周夢(mèng)琴，蘇 芃，2，梁景巖，2，熊天慶，2

1.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，江蘇 揚(yáng)州 225009

2.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009

腦卒中是導(dǎo)致全球人口死亡及永久性殘疾的主要原因之一，其中腦梗死約占87%，能永久性或短暫性血管阻塞導(dǎo)致腦細(xì)胞死亡，其特點(diǎn)主要有病情進(jìn)展快、致死率和致殘率高等，給社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)和健康負(fù)擔(dān)［1-2］。如今，治療腦梗死的選擇依然有限，組織型纖溶酶原激活劑（一種能在很短時(shí)間內(nèi)用于恢復(fù)大腦血流灌注的溶栓劑）仍是目前唯一用于治療急性腦梗死的藥物，但其治療窗口期僅4.5 h，應(yīng)用范圍與療效也存在不足［3］。目前，對(duì)于腦梗死潛在發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍不全面，導(dǎo)致新藥開(kāi)發(fā)及治療策略推進(jìn)緩慢。

眾多研究表明，先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)均為腦梗死進(jìn)展的關(guān)鍵因素，免疫系統(tǒng)貫穿了腦卒中的全過(guò)程，神經(jīng)毒性的產(chǎn)生及組織的重構(gòu)與修復(fù)作為危險(xiǎn)因素都產(chǎn)生了負(fù)面作用，因此免疫系統(tǒng)與大腦雙方的相互影響共同調(diào)控了疾病發(fā)展趨勢(shì)。腦梗死后嚴(yán)重的腦缺血誘發(fā)免疫激活反應(yīng)，加劇了神經(jīng)功能缺損，主要通過(guò)自主神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度激活導(dǎo)致全身免疫系統(tǒng)發(fā)生改變，引發(fā)全身免疫抑制，即為SIID。SIID 的主要表現(xiàn)包括淋巴細(xì)胞減少、先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞功能失調(diào)等，其導(dǎo)致的抗菌防御受損可促使患者高發(fā)腦卒中后感染［4-6］，不論是局部神經(jīng)炎癥過(guò)程還是全身性感染都會(huì)對(duì)腦卒中后的結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響。目前，腦卒中及SIID 的相關(guān)機(jī)制仍知之甚少，更深入的了解可能對(duì)識(shí)別靶基因和功能通路以及指導(dǎo)包括藥物開(kāi)發(fā)與利用在內(nèi)的治療干預(yù)有重要意義［7］。

隨著幾十年大規(guī)模針對(duì)神經(jīng)保護(hù)的臨床試驗(yàn)失敗，目前腦卒中治療的重點(diǎn)逐漸從神經(jīng)保護(hù)轉(zhuǎn)向神經(jīng)血管保護(hù)［8］，SIID 的啟動(dòng)和發(fā)展也都離不開(kāi)神經(jīng)血管共同的調(diào)控作用。NVU 是神經(jīng)血管人為定義的最小單位，由三個(gè)基本單位組成:血管細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞）、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞）和神經(jīng)元，還包括腦脈管系統(tǒng)內(nèi)的ECM，共同構(gòu)成協(xié)調(diào)的神經(jīng)血管耦合并維持高度選擇性的血腦屏障。所有NVU 組分在結(jié)構(gòu)和功能上密切相關(guān)且不可或缺，與維持腦微環(huán)境穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)血流量及免疫等密切相關(guān)。該結(jié)構(gòu)與功能性多細(xì)胞模塊強(qiáng)調(diào)了神經(jīng)元和腦脈管系統(tǒng)之間獨(dú)特的串?dāng)_聯(lián)系，腦梗死后每個(gè)模塊均直接接觸有害因素，通過(guò)各自及相互間的作用介導(dǎo)多個(gè)細(xì)胞和分子水平上的炎癥過(guò)程，從而在疾病進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用［9-11］。

如今，腦卒中的治療趨勢(shì)已從僅關(guān)注保護(hù)神經(jīng)元轉(zhuǎn)向調(diào)節(jié)NVU不同組分間關(guān)系正?；笳叱蔀樘剿髂X梗死機(jī)制和治療的新范式。NVU 各組分具有不同的異質(zhì)性，可能賦予NVU在損傷后不同階段有害/保護(hù)性雙重作用，如在損傷后觸發(fā)延遲的恢復(fù)反應(yīng)，調(diào)節(jié)先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)在腦梗死后促炎/抗炎反應(yīng)的平衡。當(dāng)炎癥和損傷超過(guò)內(nèi)在修復(fù)能力時(shí)也必然導(dǎo)致較差的臨床結(jié)果。為進(jìn)一步了解免疫炎癥過(guò)程并設(shè)計(jì)相關(guān)治療，恢復(fù)腦損傷或疾病后的穩(wěn)態(tài)，闡明病理?xiàng)l件下NVU 不同組分的動(dòng)態(tài)炎癥變化及免疫協(xié)調(diào)機(jī)制是有必要的［12-14］。

因此，本文就腦梗死后NVU參與SIID可能的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行綜述，探究免疫系統(tǒng)在腦梗死發(fā)生、發(fā)展中的效應(yīng)，以及腦卒中免疫調(diào)節(jié)治療的可能性。

