楊帆 張曉梅 閻炳 楊衛(wèi)海 孫靜文 李梓昱 黃玲利張鴻偉*, 徐杰*

1（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，青島266520）

2（青島海關(guān)技術(shù)中心，青島 266109）

3（青島海關(guān)，青島 266002）

4（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院、動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070）

吸蟲(chóng)病是牛和羊等食草動(dòng)物嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)病之一，也是人畜共患的寄生蟲(chóng)病[1]，給牲畜和人類(lèi)健康帶來(lái)巨大威脅，也會(huì)對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。在牛羊吸蟲(chóng)病的防治中，氯氰碘柳胺[3]、硝碘酚腈[4]、碘醚柳胺[5]和三氯苯達(dá)唑[6]為常用廣譜驅(qū)蟲(chóng)藥，對(duì)多種吸蟲(chóng)病有良好療效[7]?？刮x(chóng)藥在我國(guó)牛羊養(yǎng)殖中普遍使用[8]，但在停藥期的不合理使用、動(dòng)物產(chǎn)品生產(chǎn)加工不規(guī)范和環(huán)境污染等情況下[9]，容易導(dǎo)致該類(lèi)藥物在牛羊乳中的殘留[10]。目前研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)抗吸蟲(chóng)藥具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，而奶粉是牛羊乳的主要加工制品[11]，長(zhǎng)期食用含有抗吸蟲(chóng)藥物殘留的奶粉易導(dǎo)致人體產(chǎn)生抗藥性，給消費(fèi)者帶來(lái)健康隱患[12]。當(dāng)前，中國(guó)（GB 31650-2019）[13]和歐盟（EU（No）37/2010）[14]針對(duì)乳品中常見(jiàn)抗吸蟲(chóng)類(lèi)藥物均制定了最大殘留限量（Maximum residue limits，MRLs），范圍在10～45 μg/kg 之間，相關(guān)藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和化學(xué)信息見(jiàn)圖1。

圖1 氯氰碘柳胺（A）、硝碘酚腈（B）、碘醚柳胺（C）、三氯苯達(dá)唑（D）和三氯苯達(dá)唑酮（E）的化學(xué)結(jié)構(gòu)和理化參數(shù)Fig.1 Chemical structures and physicochemical parameters of closantel (A),nitroxinil (B),rafoxanide (C),triclabendazole (D) and ketotriclabnedazole (E)

目前，我國(guó)尚未建立涵蓋奶粉基質(zhì)的抗吸蟲(chóng)藥物殘留檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，因此，建立靈敏可靠的分析方法具有現(xiàn)實(shí)緊迫性。相比普通液體乳，奶粉基質(zhì)組成更為復(fù)雜[15]，因此測(cè)定分析時(shí)，樣品的前處理凈化步驟顯得尤為關(guān)鍵[16]。常用于抗吸蟲(chóng)藥物殘留測(cè)定的前處理凈化方法有液-液萃取法[17]、固相萃取法[18]和QuEChERS 法[19]等，其中，固相萃取法和QuEChERS 法具有回收率高[20]、溶劑使用量少、操作簡(jiǎn)便、方法重現(xiàn)性好和易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用較多的前處理凈化方法[21]。常用于抗吸蟲(chóng)藥物殘留測(cè)定的分析方法有紫外-可見(jiàn)分光光度法[22]、膠體金免疫層析法[23]、薄層色譜法[24]、高效液相色譜法[25]、液相色譜熒光檢測(cè)法[26]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[27]等。其中，HPLC-MS/MS 法具有選擇性好[28]、靈敏度高[29]和定性與定量分析準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)[30]，是目前抗吸蟲(chóng)藥物殘留的主要分析技術(shù)[31]，但檢測(cè)樣品多集中于液態(tài)牛羊奶產(chǎn)品，如Devreese 等[32]基于固相萃取凈化建立了HPLC-MS/MS 測(cè)定液態(tài)牛羊奶中氯氰碘柳胺殘留的方法，檢出限為10 μg/kg；李小橋[33]等基于液液萃取建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)定液態(tài)牛奶基質(zhì)中三氯苯達(dá)唑及其代謝物三氯苯達(dá)唑酮?dú)埩舻姆椒?，檢出限為1 μg/kg。目前，針對(duì)奶粉基質(zhì)的相關(guān)高通量檢測(cè)方法研究仍鮮有報(bào)道。

