替尼模型組與正常對(duì)照組角質(zhì)形成細(xì)胞中c-PARP蛋白電泳圖Figure 8 Western blotting results of c-PARP expression in HaCaT cells in gilteritinib groups and control group

圖9 吉列替尼模型組與正常對(duì)照組γ-H2AX表達(dá)（免疫熒光染色）Figure 9 Expression of γ-H2AX in gilteritinib groups and the control group（immunofluorescence staining）

2.4 吉列替尼通過(guò)誘導(dǎo)活性氧累積導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度吉列替尼作用后，細(xì)胞內(nèi)DCFH-DA相對(duì)熒光強(qiáng)度上升，并呈劑量依賴性，見(jiàn)圖10A，提示細(xì)胞內(nèi)活性氧發(fā)生累積。而NAC拮抗組可以減少吉列替尼作用后引起的細(xì)胞內(nèi)DCFH-DA 相對(duì)熒光強(qiáng)度上升，見(jiàn)圖10B，提示NAC可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)吉列替尼引起的活性氧累積。

圖10 各組DCFH-DA熒光強(qiáng)度比較Figure 10 The relative fluorescence intensity of DCFH-DA in each group

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與吉列替尼對(duì)照組（3.18±0.44）比較，NAC 拮抗組的c-PARP 表達(dá)水平（1.39±0.78）下降（t=0.24，P＜0.05），見(jiàn)圖11。以上結(jié)果表明，抗氧化劑NAC 能減輕吉列替尼誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞活性氧的過(guò)度累積和凋亡。

圖11 NAC 拮抗組與各對(duì)照組細(xì)胞中c-PARP 蛋白電泳圖Figure 11 Western blotting results of the c-PARP protein expression in NAC antagonist group and the control groups

2.5 天然化合物冰片能拮抗吉列替尼導(dǎo)致的角質(zhì)形成細(xì)胞死亡

SRB 染色法結(jié)果顯示，在天然化合物庫(kù)的56種藥物中，除了一種化合物使吉列替尼對(duì)照組的細(xì)胞存活率進(jìn)一步下降，其余55 種藥物皆能導(dǎo)致吉列替尼對(duì)照組的細(xì)胞存活率不同程度上調(diào)，其中冰片上調(diào)細(xì)胞存活率的效率最高（2.05），見(jiàn)圖12。

圖12 56 種天然化合物對(duì)吉列替尼模型組細(xì)胞存活率的干預(yù)效率Figure 12 Interventional efficiency of 56 natural compounds on cell survival rate of the gilteritinib group

2.6 冰片可逆轉(zhuǎn)吉列替尼引起的角質(zhì)形成細(xì)胞死亡和形態(tài)變化

光學(xué)顯微鏡下，與吉列替尼對(duì)照組比較，冰片+吉列替尼組細(xì)胞數(shù)明顯增多，變圓和皺縮的細(xì)胞數(shù)明顯減少（圖13），提示冰片可以逆轉(zhuǎn)吉列替尼引起的角質(zhì)形成細(xì)胞死亡和形態(tài)變化。

圖13 冰片+吉列替尼組與各對(duì)照組顯微鏡下圖像Figure 13 Microscopic images of the borneol+gilteritinib group and the control groups

2.7 冰片可逆轉(zhuǎn)吉列替尼引起的角質(zhì)形成細(xì)胞角質(zhì)形成凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與吉列替尼對(duì)照組比較，冰片+吉列替尼組角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡率由（20.36±1.21）%降低至（14.29±3.12）%（t=0.16，P＜0.05），見(jiàn)圖14 和表2。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，與吉列替尼對(duì)照組比較，冰片+吉列替尼組角質(zhì)形成細(xì)胞c-PARP 表達(dá)水平下降，見(jiàn)圖15和表2。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，與吉列替尼對(duì)照組比較，冰片+吉列替尼組角質(zhì)形成細(xì)胞中γ-H2AX 的表達(dá)顯著下調(diào)，見(jiàn)圖16和表2。結(jié)果表明，冰片可減少吉列替尼誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡。

表2 冰片+吉列替尼組與各對(duì)照組細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)比較Table 2 Comparison of apoptosis related indicators between borneol+gilteritinib group and the control groups（± s，n=3）

表2 冰片+吉列替尼組與各對(duì)照組細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)比較Table 2 Comparison of apoptosis related indicators between borneol+gilteritinib group and the control groups（± s，n=3）

組 別空白對(duì)照組吉列替尼對(duì)照組冰片對(duì)照組冰片+吉列替尼組凋亡率（%）3.84±1.68 20.36±1.21*3.00±1.15 14.29±3.12#c-PARP蛋白相對(duì)水平1.00 2.83±0.84**0.71±0.07 1.64±0.15#γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1.33±1.25 18.67±2.87**1.00±0.82 2.33±1.70##

圖15 冰片+吉列替尼組與各對(duì)照組c-PARP 蛋白表達(dá)電泳圖Figure 15 Western blotting results of c-PARP protein expression in the borneol+gilteritinib group and the control groups