1 腦梗死后免疫抑制的發(fā)生及對(duì)腦梗死的影響

免疫系統(tǒng)在腦梗死的發(fā)生、進(jìn)展和修復(fù)中都有參與，包括先天性和適應(yīng)性免疫，在損傷的急性和慢性階段都起著關(guān)鍵作用［13］。生理?xiàng)l件下，免疫系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)多種途徑相互作用以維持穩(wěn)態(tài)，但嚴(yán)重的腦損傷（如腦卒中）可打破這一平衡。腦梗死發(fā)作后24 h 內(nèi)，初級(jí)和次級(jí)淋巴器官被激活，受傷和死亡的細(xì)胞釋放DAMP，炎癥級(jí)聯(lián)的激活導(dǎo)致大腦中的神經(jīng)炎癥狀態(tài)發(fā)展至全身，伴細(xì)胞因子、趨化因子和其他促炎介質(zhì)在血液循環(huán)中的水平顯著升高［15-16］，免疫系統(tǒng)逐漸疲累力竭，在腦卒中發(fā)作后數(shù)小時(shí)至數(shù)天內(nèi)的亞急性期觸發(fā)免疫抑制狀態(tài)，功能狀態(tài)隨細(xì)胞免疫功能迅速且持續(xù)的減弱而受到抑制，特征表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞數(shù)減少（主要是CD4+T 細(xì)胞），次級(jí)淋巴器官（如脾臟）萎縮和抗炎細(xì)胞因子水平升高［11］，主要表現(xiàn)還有中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值增加，單核細(xì)胞上抗原提呈分子HLA-DR 表達(dá)減少，并伴隨促炎性細(xì)胞因子（如γ 干擾素、TNF-α）產(chǎn)生減少而抗炎細(xì)胞因子（如IL-10）產(chǎn)生增加，Th1 細(xì)胞活性受損（從Th1 細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)h2 細(xì)胞）［17］。此外，分化的Treg 細(xì)胞及脾臟中B 細(xì)胞的丟失也進(jìn)一步損害了宿主對(duì)病原體的防御［18］。腦梗死后持續(xù)加劇的神經(jīng)功能缺損導(dǎo)致全身免疫系統(tǒng)發(fā)生改變，這種現(xiàn)象被稱(chēng)為SIID，其雖然對(duì)緩解炎癥損傷有一定的積極意義，但會(huì)加重感染風(fēng)險(xiǎn)甚至可能危及生命，產(chǎn)生全身性不良影響，主要表現(xiàn)為腦卒中相關(guān)性肺炎和尿路感染［19］。

1.1 SIID的發(fā)生機(jī)制

中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)復(fù)雜的神經(jīng)和體液途徑共同調(diào)控免疫功能，目前主要包括交感神經(jīng)系統(tǒng)、副交感神經(jīng)系統(tǒng)和HPA［20］，但有關(guān)全身性免疫抑制的具體機(jī)制仍未完全明確。

1.1.1 交感神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)SIID 的影響 腦梗死會(huì)顯著誘發(fā)交感神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度激活，降低感染閾值并增加感染風(fēng)險(xiǎn)。腎上腺素、去甲腎上腺素和多巴胺等兒茶酚胺是交感神經(jīng)系統(tǒng)介質(zhì)，當(dāng)交感腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)興奮時(shí)被大量分泌釋放入血，通過(guò)免疫細(xì)胞的腎上腺素能受體起作用，目前已有研究發(fā)現(xiàn)與交感神經(jīng)系統(tǒng)活性相關(guān)的ARRβ2/NF-κB 通 路［21］或cAMP/PKA/NF-κB 通路［22］可誘導(dǎo)免疫抑制。首先，減少γ 干擾素（NK細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞因子之一）的產(chǎn)生，抑制了細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4 的表達(dá)，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡，抗炎細(xì)胞因子分泌增加［16，23］；其次，下調(diào)MHC Ⅱ類(lèi)分子表達(dá)，減弱了抗原提呈細(xì)胞功能，減少血液中TNF 和IL-6 的產(chǎn)生，促進(jìn)M2 型（抗炎）巨噬細(xì)胞的分化，協(xié)同刺激抗炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生并激活了Th2 細(xì)胞免疫應(yīng)答；最后，下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（炎癥基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子）的活性，可抑制促炎性細(xì)胞因子（IL-1β、TNF-α 和IL-6）的基因轉(zhuǎn)錄，上調(diào)抗炎細(xì)胞因子（如IL-10），抑制Th1 細(xì)胞活性及細(xì)胞免疫應(yīng)答［21-22］。研究顯示，通過(guò)β 腎上腺素受體阻斷劑普萘洛爾抑制交感神經(jīng)系統(tǒng)，可減少淋巴細(xì)胞功能障礙和細(xì)菌感染，提高大腦中動(dòng)脈栓塞小鼠的存活率［24］，佐證了交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活是導(dǎo)致腦卒中后感染發(fā)生率高的主要免疫抑制機(jī)制。

