鄒優(yōu)花，連玲丹，鐘武杰，杜敏如，黃穎茵，王杰

（華南農業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642）

杏鮑菇（Pleurotus eryngii），學名為刺芹側耳菌。杏鮑菇因其獨特的口感和豐富的營養(yǎng)價值備受人們喜愛，它富含萜類、甾醇、多糖和多酚等生物活性成分[1]，具備藥用和功能性食品的特性，因此深受歡迎[2]。目前該產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展受到優(yōu)質種質供應不足的制約，成為其發(fā)展的核心難題。隨著市場需求的快速增長，對杏鮑菇優(yōu)良種源的需求愈發(fā)緊迫。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，利用遺傳轉化對食用菌進行定向遺傳改良也成為新品創(chuàng)制的主流方式[3]。目前在茶樹菇[4]、香菇[5]、金針菇[6]等食用菌中已成功利用原生質體遺傳轉化體系選育出優(yōu)良品種。原生質體遺傳轉化是以原生質體為基礎[7]，以優(yōu)質高產原生質體的制備與再生為前提，以穩(wěn)定有效的遺傳轉化方法為關鍵步驟。目前食用菌原生質體多集中于其制備與再生條件[8]，但劉莉等[9]發(fā)現將制備體系優(yōu)化后所得的原生質體用于遺傳轉化，卻得到較低轉化效率。因此，用于遺傳轉化的原生質體不僅要有高的產量和再生率，也要具備高轉化效率。

本研究以杏鮑菇菌株GIM5.344 為材料，通過對裂解酶、酶解溫度、酶解時間、再生培養(yǎng)基穩(wěn)滲劑種類4 個因素進行研究，優(yōu)化杏鮑菇原生質體的制備與再生條件。同時，通過對潮霉素濃度篩選和轉化方式的優(yōu)化，建立穩(wěn)定有效的杏鮑菇原生質體的遺傳轉化體系，以期為杏鮑菇的菌種改良和優(yōu)良品種選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇菌株GIM5.344、質粒4：華南農業(yè)大學食品學院王杰教授課題組構建；溶壁酶1（≥200 U/mg）：廣東省微生物研究所；溶壁酶2（≥200 U/mg）：北京索萊寶科技有限公司；纖維素酶（≥200 U/mg）、甘露醇、聚乙二醇4000、氯化鈣、順丁烯二酸、順丁烯二酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、硫酸鎂、氯化鈉：上海麥克林生化科技股份有限公司。所用化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-4 恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；5804R高速冷凍離心機：美國Sigma 公司；SPX-158L 生化培養(yǎng)箱：寧波萊?？萍加邢薰?；SPH-2102C 恒溫搖床：上海世平搖床廠；JY600C 電泳儀：北京君意東方設備有限公司；QuantityStudio3 熒光定量PCR 儀、Quantity-Studio3 熒光顯微鏡：美國Applied Biosystems 公司；SWCJ-1F 超凈工作臺：江蘇蘇州凈化公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

0.2 mol/L 馬來酸溶液：0.2 mol/L 順丁烯二酸和0.2 mol/L順丁烯二酸二鈉以1 ∶2 的體積比混合，調節(jié)pH 值至5.5，121 ℃，滅菌20 min。

甘露醇-馬來酸（mannitol-maleic acid，MM）緩沖液：0.6 mol/L 甘露醇溶液25 mL，0.2 mol/L 馬來酸溶液12.5 mL，去離子水12.5 mL，過濾除菌。

甘露醇-馬來酸-氯化鈣（mannitol-maleic acid-CaCl2buffer，MMC）緩沖液：0.6 mol/L 甘露醇溶液25 mL，0.2 mol/L 馬來酸溶液12.5 mL，1 mol/L CaCl2溶液1.25 mL，去離子水11.25 mL，過濾除菌。

STC 溶液：10.93 g 甘露醇，1 mol/L 三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽溶液（pH7.5）1 mL，1 mol/L CaCl2溶液2.5 mL，定容至100 mL，121 ℃，滅菌20 min。

1.3.2 原生質體的制備

活化培養(yǎng)：用接種鉤將保藏的杏鮑菇菌種轉接至馬鈴薯瓊脂葡萄糖培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）平板，在28 ℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)6 d。