本研究基于UHPLC-MS/MS，針對(duì)牛奶粉中常見(jiàn)抗吸蟲(chóng)藥物（氯氰碘柳胺、硝碘酚腈、碘醚柳胺、三氯苯達(dá)唑及其代謝物三氯苯達(dá)唑酮）前處理凈化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，考察了多種商業(yè)化凈化材料（包括Captiva EMR-lipid 固相萃取柱、Captiva ND lipids 固相萃取柱、Cleanert LipoNo 除脂管和QuEChERS 凈化管）的使用效果，并優(yōu)化了色譜分離條件和質(zhì)譜分析參數(shù)，建立了適用于檢測(cè)奶粉中抗吸蟲(chóng)藥物殘留的高通量分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

APUS PLUS 超高壓液相色譜儀（珂睿公司）；Triple Quad 6500+三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó)SCIEX 公司）；CR22N 型高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司）；Turbo Vap?LV 型高通量水浴氮吹濃縮儀（美國(guó)Caliper 公司）。

乙腈和甲醇（質(zhì)譜純，德國(guó)Merck 公司）；甲酸（質(zhì)譜純，美國(guó)Fluka 公司）；甲酸銨（質(zhì)譜純，德國(guó)Sigma 公司）；氨水、NaCl 和無(wú)水MgSO4（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。Captiva EMR-lipid 固相萃取柱（3 mL/300 mg，美國(guó)Agilent 公司）和Captiva ND lipids 固相萃取柱（3 mL/60 mg，美國(guó)Agilent 公司）；Cleanert LipoNo 除脂管（15 mL，天津博納艾杰爾公司）；N-丙基乙二胺（Primary secondary amine，PSA）和十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，美國(guó)Agilent 公司）。實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率≥18.2 MΩ·cm）。

氯氰碘柳胺（CAS 登錄號(hào)：57808-65-8，純度98.1%）和硝碘酚腈（CAS 登錄號(hào)：1689-89-0，純度98.8%）購(gòu)于德國(guó)Dr.Ehrenstorfer 公司；碘醚柳胺（CAS 登錄號(hào)：22662-39-1，純度96.0%）和三氯苯達(dá)唑酮（CAS 登錄號(hào)：1201920-88-8，純度99.4%）購(gòu)于加拿大Toronto Research Chemicals 公司；三氯苯達(dá)唑（CAS 登錄號(hào)：68786-66-3，純度98.8%）購(gòu)于英國(guó)Laboratory of the Government Chemist 公司。分別稱(chēng)取10 mg 標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶解并定容至10 mL，制備1 g/L 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于–20 ℃保存?zhèn)溆茫ù藯l件下可保存6 個(gè)月）。分別移取100 μL 相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL 容量瓶中，用乙腈定容，制備成混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（10 mg/L），于–20 ℃保存?zhèn)溆茫ù藯l件下可保存1 個(gè)月）?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作液（1 mg/L）用乙腈-水（7∶3，V/V）溶液配制，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 樣品前處理

稱(chēng)?。?.00±0.02）g 牛奶粉于離心管中，用4 mL 水溶解，混勻，加入16 mL 冰乙腈（將乙腈于–20 ℃預(yù)冷3 h），渦旋振蕩10 min，以10000 r/min 離心10 min，取上清液備用。

Captiva ND 法凈化流程 取10 mL 備用上清液于離心管中，加2 g NaCl，渦旋振蕩10 min，以10000 r/min 離心10 min，取5 mL 上清液，于40 ℃下氮吹至近3 mL，過(guò)Captiva ND lipids 固相萃取柱并抽干，收集濾出液，氮吹至近干。

Captiva EMR 法凈化流程 取5 mL 備用上清液，過(guò)Captiva EMR lipid 固相萃取柱并抽干，再用2 mL乙腈洗脫，收集全部濾出液，于40 ℃下氮吹至近干。