1.1.2 HPA 對(duì)SIID 的 影 響 HPA 是神 經(jīng)內(nèi) 分泌系統(tǒng)的重要組成部分。HPA 和交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活可導(dǎo)致腎上腺類(lèi)固醇激素和兒茶酚胺的全身釋放，是大手術(shù)、腦損傷或創(chuàng)傷后免疫炎癥反應(yīng)的重要組成部分。一方面，兒茶酚胺能與HPA 通路協(xié)同作用，通過(guò)去甲腎上腺素和糖皮質(zhì)激素的協(xié)調(diào)作用誘導(dǎo)外周室的脾萎縮和NK 細(xì)胞數(shù)減少，隨后支配誘導(dǎo)的細(xì)胞因子信號(hào)通路抑制因子3上調(diào)充當(dāng)負(fù)反饋抑制劑以抑制外周區(qū)室中NK細(xì)胞的生成［25］。另一方面，下丘腦可感知腦卒中致腦損傷所產(chǎn)生的IL-1、IL-6、IL-10 和TNF-α，從而通過(guò)激活HPA 增加下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素的合成，以刺激垂體前葉產(chǎn)生促腎上腺皮質(zhì)激素進(jìn)入腎上腺過(guò)度釋放糖皮質(zhì)激素，而糖皮質(zhì)激素具有強(qiáng)大的抗炎作用，可作用于T 淋巴細(xì)胞減少γ 干擾素的產(chǎn)生并誘導(dǎo)其凋亡，也作用于單核細(xì)胞促進(jìn)IL-10 分泌，這可能是腦梗死后血液和脾臟中淋巴細(xì)胞、NK 細(xì)胞減少，以及中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞防御機(jī)制受損的重要原因［18，21］。Prass 等［24］觀察到，通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體阻滯劑RU486抑制HPA可預(yù)防淋巴細(xì)胞減少、凋亡及單核細(xì)胞功能障礙，但與普萘洛爾治療效果不同，其并未減少細(xì)菌感染。以上結(jié)果揭示了HPA 在SIID 中有一定作用但可能不如交感神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)鍵。

1.1.3 副交感神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)SIID 的影響 膽堿能抗炎途徑主要包括迷走神經(jīng)、脾臟和α7nAChR。腦梗死后激活的副交感神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)分泌乙酰膽堿與α7nAChR 結(jié)合，α7nAChR 表達(dá)上調(diào)可抑制NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，下調(diào)炎癥水平，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激并促進(jìn)腦功能恢復(fù)。此外，副交感神經(jīng)系統(tǒng)通過(guò)活化迷走神經(jīng)和刺激α7nAChR來(lái)調(diào)節(jié)脾免疫反應(yīng)，是大腦調(diào)節(jié)脾和外周免疫系統(tǒng)相關(guān)的一個(gè)重要途徑，如分泌乙酰膽堿的T 淋巴細(xì)胞可抑制脾臟生成TNF-α［26-27］。對(duì)于腦卒中相關(guān)性感染，一方面已知巨噬細(xì)胞與肺泡上皮細(xì)胞都是肺膽堿能抗炎信號(hào)傳導(dǎo)的主要細(xì)胞靶標(biāo)，Engel 等［28］證實(shí)大腦中動(dòng)脈栓塞小鼠模型的副交感神經(jīng)活性迅速增加后，會(huì)導(dǎo)致肺先天免疫反應(yīng)由于膽堿能信號(hào)傳導(dǎo)提升受到抑制，增加了感染易感性；另一方面研究驗(yàn)證在腦梗死小鼠亞急性期（腦卒中3 d 后）使用Varenicline（一種α7nAChR 高親和力激動(dòng)劑）可減少大腦炎癥反應(yīng)，改善其運(yùn)動(dòng)功能，表明活化的副交感神經(jīng)系統(tǒng)可減輕亞急性期炎癥損傷，可能存在有調(diào)節(jié)腦部炎癥的時(shí)間窗口［29］。綜上所述，通過(guò)迷走神經(jīng)和α7nAChR刺激膽堿能抗炎途徑可能是一種神經(jīng)保護(hù)策略，但膽堿能途徑的額外刺激也可能會(huì)加劇危及生命的細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)，免疫調(diào)節(jié)治療須保持感染易感性增加和神經(jīng)保護(hù)之間的平衡。

由上述可知，腦卒中后交感神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度激活，兒茶酚胺水平持續(xù)升高介導(dǎo)了早期淋巴細(xì)胞激活減少與腦卒中后抗菌免疫反應(yīng)受損，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 與星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的激活緊密關(guān)聯(lián)；副交感神經(jīng)激活后通過(guò)α7nAChR抑制小膠質(zhì)細(xì)胞等免疫細(xì)胞釋放外周免疫因子，產(chǎn)生免疫抑制；激活HPA 可升高糖皮質(zhì)激素，抑制了促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生并阻止免疫細(xì)胞增殖以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，死亡的神經(jīng)元和非神經(jīng)元釋放DAMP 進(jìn)一步激活固有免疫細(xì)胞（如小膠質(zhì)細(xì)胞）和其他細(xì)胞（如周細(xì)胞［30］）中的先天性免疫受體產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子，并與其他促炎介質(zhì)共同破壞血腦屏障，從而進(jìn)一步觸發(fā)神經(jīng)體液反應(yīng)［13］，多種機(jī)制協(xié)同破壞NVU的穩(wěn)定性而促進(jìn)了SIID的發(fā)展。