液體培養(yǎng)：取PDA 平板上長的新菌絲，將菌絲接種至馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB）液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、150 r/min 搖床培養(yǎng)5 d。

恢復培養(yǎng)：待液體培養(yǎng)長出菌絲球后，用均質機將菌絲球打成細小碎片狀，取5～7 mL 勻漿碎片液體轉至100 mL 完全酵母培養(yǎng)基（complete yeast medium，CYM）中，在28 ℃培養(yǎng)箱靜置恢復4 d（每天手動搖勻2 次），等待破碎后的菌絲長出較嫩的絮狀菌絲即可作為原生質體制備的材料。

原生質體制備：菌絲過濾，稱取0.05 g 菌絲加入1 mL 裂解酶，將菌絲彈勻，于32 ℃水浴鍋水浴2.5 h，期間每隔10 min 顛倒混勻1 次，水浴結束后用塞有棉花的注射器過濾取得原生質體液，2 500 r/min、4 ℃離心20 min 后加500 μL MM 緩沖液和MMC 緩沖液各清洗1 次，最終加100 μL STC 重懸原生質體，用血球計數板在顯微鏡下計數。原生質體產量的計算公式如下。

P=C×4×106×N

式中：P 為原生質體產量，CFU/mL；C 為血球計數板上每個小方格的原生質體數，CFU/mL；N 為稀釋倍數。

1.3.3 不同裂解酶對原生質體制備的影響

固定酶解溫度為32 ℃、酶解時間為2.5 h，探究不同裂解酶（溶璧酶1、溶璧酶2、纖維素酶）對原生質體產量和再生率的影響。

1.3.4 不同酶解溫度對原生質體制備的影響

按照1.3.2 方法制備原生質體，篩選裂解酶，設置酶解溫度為28、30、32、34、36 ℃，過濾收集原生質體，用血球計數板計數，稀釋到最佳濃度后進行再生試驗，確定最佳酶解溫度。

1.3.5 不同酶解時間對原生質體的影響

固定最佳裂解酶為溶壁酶1，酶解溫度為32 ℃，設置酶解時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，按照1.3.2 的方法制備原生質體，分別收集原生質體并計數后稀釋至最佳濃度進行再生試驗。

1.3.6 原生質體再生

將原生質體稀釋成108CFU/mL，取100 μL 加入0.9 mL 的CYM 再生液體培養(yǎng)基，放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)16 h 后2 500 r/min、4 ℃離心20 min，去除上清液留取少量液體重懸原生質體后涂板于PDA再生培養(yǎng)基，培養(yǎng)7～10 d。再生率計算公式如下。

R=（C1/C2）×100

式中：R 為再生率，%；C1為原生質體再生單個菌落，CFU/mL；C2為原生質體個數，CFU/mL。

1.3.7 再生培養(yǎng)基穩(wěn)滲劑的篩選

固定原生質體制備裂解酶為溶壁酶1、酶解時間為2.5 h、酶解溫度為32 ℃、原生質體濃度為108CFU/mL、穩(wěn)滲劑濃度為0.6 mol/L，探究甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、硫酸鎂、氯化鈉對原生質體的影響，確定最佳再生培養(yǎng)基穩(wěn)滲劑。

1.3.8 原生質體轉化

原生質體轉化采用CaCl2-PEG 轉化法：杏鮑菇菌絲體32 ℃酶解2.5 h 后過濾，用1 mL MM 緩沖液在4 ℃、2 500 r/min、20 min 的條件下離心洗滌1 次，再用1 mL MMC 緩沖液同條件離心洗滌1 次，倒掉上清液，加100 μL STC 鏡檢，預估原生質體的數量，將原生質體稀釋至107CFU/mL，每管100 μL 原生質體加入10 μL質粒4[圖1，帶有潮霉素抗性基因（HygR）和綠色熒光蛋白基因（GFP）]和100 μL PEG 溶液，同時將不添加質粒的設為空白對照組，冰浴50 min。然后每管加入500 μL PEG 溶液，混合均勻后，于30 ℃水浴鍋水浴30 min，再加500 μL STC 緩沖液混勻后倒入再生培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