Cleanert LipoNo 法凈化流程 向上清液中加入2 g 無(wú)水MgSO4和0.5 g NaCl，渦旋振蕩5 min，以5000 r/min 離心3 min，取5 mL 上清液于Cleanert LipoNo 除脂萃取管中，渦旋振蕩5 min，以5000 r/min離心3 min，取2.5 mL 上清溶液，于40 ℃下氮吹至近干。

QuEChERS 法凈化流程 向離心管中加入4 g MgSO4和1 g NaCl，渦旋振蕩3 min，以10000 r/min 離心5 min，取8 mL 上清液轉(zhuǎn)移至裝有凈化劑的離心管（含50 mg PSA 和150 mg C18）中，渦旋振蕩5 min，以10000 r/min 離心5 min，取5 mL 上清溶液，于40 ℃下氮吹至近干。

將以上4 種氮吹至近干的提取殘?jiān)?00 μL 乙腈-水（7:3，V/V）溶液復(fù)溶，渦旋并超聲1 min，15000 r/min 離心10 min，取上清液進(jìn)行UHPLC-MS/MS 測(cè)定。

1.3 儀器條件

色譜條件 Waters CORTECS UPLC C18色譜柱（50 mm×3.0 mm，1.6 μm）。流動(dòng)相A 為5 mmol/L 甲酸銨溶液，流動(dòng)相B 為乙腈。梯度洗脫程序：0～0.1 min，15%B；0.1～2.2 min，15%～100%B；2.2～4.0 min，100%B；4.0～4.2 min，100%～15%B；4.2～5.5 min，15%B。自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：15 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL；柱溫：30 ℃。

質(zhì)譜條件 電噴霧電離（ESI）采用負(fù)離子模式；離子化電壓：–4500 V；氣化溫度：575 ℃；氣簾氣壓力：45.0 kPa（N2）；噴霧氣壓力：45 kPa（N2）；輔助加熱氣壓力：65 kPa（N2）；碰撞氣：Medium（N2）；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式。

目標(biāo)分析物的色譜-質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 抗吸蟲(chóng)藥物的化學(xué)信息及相關(guān)分析參數(shù)Table 1 Chemical information and analytical parameters of anthelmintics

1.4 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME）的計(jì)算方法：ME=基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率。若ME <0.8，說(shuō)明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)；若ME >1.2，說(shuō)明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；若0.8

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

奶粉基質(zhì)成分復(fù)雜，含有大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物等大分子，還可能含有低聚糖、不飽和脂肪酸和微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分，在前處理過(guò)程中需將這些干擾物有效去除。根據(jù)目標(biāo)分析物的極性特點(diǎn)，選用提取后不通過(guò)乳化作用即可沉降蛋白質(zhì)的乙腈作為提取溶劑。在低溫條件下，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，不易與目標(biāo)分析物結(jié)合而形成共沉淀，因此，采用預(yù)冷的冰乙腈可以有效去除蛋白質(zhì)。

為更好地提升方法的分析性能和檢測(cè)通量，本研究針對(duì)牛奶粉基質(zhì)的特點(diǎn)和目標(biāo)分析物的理化性質(zhì)，考察了4 種快速凈化固相萃取材料（Captiva ND lipids 固相萃取柱、Captiva EMR lipids 固相萃取柱、Cleanert LipoNo 除脂管和QuEChERS 凈化管）對(duì)空白奶粉基質(zhì)添加目標(biāo)分析物（10 μg/kg）的回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同凈化方法對(duì)空白基質(zhì)添加（10 μg/kg）5 種目標(biāo)分析物回收率的影響（n=3）Fig.2 Effects of different clean-up methods on spiking recoveries of 5 kinds of analytes at spiking concentration level of 10 μg/kg (n=3)