1.2 SIID對(duì)腦梗死的影響

腦梗死初期引起的一系列免疫反應(yīng)不僅涉及腦損傷，還包含反饋性的修復(fù)。SIID 的發(fā)展可能作為一種適應(yīng)性保護(hù)代償機(jī)制，減輕腦內(nèi)過(guò)度炎癥反應(yīng)，阻止腦損傷的進(jìn)一步發(fā)展。由于腦損傷可削弱免疫細(xì)胞功能，抑制免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞數(shù)減少，NK細(xì)胞和T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌失調(diào)，從而影響腦卒中的嚴(yán)重程度及相關(guān)感染的發(fā)病率［19，31］。目前，腦梗死后免疫反應(yīng)的性質(zhì)是否受梗死位置的影響尚未明確，但腦損傷的程度可能決定了SIID是否發(fā)生及其嚴(yán)重程度［11］。

SIID 下調(diào)免疫反應(yīng)減少炎癥損傷的同時(shí)也減弱了機(jī)體對(duì)病原體的抵抗力而導(dǎo)致感染易感性增加。流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明，腦卒中后感染是患者死亡和殘疾的主要原因，感染率與研究特征和患者的臨床狀況有關(guān)且結(jié)果差異較大，目前最新文獻(xiàn)報(bào)道總感染率高達(dá)30%，肺炎和尿路感染率均約為10%，重癥監(jiān)護(hù)室中比率更高，肺炎與死亡顯著相關(guān)（比值比為3.62）。全身性免疫系統(tǒng)的抑制發(fā)生在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)急性損傷中，致感染易感性增加，全身性感染亦增強(qiáng)了針對(duì)腦抗原的自身免疫反應(yīng)，對(duì)預(yù)后產(chǎn)生不利影響，與較高的復(fù)發(fā)率和再入院率密切相關(guān)［17，20］。目前，腦卒中后中樞神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)相互作用的機(jī)制尚未完全闡明，腦卒中不同階段觀察到的免疫抑制有不同的效果，結(jié)合最新腦卒中后肺炎相關(guān)的分析報(bào)道可推斷SIID 是腦梗死急性期后感染率極高的重要危險(xiǎn)因素，兩者間相互促進(jìn)預(yù)后不良結(jié)果［17，32］。探索如何在不損傷腦的情況下有效控制SIID 對(duì)全身免疫變化的影響，對(duì)改善患者存活率和生活質(zhì)量具有重要意義。

從正面影響來(lái)看，腦卒中急性期受損血腦屏障允許免疫細(xì)胞幾乎不受限制地進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，同時(shí)讓通常在大腦中被隔離的抗原很可能第一次暴露出來(lái)，有證據(jù)表明這些抗原可在實(shí)驗(yàn)性腦卒中后數(shù)小時(shí)內(nèi)進(jìn)入循環(huán)并提呈給淋巴結(jié)中的淋巴細(xì)胞，從而誘導(dǎo)自身反應(yīng)性T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞啟動(dòng)自身免疫反應(yīng)［33］。因此，SIID可通過(guò)下調(diào)外周免疫應(yīng)答使中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受自身免疫的侵?jǐn)_，最大限度地減少大腦腦梗死后進(jìn)一步的免疫病理反應(yīng)，從而產(chǎn)生保護(hù)作用，但這需要以宿主高易感性為代價(jià)。

綜上所述，SIID 的總體后果尚不清楚，不同病況的患者可能結(jié)果差異很大。但是，感染對(duì)腦卒中各個(gè)階段的有害影響是毋庸置疑的。因此，進(jìn)一步研究SIID 相關(guān)調(diào)控信號(hào)和免疫機(jī)制，探索預(yù)防或減少感染的相關(guān)免疫治療策略一定會(huì)在未來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注。

2 神經(jīng)血管單元在腦梗死后免疫抑制中的作用

功能性NVU 是滿(mǎn)足大腦動(dòng)態(tài)代謝需求的核心，毫無(wú)疑問(wèn)NVU在腦梗死的病理生理過(guò)程中起著主導(dǎo)作用，對(duì)炎癥免疫反應(yīng)具有深遠(yuǎn)的影響。多種機(jī)制嚴(yán)重改變炎癥/抗炎介質(zhì)的平衡，破壞了NVU的穩(wěn)定性，導(dǎo)致血腦屏障功能障礙，從而啟動(dòng)SIID。另外，NVU 重要組成細(xì)胞也可自主或在相互作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡妆硇痛龠M(jìn)并參與SIID。

2.1 血腦屏障中內(nèi)皮細(xì)胞的促炎表型促進(jìn)SIID啟動(dòng)

腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞是NVU 的主要成分，有助于血腦屏障的形成。生理?xiàng)l件下，由于血腦屏障具有高度選擇性，血管中的大分子和極性分子不能擴(kuò)散到中樞神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)質(zhì)中。與外周器官中的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞不同，大腦中的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞是無(wú)孔的，其特征是細(xì)胞旁擴(kuò)散水平低，胞飲活性最小，有多種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這些特性賦予其血腦屏障獨(dú)特的運(yùn)輸系統(tǒng)。腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)緊密連接和黏附連接形成連續(xù)層，阻斷了毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的細(xì)胞旁擴(kuò)散途徑，還可選擇性地緩沖血液成分波動(dòng)對(duì)腦間質(zhì)液的影響，調(diào)節(jié)大腦微環(huán)境和神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)［34-35］。