圖16 冰片+吉列替尼組與各對(duì)照組γ-H2AX表達(dá)（免疫熒光染色）Figure 16 Expression of γ-H2AX in the borneol+gilteritinib group and the control groups （immunofluorescence staining）

2.8 冰片可減少吉列替尼誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞活性氧過(guò)度累積

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與吉列替尼對(duì)照組比較，冰片+吉列替尼組角質(zhì)形成細(xì)胞DCFH-DA 相對(duì)熒光強(qiáng)度由（1.91±0.19）下降至（1.36±0.37），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.17，P＜0.01），提示細(xì)胞內(nèi)活性氧水平下降。

2.9 冰片可緩解吉列替尼誘導(dǎo)的小鼠皮膚病理性改變

HE 染色結(jié)果顯示，相比吉列替尼對(duì)照組，冰片+吉列替尼組皮膚表皮層厚度恢復(fù)正常，毛囊增大、皮脂腺增生等變化也得到顯著改善，見(jiàn)圖17。結(jié)果提示，冰片可緩解吉列替尼誘導(dǎo)的小鼠皮膚病理性改變。

圖17 冰片+吉列替尼組與各對(duì)照組皮膚組織病理學(xué)表現(xiàn)（HE染色）Figure 17 The histopathological changes in skin from mice in the borneol+gilteritinib group and the control groups（HE staining）

2.10 冰片可緩解吉列替尼誘導(dǎo)的小鼠皮膚細(xì)胞凋亡

TUNEL 檢測(cè)結(jié)果顯示，與吉列替尼對(duì)照組比較，冰片+吉列替尼組皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的綠色熒光顯著降低，兩組平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為（27.00±2.45）和（12.33±3.40），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.28，P＜0.01）。DAPI染色結(jié)果顯示，在吉列替尼作用后小鼠皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞DNA 片段和核固縮增加，而冰片+吉列替尼組皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài)恢復(fù)正常，見(jiàn)圖18。以上結(jié)果表明，冰片能夠在體內(nèi)水平顯著抑制吉列替尼誘導(dǎo)的皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡。

圖18 冰片+吉列替尼組與各對(duì)照組皮膚組織細(xì)胞凋亡情況（TUNEL檢測(cè)）Figure 18 Apoptosis of the skin tissue cells from mice in the borneol+gilteritinib group and the control groups （TUNEL assay）

與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與吉列替尼對(duì)照組比較，#P＜0.05.c-PARP:切割型多腺苷二磷酸核糖聚合酶；γ-H2AX:磷酸化組蛋白H2AX.

3 討 論

在接受TKI 治療的患者中，皮疹、毛發(fā)和指甲變化、黏膜炎、光敏性等皮膚毒性發(fā)生率很高［21-22］。目前，相較于其他臟器的毒性，臨床上對(duì)皮膚毒性關(guān)注度不高。然而，皮膚作為人體最大的器官，是人體防御外界刺激的第一道屏障，具有調(diào)節(jié)體溫、代謝、呼吸等多種生理功能［23］。藥物性皮膚毒性的發(fā)生會(huì)極大地改變外表，給患者帶來(lái)身心困擾，降低生活質(zhì)量。嚴(yán)重的藥物性皮膚毒性不僅會(huì)影響治療效果，甚至?xí)?dǎo)致死亡［24］。吉列替尼是一種多靶點(diǎn)激酶抑制劑，應(yīng)用于FLT3突變的復(fù)發(fā)性或難治性（藥物難治）急性髓性白血病成人患者的一線治療，但在其治療期間約36%的患者出現(xiàn)了皮膚毒性［3］，吉列替尼皮膚毒性機(jī)制不明以及干預(yù)策略的缺乏極大限制了其臨床應(yīng)用。因此，研究吉列替尼引起皮膚毒性的機(jī)制并制訂相應(yīng)的干預(yù)策略至關(guān)重要。但在目前藥物的皮膚毒性研究中，會(huì)存在實(shí)驗(yàn)造模表型與臨床毒性表型不一致的問(wèn)題，導(dǎo)致結(jié)果的可靠性與可復(fù)制性較低［25-26］。

如何構(gòu)建能夠較好模擬藥物臨床毒性的模型對(duì)于后續(xù)毒性機(jī)制和干預(yù)策略的研究起著決定性的作用。本研究中，C57BL/6J 雄性小鼠連續(xù)28 d 灌胃給予吉列替尼（60 mg·kg-1·d-1，臨床血藥濃度的三倍）后，身上出現(xiàn)了皮疹，其表型主要為脫屑、結(jié)痂、局部區(qū)域毛發(fā)稀疏、皮膚干燥等，對(duì)病變部位皮膚病理學(xué)分析的結(jié)果也證明表皮部分明顯增厚、毛囊增大、皮脂腺增生，皮疹現(xiàn)象與臨床研究結(jié)果一致，表明該模型用作后續(xù)吉列替尼毒性研究有較強(qiáng)的可靠性。值得注意的是，個(gè)別小鼠在給藥后不會(huì)出現(xiàn)皮疹或皮疹程度較輕，這可能是不同個(gè)體對(duì)藥物的毒性耐受程度不同所致，且臨床數(shù)據(jù)也說(shuō)明皮膚毒性的發(fā)生存在一定的概率，提示本研究采用的造模方式較為可靠。