采用Cleanert LipoNo 除脂萃取管和Captiva ND lipids 固相萃取柱時(shí)，Closantel 和Rafoxanide 的回收率較低，推測(cè)其主要是因?yàn)镃losantel 和Rafoxanide 的分配系數(shù)較大，具有較強(qiáng)的非極性，在相應(yīng)填料上形成了非選擇性吸附而不易被洗脫。相比之下，基于QuEChERS 法和Captiva EMR lipids 固相萃取柱凈化的方法針對(duì)5 種目標(biāo)分析物都具有比較好的回收率，并且在空白奶粉基質(zhì)中添加（10 μg/kg）回收率的差異性不顯著（p>0.05）。其中，QuEChERS 法采用的填料為PSA 和C18，PSA 具有較強(qiáng)的離子交換能力，常用于吸附糖和色素等添加劑，C18常用于吸附脂肪等含長(zhǎng)碳鏈的中等極性到非極性的化合物，因此吸附奶粉基質(zhì)組分的能力較強(qiáng)，而碳鏈較短的目標(biāo)分析物可以更好地被洗脫，因此整體回收率較高。Captiva EMR lipids 固相萃取柱是基于體積排阻和疏水相互作用機(jī)制去除脂質(zhì)，在有效去除奶粉基質(zhì)中磷脂的同時(shí)，可最大程度地減少離子抑制對(duì)目標(biāo)分析物的影響，整體回收率也較好。對(duì)比QuEChERS 法，EMR 法采用濾過(guò)式凈化方式可有效縮短前處理時(shí)長(zhǎng)，并且產(chǎn)生的廢物較少。綜合考慮回收率、處理通量和環(huán)境友好等因素，本研究最終選用Captiva EMR lipids 固相萃取柱作為凈化材料。此外，根據(jù)目標(biāo)分析物的極性，優(yōu)化了定容溶劑的組成，最終選用乙腈-水（7∶3，V/V）作為定容溶劑。

2.2 儀器分析條件的優(yōu)化

由于目標(biāo)分析物同時(shí)含有氨基和氯離子，因此，目標(biāo)物在電噴霧電離負(fù)離子模式（ESI-）和正離子模式（ESI+）下均可以進(jìn)行離子化，結(jié)果表明，ESI-模式下各目標(biāo)分析物的電離效果較好，同時(shí)考慮到ESI-的背景響應(yīng)低，因此選擇ESI-條件進(jìn)行測(cè)定。采用混合標(biāo)準(zhǔn)工作液優(yōu)選各目標(biāo)化合物的碎片離子、優(yōu)化碰撞能量和去簇電壓等質(zhì)譜參數(shù)（表1）。本研究選用CORTECS UPLC C18色譜柱（50 mm×3.0 mm，1.6 μm），該柱分離效能好，在適中pH 值范圍內(nèi)可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的酸、堿和中性化合物保留，短柱長(zhǎng)有利于提升檢測(cè)通量。本研究選用乙腈-水流動(dòng)相體系，并在水相中加入5 mmol/L 甲酸銨改善峰形，以減小拖尾和雙峰現(xiàn)象，通過(guò)優(yōu)化梯度洗脫條件，可在5.5 min 內(nèi)完成目標(biāo)分析物的1 個(gè)測(cè)定循環(huán)。

在優(yōu)化的色譜-質(zhì)譜參數(shù)（表1）條件下，5 種目標(biāo)分析物在空白基質(zhì)溶液中和基質(zhì)匹配定量限水平（2.5 μg/kg）標(biāo)準(zhǔn)溶液中的提取離子流圖見(jiàn)圖3A 和3B，在目標(biāo)分析物的保留時(shí)間窗口內(nèi)，基線豐度得到了有效控制。

圖3 （A）空白基質(zhì)溶液和（B）2.5 μg/kg 基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液中5 種目標(biāo)分析物的提取離子流圖Fig.3 Extracted ion chromatograms of 5 kinds of analytes in(A)matrix blank solution and(B)matrix-matched standard solution (2.5 μg/kg)

2.3 方法驗(yàn)證

2.3.1 方法的基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍、檢出限和定量限

使用已經(jīng)過(guò)確證不含5 種目標(biāo)分析物的市售奶粉樣品作為本研究的空白基質(zhì)。采用此空白基質(zhì)繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制濃度水平分別為1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 和100.0 μg/L 的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)分析物濃度為橫坐標(biāo)、定量離子提取離子流色譜峰面積為縱坐標(biāo)，最小二乘法回歸分析擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到各目標(biāo)分析物的回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r）。以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算3 倍信噪比（S/N=3）時(shí)的添加濃度為方法檢出限（Limit of detection，LOD），10 倍信噪比（S/N=10）時(shí)的添加濃度為定量限（Limit of quantification，LOQ），結(jié)果表明，各目標(biāo)分析物的LOQ 遠(yuǎn)小于其各自的MRLs（表2）。