腦內(nèi)皮細(xì)胞中白細(xì)胞黏附分子表達(dá)水平低，能防止免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)，但在血腦屏障被破壞后，腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮黏附分子（ICAM-1、VCAM-1、P 選擇素和E 選擇素）生成增多，促炎表型表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)急性炎癥期外周免疫細(xì)胞滲入腦實(shí)質(zhì)，并在晚期誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，隨著更多特異性免疫細(xì)胞參與，炎癥反應(yīng)也將不斷加重［35-37］。因此，由于腦梗死損傷血腦屏障結(jié)構(gòu)組分后蛋白水解酶被激活，同時(shí)激活中性粒細(xì)胞活性，導(dǎo)致蛋白水解酶暴露于NVU 中，腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞緊密的連接與基底膜均被破壞［38］，血腦屏障通透性大大增加，允許各種促炎性細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞隨意進(jìn)入血腦屏障中，加重腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致SIID啟動(dòng)。

2.2 促炎表型腦周細(xì)胞破壞血腦屏障參與啟動(dòng)SIID的潛力

腦毛細(xì)血管內(nèi)平滑肌細(xì)胞被周細(xì)胞取代，周細(xì)胞通過(guò)共同的基底膜與腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞密切聯(lián)系但不直接接觸，并具有類(lèi)似平滑肌細(xì)胞的收縮特征，故可調(diào)節(jié)毛細(xì)血管的腦血流量［39］。根據(jù)位置、形態(tài)和蛋白質(zhì)表達(dá)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)周細(xì)胞可分為三種亞型:動(dòng)脈周細(xì)胞在調(diào)節(jié)腦血流量方面起著至關(guān)重要的作用，毛細(xì)血管周細(xì)胞對(duì)于維持血腦屏障完整性很重要，小靜脈周細(xì)胞可調(diào)節(jié)外周免疫細(xì)胞浸潤(rùn)腦細(xì)胞［40］。這三種周細(xì)胞亞型在正常大腦及腦梗死后腦損傷與功能恢復(fù)中都起著關(guān)鍵作用，促進(jìn)血管生成及神經(jīng)發(fā)生，對(duì)血腦屏障的發(fā)育和止血也有重大貢獻(xiàn)，毫無(wú)疑問(wèn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的周細(xì)胞具有更復(fù)雜且重要的功能。相比其他組織器官，大腦中的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有更廣泛的周細(xì)胞覆蓋。有體外研究表明，與周細(xì)胞關(guān)系緊密的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞比單獨(dú)的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞更能抵抗細(xì)胞凋亡，進(jìn)一步證明了周細(xì)胞在支持血腦屏障形成并維持其結(jié)構(gòu)完整性中的作用［9，35］。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中，腦周細(xì)胞可表現(xiàn)出促炎或抗炎不同表型。周細(xì)胞通過(guò)表達(dá)多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在腦梗死后促進(jìn)神經(jīng)元和軸突再生，并與毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用支持新血管的形成及血腦屏障的穩(wěn)定，對(duì)保護(hù)腦實(shí)質(zhì)免受白細(xì)胞浸潤(rùn)產(chǎn)生重要作用［6，30］。此外，毛細(xì)血管小靜脈末端的周細(xì)胞對(duì)外周免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的調(diào)節(jié)作用可減輕神經(jīng)血管損傷［40］。相比之下，周細(xì)胞的促炎特性更加突出。一方面，在腦梗死后超急性期，周細(xì)胞可能因參與血管收縮導(dǎo)致在毛細(xì)血管閉塞（無(wú)回流現(xiàn)象），并可于后期轉(zhuǎn)變?yōu)榇傺妆硇驮鰪?qiáng)血腦屏障的通透性，促進(jìn)腦水腫形成［41-42］。另一方面，在免疫反應(yīng)募集白細(xì)胞的過(guò)程中，周細(xì)胞通過(guò)持續(xù)表達(dá)低水平的黏附分子感知組織損傷，在腦卒中產(chǎn)生的炎癥細(xì)胞因子及DAMP 的誘導(dǎo)下，分泌促炎免疫活性因子包括IL、TNF-α和γ干擾素，產(chǎn)生大量的活性氧、一氧化氮和其他促炎性細(xì)胞因子［39，43］，從而對(duì)NVU 的細(xì)胞造成損害并破壞血腦屏障。另有報(bào)道稱(chēng)，周細(xì)胞可以被激活、增殖并遷移到鄰近的缺血性腦實(shí)質(zhì)中，表達(dá)小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物并獲得小膠質(zhì)細(xì)胞表型，從而參與免疫反應(yīng)［30］。

綜上可知，周細(xì)胞雖有一定的調(diào)節(jié)保護(hù)作用，但其協(xié)同促炎推進(jìn)SIID 發(fā)展的潛力同樣難以忽視，但目前是何種機(jī)制主導(dǎo)、作用的具體時(shí)機(jī)及相關(guān)調(diào)節(jié)信號(hào)均不清楚。另外要特別提出的是，早先研究表明周細(xì)胞可表達(dá)多種血管介質(zhì)受體，其中包括兒茶酚胺［44］正是前文所述SIID 重要的發(fā)生機(jī)制交感神經(jīng)系統(tǒng)激活的產(chǎn)物。

2.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦梗死早期破壞血腦屏障啟動(dòng)免疫反應(yīng)而在腦梗死晚期促進(jìn)并參與SIID