圖1 質粒4 圖譜Fig.1 Plasmid 4 diagram

1.3.9 潮霉素濃度的篩選

按照1.3.2 的方法制備出原生質體后，將原生質體稀釋至106CFU/mL 后吸取100 μL 分別涂布于0、2、4、6、8、10 μg/mL 的再生培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)10 d 后計數。

1.3.10 PEG 介導轉化杏鮑菇原生質體方法的篩選

PEG 介導轉化后的原生質體，按以下4 種方式進行培養(yǎng)和篩選擬轉化子。

方法1（直接涂布法）：將介導轉化后的原生質體懸液4 ℃、2 500 r/min 離心20 min，除去部分上清液，留取100 μL 原生質體懸液，直接涂布于30 μg/mL 潮霉素的抗性篩選平板上，靜置培養(yǎng)12 d。

方法2（液體預培養(yǎng)+涂布法）：在介導轉化后的原生質體中加入2 mL 液體再生培養(yǎng)基，預培養(yǎng)24 h 后離心去除部分上清液，留100 μL 原生質體懸液涂布于30 μg/mL 潮霉素的抗性篩選平板上，靜置培養(yǎng)11 d。

方法3（固體預培養(yǎng)+雙層培養(yǎng)基法）：將介導后的原生質體懸液倒入15 mL 無抗性再生培養(yǎng)基迅速混勻后倒板，28 ℃培養(yǎng)48 h 后再覆蓋一層30 μg/mL 潮霉素的抗性篩選培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)10 d。

方法4（液體預培養(yǎng)+雙層培養(yǎng)基法）：在介導轉化后的原生質體中加入2 mL 再生液體培養(yǎng)基，預培養(yǎng)48 h 后與含有30 μg/mL 潮霉素的抗性培養(yǎng)基混勻后倒板，靜置培養(yǎng)10 d。

為驗證轉化效率，從方法3 所得的擬轉化子中選取22 個提取其基因組，以潮霉素（hygromycin，Hyg）的700 bp 序列作為報告基因進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）。同時，從潮霉素抗性篩選平板上刮取少許菌絲涂布于蓋玻片中，以未導入表達載體的菌絲作為對照，在熒光顯微鏡下觀測綠色熒光蛋白基因的表達情況。

1.4 數據處理

采用Excel、Graphpad 8.0.2、IBM SPSS Statistic 20等軟件進行數據處理和相關性方差分析。

2 結果與討論

2.1 不同裂解酶對原生質體產量及再生情況的影響

細胞壁裂解酶是制備原生質體的關鍵因素，不同種類的真菌細胞壁的組成結構差異較大，因此,選用合適的裂解酶對杏鮑菇原生質體的產量和再生率很關鍵。不同裂解酶對原生質體產量及再生率的影響見表1。

表1 不同裂解酶對原生質體產量及再生情況的影響Table 1 Effect of different lytic enzymes on the protoplast yield and regeneration

由表1 可知，采用溶壁酶1 處理的原生質體產量最高，為7.00×108CFU/mL，為其他裂解酶產量的70～350 倍，且其再生率也顯著高于其他裂解酶的處理，為0.50%，纖維素酶的處理效果最差，原生質體產量低，且再生率為0%，與孫勇等[10]的研究結果相似。綜上，溶壁酶1 的處理效果最佳，這與陶庭磊[11]研究的茶樹花原生質體的制備條件優(yōu)化結果一致。

2.2 不同酶解溫度對原生質體產量及再生情況的影響

原生質體制備的酶解溫度既要利于原生質體的高產，又要防止原生質體被破壞。在一定溫度范圍內，酶解效率隨著溫度的升高而增加。但溫度過高不僅降低酶的裂解效率，而且會導致原生質體變性破裂，影響原生質體的產量和再生率[12]。不同溫度對原生質體制備產量及再生率的影響見圖2。

圖2 不同酶解溫度對原生質體產量和再生率影響情況Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on protoplast yield and regeneration rate