進(jìn)一步組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，表皮部分顯著增厚，角化不全，推測(cè)角化不全是由于棘層和顆粒層角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡引起，而這部分角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡又會(huì)代償性地激活基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖，從而引起皮疹部位表皮的顯著增厚。已有文獻(xiàn)報(bào)道Ki-67 指數(shù)與凋亡體指數(shù)呈正相關(guān)［27］，這也驗(yàn)證了基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖可能是皮膚角化不全的一種代償機(jī)制?？紤]到角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡可能是吉列替尼皮膚毒性的起始因素，而在體內(nèi)直接開(kāi)展毒性機(jī)制的研究具有一定的困難，因而本研究以HaCaT 細(xì)胞作為體外研究模型，深入考察驗(yàn)證吉列替尼皮膚毒性發(fā)生的機(jī)制。結(jié)果顯示，吉列替尼可以顯著誘導(dǎo)活性氧過(guò)度累積，而活性氧可以改變細(xì)胞內(nèi)各種信號(hào)傳導(dǎo)分子和蛋白質(zhì)的活性，從而影響細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)［28］，通過(guò)聯(lián)用抗氧化劑NAC 可以顯著逆轉(zhuǎn)細(xì)胞凋亡，從而證明了吉列替尼通過(guò)上調(diào)活性氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)天然化合物具有防治TKI所致皮膚毒性的作用［10］。本研究在體外模型中對(duì)天然化合物庫(kù)進(jìn)行篩選發(fā)現(xiàn)，冰片可以顯著逆轉(zhuǎn)吉列替尼引起的角質(zhì)形成細(xì)胞死亡，表明其干預(yù)吉列替尼皮膚毒性的潛力。冰片是一種提取自樟科植物龍腦樟枝葉的天然產(chǎn)物，在中醫(yī)藥治療中常作為佐使藥，以加強(qiáng)主藥的藥效或減弱主藥毒性，進(jìn)而起到相輔相成、相得益彰的功效［29］。本文資料顯示，冰片能改善吉列替尼誘導(dǎo)的角質(zhì)形成細(xì)胞活性氧過(guò)度累積和凋亡，且其本身對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞沒(méi)有殺傷作用。為了驗(yàn)證冰片在臨床上應(yīng)用的可能性，本研究采用小鼠體內(nèi)模型驗(yàn)證了冰片對(duì)吉列替尼皮膚毒性的干預(yù)作用，結(jié)果表明冰片與吉列替尼的合用可以有效地抑制吉列替尼引起的皮疹，改善表皮增厚、角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡等毒性表型。此外，僅給予冰片的小鼠未產(chǎn)生明顯的毒性癥狀，證明了冰片臨床應(yīng)用的安全性。

綜上所述，吉列替尼可通過(guò)引起細(xì)胞內(nèi)活性氧累積誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，致使皮膚毒性發(fā)生，而冰片可以通過(guò)減少活性氧累積和皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡，改善吉列替尼皮膚毒性。雖然上述研究結(jié)果已在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行了驗(yàn)證，但受限于目前臨床研究對(duì)吉列替尼所致皮疹的具體特征未展開(kāi)詳細(xì)描述，因此不能確定動(dòng)物模型上發(fā)生的皮疹表型與臨床完全一致，仍須后續(xù)進(jìn)一步考察吉列替尼皮膚毒性的臨床表型。同時(shí)，考慮到其他TKI 如EGFR 抑制劑等在應(yīng)用期間會(huì)出現(xiàn)丘疹、瘙癢、干燥等癥狀，而這與吉列替尼誘發(fā)的皮膚毒性又具有一定的相似性，因而冰片是否也能對(duì)EGFR 抑制劑的皮膚毒性發(fā)揮干預(yù)作用需要后續(xù)進(jìn)一步探究。此外，雖然目前對(duì)吉列替尼的案例報(bào)道和臨床研究均未發(fā)現(xiàn)性別與其皮疹發(fā)生率之間的明顯相關(guān)性。但一些研究表明藥物性皮疹存在性別差異，如在一項(xiàng)針對(duì)藥物性皮疹的研究中，發(fā)現(xiàn)女性患者在使用某些藥物后更容易出現(xiàn)嚴(yán)重的藥疹［30］。此外，性別差異可能還受到其他因素的干擾，如特定藥物的性別偏好和基因差異表達(dá)等［31］。因此雌性小鼠該機(jī)制能否適用，冰片能否起效也值得更深入研究。

志謝 研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金（82204516）支持

Acknowledgements This paper was supported by the National Natural Science Foundation of China (82204516)

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of Interests The authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)