星形膠質(zhì)細(xì)胞是高度異質(zhì)的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，以非重疊的方式遍布整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在NVU 中，星形膠質(zhì)細(xì)胞位于神經(jīng)元和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間的中心，特殊的位置使其能夠調(diào)節(jié)腦血流量，維持血腦屏障的非滲透性，參與神經(jīng)元代謝和突觸活性的動(dòng)態(tài)變化［45-47］。近年來(lái)，根據(jù)星形膠質(zhì)細(xì)胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)中其他類(lèi)型細(xì)胞間的相互作用與聯(lián)系（串?dāng)_），研究者們更加關(guān)注其更多、更復(fù)雜的功能。如前文所述，星形膠質(zhì)細(xì)胞終足接觸毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞并包裹血管壁，這種結(jié)構(gòu)可誘導(dǎo)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中緊密連接蛋白的表達(dá)，又通過(guò)SHH蛋白和β-聯(lián)蛋白加強(qiáng)血腦屏障的緊密連接和完整性［48］，對(duì)形成與穩(wěn)定血腦屏障具有一定的貢獻(xiàn)。

小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要免疫活性細(xì)胞，但星形膠質(zhì)細(xì)胞在這方面經(jīng)常被忽視［49］。腦梗死后星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)歷結(jié)構(gòu)和功能的轉(zhuǎn)化（反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生），類(lèi)似于小膠質(zhì)細(xì)胞在病理生理?xiàng)l件下是調(diào)節(jié)血腦屏障完整性的雙刃劍，由促炎刺激觸發(fā)的NF-κB異二聚體的核轉(zhuǎn)運(yùn)是其活化的關(guān)鍵步驟。缺血缺氧引發(fā)了細(xì)胞一系列損傷反應(yīng)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激產(chǎn)物和促炎性細(xì)胞因子（趨化因子）等促炎因子的釋放，與A1 型星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子協(xié)同破壞局部血腦屏障導(dǎo)致其通透性增加，促炎性細(xì)胞因子和外周免疫細(xì)胞均可進(jìn)入，腦卒中后的免疫炎癥反應(yīng)被放大［47，50-51］。此外，活化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)（包括TNF-α 和IL-1β）不僅直接參與炎癥反應(yīng)，還可激活小膠質(zhì)細(xì)胞募集外周免疫細(xì)胞加劇炎癥反應(yīng)，分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶還可降解細(xì)胞外基質(zhì)，共同破壞血腦屏障的完整性，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡、梗死進(jìn)展，促進(jìn)SIID啟動(dòng)［52］。

然而，星形膠質(zhì)細(xì)胞同樣可為保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)減少炎癥損傷表達(dá)抗炎表型。腦梗死后72 h炎癥高峰期內(nèi)，占主導(dǎo)地位的是A2 型星形膠質(zhì)細(xì)胞。A2 型星形膠質(zhì)細(xì)胞可上調(diào)多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子并抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎癥細(xì)胞的擴(kuò)散［52］，充當(dāng)調(diào)節(jié)細(xì)胞分泌IL-2、IL-10和TGF-β 等抗炎細(xì)胞因子［53］，以及釋放具有神經(jīng)保護(hù)作用的脂毒素A4和脂毒素B4來(lái)抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)［54］，從而發(fā)揮保護(hù)作用。更直接的是，A2型星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦卒中期間增加了IL-33和CCL1水平，其中IL-33可促進(jìn)腦卒中后Treg 細(xì)胞的增殖［55］，直接促進(jìn)并參與SIID 的進(jìn)展。另外，星形膠質(zhì)細(xì)胞中的胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 能在缺血環(huán)境中將免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)向抗炎特征來(lái)保護(hù)腦卒中后血腦屏障完整性和神經(jīng)功能［56］。

星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞間的串?dāng)_對(duì)大腦的生理功能和疾病都至關(guān)重要［47］。星形膠質(zhì)細(xì)胞可間接調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的功能，通過(guò)抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，即可限制外周免疫細(xì)胞和某些細(xì)菌浸潤(rùn)血腦屏障，修復(fù)受損的血腦屏障。此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞還具有活躍的分泌能力，可以分泌如ORM2、前列腺素E2 等蛋白質(zhì)，用以調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的活性及血管張力，其中ORM2可在腦炎癥期間調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活性和遷移而發(fā)揮抗炎作用，是參與免疫抑制各個(gè)方面的急性期血漿蛋白［57-58］。有研究表明，在星形膠質(zhì)細(xì)胞存在條件下，體外小膠質(zhì)細(xì)胞中抗炎基因CX3CL1的表達(dá)可增加［59］。

綜上可知，星形膠質(zhì)細(xì)胞既參與了早期爆發(fā)的炎癥反應(yīng)，亦涉及眾多抗炎因子及其機(jī)制參與免疫抑制，對(duì)SIID 的啟動(dòng)及發(fā)展進(jìn)程具有相當(dāng)重要的作用。

2.4 小膠質(zhì)細(xì)胞在腦梗死早期破壞血腦屏障啟動(dòng)免疫反應(yīng)而在腦梗死晚期促進(jìn)并參與SIID

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐免疫活性巨噬細(xì)胞，具有吞噬能力，能清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的毒素和異物。小膠質(zhì)細(xì)胞活化是炎癥反應(yīng)的開(kāi)始，然后是外周免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和星形膠質(zhì)細(xì)胞活化［60］。在腦梗死的病理階段，內(nèi)源性小膠質(zhì)細(xì)胞和募集的巨噬細(xì)胞被激活后根據(jù)功能分為兩種表型:經(jīng)典的M1 型（促炎）或替代的M2 型（抗炎）表型［61］。