表2 5種目標(biāo)分析物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Linear equations,coefficients of correlation (r),limits of detection (LODs),limits of quantification (LOQs) and matrix effects (MEs) of 5 kinds of analytes

對(duì)基質(zhì)效應(yīng)（MEs）的評(píng)估結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可見(jiàn)，本方法對(duì)各目標(biāo)分析物存在一定程度的基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)（1.2

2.3.2 回收率與精密度

本研究采用基質(zhì)空白添加進(jìn)行回收率與精密度實(shí)驗(yàn)。選擇空白牛奶粉樣品，依據(jù)5 種目標(biāo)分析物的MRLs，選擇3 個(gè)添加水平（5.0、50.0 和80.0 μg/kg），按照1.3 節(jié)所述的前處理步驟，相當(dāng)于目標(biāo)分析物的濃度水平為5.0、50.0 和80.0 μg/L。每個(gè)水平于同日做6 個(gè)平行，計(jì)算實(shí)際測(cè)定值、回收率和日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Intra-relative standard deviations，Intra-RSDs），每隔2 天重復(fù)1 次前述實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3 次，計(jì)算日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Inter-RSDs）。本研究的平均回收率和RSD 結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 奶粉樣品中5種目標(biāo)分析物的加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of 5 kinds of analytes spiked in milk powder samples (n=6)

由表3 可知，目標(biāo)分析物的平均回收率為93.2%～105.3%，日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～8.9%，日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～9.3%。在提取效率確定的情況下，影響方法回收率和精密度等關(guān)鍵性能指標(biāo)的主要因素為樣品的前處理過(guò)程，本研究結(jié)果表明，本方法在保證高檢測(cè)通量（快速凈化）的同時(shí)也能保證性能指標(biāo)的穩(wěn)定。

2.4 方法的應(yīng)用及穩(wěn)健性評(píng)估

采用本方法對(duì)30 份市售牛奶粉產(chǎn)品（10 個(gè)品牌的1、2、3 段奶粉）進(jìn)行以上5 種目標(biāo)化合物的檢測(cè)，未在樣品中檢出抗吸蟲(chóng)藥物殘留。

為驗(yàn)證本方法的穩(wěn)健性，對(duì)30 份不同日期不同分析批次的內(nèi)部質(zhì)控樣品（在定量限水平進(jìn)行空白基質(zhì)添加的樣品）進(jìn)行平行測(cè)定（n=3）分析，回收率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)電子版文后支持信息圖S1。結(jié)果表明，5 種目標(biāo)分析物的質(zhì)控結(jié)果均未超出各自的1 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍，說(shuō)明本方法的穩(wěn)健性良好。

3 結(jié)論

本研究針對(duì)牛奶粉中常用抗吸蟲(chóng)藥物殘留，基于通過(guò)式固相萃取凈化的方式建立了高通量UHPLCMS/MS 測(cè)定分析方法。本方法的提取步驟簡(jiǎn)單、快速，凈化方法可以有效控制牛奶粉的基質(zhì)效應(yīng)，儀器分析時(shí)長(zhǎng)控制在5.5 min 內(nèi)，大幅提高了樣品的分析通量。5 種常用抗吸蟲(chóng)藥及其代謝物的方法定量限為2.61～4.95 μg/kg，日間精密度為2.8%～9.3%，指標(biāo)滿足相關(guān)藥物的檢測(cè)監(jiān)測(cè)分析要求，可用于奶粉中相關(guān)藥物殘留的監(jiān)控與監(jiān)測(cè)以及日常檢測(cè)。

支持信息

Supporting Information

圖S1 30 批次質(zhì)控奶粉樣品中5 種目標(biāo)分析物的定量測(cè)定質(zhì)控圖：（A）氯氰碘柳胺；（B）硝碘酚腈；（C）碘醚柳胺；（D）三氯苯達(dá)唑；（E）三氯苯達(dá)唑酮Fig S1 Quality control charts of 5 kinds of analyts in quality control samples within 30 different analysis batches: (A) Closantel;(B) Nitroxinil;(C) Rafoxanide;(D) Triclabendazole;(E) Ketotriclabnedazole