由圖2 可知，隨著溫度的升高，原生質體產量呈先上升后下降的趨勢，當溫度為30 ℃時，原生質體的產量達到最高，為1.51×108CFU /mL。再生率隨著溫度的升高總體呈先上升后下降的趨勢，在30 ℃時再生率最高，為0.40%。說明溫度過低或過高對原生質體的產量和再生率均有抑制作用，溫度可能通過影響裂解酶的活性來影響細胞壁裂解的效果和再生能力[13]。

2.3 不同酶解時間對原生質體產量及再生情況的影響

原生質體制備的酶解時間對原生質體的產量和再生率具有較大的影響。酶解時間過短，原生質體形成不完全產量過低，酶解時間過長，細胞壁被完全清除且原生質體膜受到損傷裂解，導致產量和再生率降低[14]。不同酶解時間對原生質體產量及再生率的影響見圖3。

圖3 不同酶解時間對原生質體產量和再生率的影響Fig.3 Effect of different enzymatic hydrolysis time on protoplast yield and regeneration rate

如圖3 所示，隨著酶解時間的延長，原生質體產量和再生率均呈先上升后下降的趨勢。在2.0 h 時，原生質體產量及再生率顯著高于其他酶解時間（P＜0.05），分別為1.25×108CFU /mL 和0.24%。酶解時間為2.5～3.5 h 時，原生質體的產量和再生率無顯著性差異，表明2.5 h 時可能為酶解時間的極限。郭成金等[15]研究表明破壁后細胞壁的部分殘余組分有助于原生質體的再生，若酶解時間過長將細胞壁殘余組分完全清除則導致原生質體自我修復能力下降，從而影響再生率[16-17]。因此后續(xù)試驗均選用酶解2.0 h 作為最佳酶解時間。

2.4 不同再生培養(yǎng)基穩(wěn)滲劑對原生質體再生率的影響

穩(wěn)滲劑的選擇對原生質體再生形成菌絲體至關重要。穩(wěn)滲劑可維持原生質體內外環(huán)境的穩(wěn)定，保證滲透壓的平衡，防止細胞膜的破裂或皺縮[12]。不同穩(wěn)滲劑對原生質體再生的影響見圖4。

由圖4 可知，甘露醇作為再生培養(yǎng)基穩(wěn)滲劑時，原生質體的再生率（0.20%）顯著高于其他穩(wěn)滲劑（P＜0.05）。這與陳敏等[18]的研究結果相似。以蔗糖和氯化鈉為穩(wěn)滲劑的培養(yǎng)基再生率為0%，說明這兩種穩(wěn)滲劑不利于原生質體的修復，郭成金等[15]在冬蟲夏草原生質體制備研究中也觀察到類似的結果。綜上，選擇甘露醇作為再生培養(yǎng)基的最優(yōu)穩(wěn)滲劑。

2.5 不同潮霉素濃度對原生質體再生的影響

潮霉素B 是一種氨基糖苷類抗生素，可阻止原核生物和真核生物的蛋白質合成。食用菌對潮霉素具有一定的抗性，通常采用高于致死濃度的潮霉素進行轉化子的篩選，因此，潮霉素在食用菌研究應用中常被作為一種抗性標記[19-20]。不同潮霉素濃度對原生質體再生的影響見圖5。

圖5 不同潮霉素濃度對原生質體再生的影響Fig.5 Effect of different hygromycin concentrations on protoplast regeneration

由圖5 可知，在未添加潮霉素的再生培養(yǎng)基（對照組A）上杏鮑菇原生質體的菌落數最多，約為200 CFU/mL，隨著潮霉素濃度的升高菌落數逐漸減少，在潮霉素濃度達到8 μg/mL 時，再無菌落生長，說明剛制備好的原生質體對潮霉素的敏感度較高。但在轉化的試驗中發(fā)現，PEG 介導降低了杏鮑菇原生質體對潮霉素的敏感性，將潮霉素濃度提高到30 μg/mL 時才能完全抑制再生平板上菌落的生長。因此，篩選轉化子的潮霉素濃度定為30 μg/mL。

2.6 PEG 介導轉化杏鮑菇原生質體

PEG 介導的轉化方法通過增強細胞膜的通透性以及促進外源DNA 與細胞內結構的互作，因此PEG對細胞具有一定的毒性作用，為了提高原生質體介導后細胞膜的修復從而提高原生質體的再生率，對介導后的4 種方式進行篩選，4 種方法處理后所得的擬轉化子數和菌落平板分別見圖6 和圖7。