小膠質(zhì)細(xì)胞與星形膠質(zhì)細(xì)胞類(lèi)似，具有促進(jìn)或抑制腦梗死后炎癥的雙重免疫功能。一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞積極參與了缺血后血腦屏障的崩解，半暗帶內(nèi)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)擴(kuò)張的細(xì)胞突起向病灶周?chē)难苎由?，使血源性巨噬?xì)胞外滲，同時(shí)血管周?chē)男∧z質(zhì)細(xì)胞通過(guò)吞噬正常毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞導(dǎo)致局部?jī)?nèi)皮細(xì)胞被激活引起功能障礙，血管分解裂變，促進(jìn)健康鄰近組織中腦梗死誘導(dǎo)的損傷的遷移，最終導(dǎo)致血腦屏障被破壞及免疫細(xì)胞和分子滲入，反過(guò)來(lái)激活了更多的小膠質(zhì)細(xì)胞。另一方面，死亡的細(xì)胞釋放DAMP，激活小膠質(zhì)細(xì)胞啟動(dòng)NF-κB 易位到細(xì)胞核形成了NLRP3炎性體，明顯提高了IL-1β水平，增加了趨化因子CCL2、CCL20 和CXCL2 分泌，從而下調(diào)了SHH 蛋白表達(dá)，即導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞缺少了維持血腦屏障完整性的重要信號(hào)。M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞以誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和NF-κB 的激活為特征，產(chǎn)生活性氮增加了活性氧和一氧化氮，與促炎性細(xì)胞因子及趨化因子協(xié)同增加了氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)最初的全身免疫激活，促進(jìn)啟動(dòng)強(qiáng)烈而持久的免疫抑制［17，53］。

小膠質(zhì)細(xì)胞在腦梗死后期會(huì)發(fā)展出另一種保護(hù)性表型。腦梗死后NVU 恢復(fù)期間，M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)分泌IL-4、IL-10 和TGF-β，以及免疫細(xì)胞的吞噬功能促進(jìn)炎癥消退，阻止炎癥進(jìn)一步誘導(dǎo)血腦屏障崩解。IL-4 和IL-10 共同下調(diào)了γ干擾素、TNF-α和IL-1β的表達(dá)，并抑制NF-κB的活化，提高了缺血腦中抗炎因子的水平。TGF-β和IL-10 限制了免疫細(xì)胞對(duì)大腦的浸潤(rùn)，直接保護(hù)血腦屏障免受損害，有助于維持腦梗死中的血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能。其中，TGF-β 可降低基質(zhì)金屬蛋白酶活性、減少ECM 降解；IL-10 可降低毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中ICAM-1 和VCAM-1 的表達(dá)。此外，在與星形膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用方面，小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的IL-10 作用于反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，并在NVU 中釋放發(fā)揮積極保護(hù)作用的細(xì)胞因子［7］，還可通過(guò)下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞中CXCL1 的表達(dá)，減弱免疫炎癥細(xì)胞及因子的浸潤(rùn)［53，59］。

將小膠質(zhì)細(xì)胞和單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞更傾向于向M1 型過(guò)渡［62］，因此更多研究集中在小膠質(zhì)細(xì)胞的激活調(diào)節(jié)機(jī)制上，旨在將小膠質(zhì)細(xì)胞從M1 型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2 型，從而促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)作用［63］。因此，相比星形膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎作用似乎更為顯著，但通過(guò)與星形膠質(zhì)細(xì)胞的相互串?dāng)_，其促進(jìn)SIID 的啟動(dòng)和發(fā)展的貢獻(xiàn)方式復(fù)雜但不容忽視。

2.5 其他免疫調(diào)節(jié)性因素通過(guò)影響NVU 參與SIID

有證據(jù)表明，在腦梗死的慢性期，大腦特異性Treg 細(xì)胞可遷移至大腦中持續(xù)數(shù)月，并在此期間表現(xiàn)出多方面促進(jìn)功能恢復(fù)的作用。在腦卒中后的幾天內(nèi)，增殖的Treg 細(xì)胞中IL-2、IL-33 及5-羥色胺信號(hào)傳導(dǎo)提升，阻止梗死體積增加，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增生及轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)毒性表型（A1型），促進(jìn)腦功能恢復(fù)［64］。有研究證明，大腦中動(dòng)脈栓塞小鼠的腦Treg 細(xì)胞表達(dá)了高水平的雙調(diào)蛋白和骨橋蛋白，其中雙調(diào)蛋白可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6 以抑制炎癥，骨橋蛋白可通過(guò)小膠質(zhì)細(xì)胞上的整合素受體增強(qiáng)其介導(dǎo)的修復(fù)作用［65-66］?？偠灾陨习l(fā)現(xiàn)表明大腦Treg 細(xì)胞可以通過(guò)多種介質(zhì)在腦梗死期間影響NVU，參與SIID并發(fā)揮一定保護(hù)性作用。

腸神經(jīng)系統(tǒng)被稱(chēng)為人類(lèi)“第二腦”，也屬于自主神經(jīng)系統(tǒng)，在功能上胃腸道與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相互聯(lián)系，近年有報(bào)道代表大腦和腸道之間相互作用的“腸-腦軸”與腦梗死期間血腦屏障的破壞及腸道中T 細(xì)胞亞群的功能改變有關(guān)，即中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)與腸道免疫存在相關(guān)性。大腦急性梗死引起腸道微生物群失調(diào)后，T 淋巴細(xì)胞池的分化偏向于促炎亞群γδT 細(xì)胞（主要來(lái)源于腸道）并可遷移至腦。γδT 細(xì)胞是缺血腦中強(qiáng)效促炎性細(xì)胞因子IL-17A 的主要來(lái)源，減弱了T 淋巴細(xì)胞向Treg 細(xì)胞分化的傾向。但缺少腸道Treg細(xì)胞又難以抑制γδT 細(xì)胞增殖，外周免疫調(diào)節(jié)作用被嚴(yán)重削弱，具有神經(jīng)保護(hù)作用的抗炎細(xì)胞因子IL-10 分泌減少，成為促進(jìn)炎癥反應(yīng)過(guò)度啟動(dòng)SIID 的重要因素［53，67］。與其他患者比較，腦梗死患者的腸道多樣性顯著降低，產(chǎn)生氧化三甲胺的細(xì)菌、機(jī)會(huì)致病菌增加，其中氧化三甲胺可通過(guò)刺激線(xiàn)粒體產(chǎn)生活性氧，破壞毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞等NVU組成細(xì)胞，進(jìn)一步協(xié)同淋巴細(xì)胞對(duì)血腦屏障造成不良影響［68］，因此腸道微生物群的失調(diào)反過(guò)來(lái)亦可導(dǎo)致腦梗死結(jié)局惡化。在SIID 所致嚴(yán)重并發(fā)癥方面，有研究推測(cè)腦卒中相關(guān)性肺炎由腸道細(xì)菌易位引起，并在腦卒中相關(guān)性肺炎患者的肺部檢測(cè)到了腸道細(xì)菌［69］。綜上，基于腦梗死已延伸至中樞神經(jīng)系統(tǒng)外免疫器官的病理機(jī)制，靶向腸道微生物群在未來(lái)關(guān)聯(lián)SIID 治療腦梗死具有可觀的前景。

在NVU 中，多種細(xì)胞分泌的一些細(xì)胞因子還會(huì)導(dǎo)致ECM 組成和結(jié)構(gòu)完整性發(fā)生變化，從而影響血腦屏障的穩(wěn)定，而ECM 的破壞同樣也會(huì)影響這些細(xì)胞的功能。因此，NVU 中細(xì)胞與細(xì)胞之間，細(xì)胞與ECM 之間，細(xì)胞或ECM 與外周免疫環(huán)境之間在腦梗死后腦免疫炎癥反應(yīng)中的相互作用都有可能影響血腦屏障從而參與SIID。研究表明，NVU 中大部分組成細(xì)胞都可釋放和攝取外泌體，在介導(dǎo)NVU內(nèi)細(xì)胞間串?dāng)_方面具有重要作用，與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)及促炎作用的相關(guān)性提示了其與SIID 相關(guān)聯(lián)的治療潛力［7］；同理，腦缺血中長(zhǎng)鏈非編碼RNA失調(diào)可誘導(dǎo)神經(jīng)元死亡、小膠質(zhì)細(xì)胞活化、炎癥和神經(jīng)發(fā)生［70］，與NVU 在SIID 的作用也有一定的關(guān)聯(lián)性。

3 結(jié) 語(yǔ)

功能性NVU 是滿(mǎn)足大腦動(dòng)態(tài)代謝需求的核心，在腦梗死的病理生理過(guò)程中起著主導(dǎo)作用，對(duì)炎癥免疫反應(yīng)具有深遠(yuǎn)的影響。NVU 中多種免疫抑制細(xì)胞及分子的表達(dá)是對(duì)大腦中高度炎癥環(huán)境的反饋，長(zhǎng)遠(yuǎn)來(lái)看對(duì)患者預(yù)后弊遠(yuǎn)大于利，有效改善腦梗死后的炎癥可在免疫系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)間形成穩(wěn)態(tài)以防止SIID 的發(fā)生。基于腦梗死的治療現(xiàn)狀以及SIID 在腦梗死病理生理機(jī)制中的重要性，多種與SIID 關(guān)聯(lián)的預(yù)防性免疫調(diào)節(jié)療法逐漸出現(xiàn)，作為非傳統(tǒng)替代療法來(lái)減少感染。未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步結(jié)合NVU 研究腦梗死后炎癥免疫與SIID 的精確機(jī)制，探尋更多靶點(diǎn)與藥物，實(shí)現(xiàn)對(duì)免疫系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的雙重保護(hù)。

志謝 研究得到中國(guó)博士后科學(xué)基金（2022M712689）、江蘇省高等學(xué)校自然科學(xué)研究項(xiàng)目（22KJB180029）、揚(yáng)州市“綠揚(yáng)金鳳計(jì)劃”（22080700540）、江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃訓(xùn)練項(xiàng)目（202211117083Y）支持

Acknowledgements This study was supported by the Postdoctoral Science Foundation of China (2022M712689),Natural Science Research Project for Universities of Jiangsu Province (22KJB180029), Lyuyang Jinfeng Project of Yangzhou City (22080700540), Jiangsu University Students Innovation and Entrepreneurship Plan Training Project (202211117083Y)

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

Conflict of Interests The authors declare that there is no conflict of interests

?The author(s) 2023.This is an open access article under the CC BY-NC-ND 4.0 License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)