圖6 PEG 介導轉化杏鮑菇原生質體4 種方法所得的擬轉化子數Fig.6 Number of putative transformants by four regeneration methods of Pleurotus eryngii protoplasts mediated by PEG

圖7 PEG 介導轉化杏鮑菇原生質體所得的擬轉化子Fig.7 Putative transformants obtained by PEG-mediated regeneration of Pleurotus eryngii protoplasts

如圖6 所示，4 種不同的PEG 介導轉化方法的擬轉化子數均有顯著性差異（P＜0.05），方法1～4 的擬轉化子數分別為83、132、338、192 CFU/mL，其中轉化方法3 的擬轉化子數最高，可能是因為方法3 對PEG 介導轉化后的原生質體傷害最小。原生質體在進行PEG介導轉化后其細胞膜受到不同程度的損傷[21]，介導轉化后進行離心，可能會提高原生質體膜的破損率，影響擬轉化子原生質體的再生，進而影響轉化率。剛介導轉化后的原生質體活性較低，若直接涂布于潮霉素抗性板上，將提高原生質體的致死率[9]，這樣也會降低轉化的效率。本研究中方法1 介導轉化后進行離心并直接涂布于潮霉素抗性篩選平板上，其原生質體的破損率高、活性低，因此所得到的擬轉化子數量最少。方法2中介導轉化后的原生質體在液體培養(yǎng)基中恢復24 h，然后再進行離心并涂布于抗性篩選板上，擬轉化子數比方法1 增加了59%，表明轉化介導過后的原生質體恢復培養(yǎng)24 h 有利于提高原生質體的活性。方法4 是將介導轉化后的原生質體恢復48 h 后，與含有潮霉素的培養(yǎng)基混合培養(yǎng)，其擬轉化子數比方法2 提高了45%，表明介導轉化后的原生質體恢復培養(yǎng)有利于提高轉化率[22]。方法3 將轉化介導后的原生質體倒入無抗的固體培養(yǎng)基中恢復2 d，比方法2 和方法4 中加入液體培養(yǎng)基恢復培養(yǎng)所得到的轉化子都高，因此，方法3 的轉化篩選方法最佳。

為了驗證方法3 的轉化效率，則隨機挑取23 個擬轉化子進行PCR 驗證和熒光顯微鏡驗證，擬轉化子驗證后的電泳膠圖見圖8，熒光蛋白檢測結果見圖9。

圖8 擬轉化子的PCR 驗證Fig.PCR validation diagram of putative transformants

圖9 綠色熒光蛋白檢測結果Fig.9 Green fluorescent protein test results

如圖8 所示，1～23 號轉化子中除了1 號和3 號，其他擬轉化子在1 000 bp 的位置均出現條帶，且以水和野生型為模板未出現條帶，說明選取的23 個擬轉化子中有21 個轉化子，由此說明轉化效率極高，可達到91%以上。

為了進一步驗證其轉化子的表達效率，挑選條帶最亮的19 號轉化子和對照組野生型菌絲進行熒光顯微鏡驗證，如圖9 所示，在藍色激發(fā)光下，可以看出對照組的菌絲在明場菌絲清晰可見，但在藍色激發(fā)光下完全看不到綠色熒光，而圖9 B2轉化子發(fā)出明亮清晰的綠色熒光，表明質粒4 表達載體已成功導入原生質體中并能夠穩(wěn)定表達[23]，證明所篩選的轉化方法3 能顯著提高轉化效率并能穩(wěn)定表達所導入的外源基因。

3 結論

本研究通過對杏鮑菇原生質體的制備與再生條件進行優(yōu)化，得到最佳的裂解酶為溶壁酶1，當酶解溫度為30 ℃、酶解時間為2 h、再生培養(yǎng)基的穩(wěn)滲劑為甘露醇時，原生質體的產量可達到7×108CFU/mL，再生率達到0.40%。得到轉化子最多的轉化方法為方法3固體預培養(yǎng)+雙層培養(yǎng)基法，所得轉化子中的綠色熒光蛋白基因能夠穩(wěn)定有效表達。