王海貞, 劉 昕

1呂梁學(xué)院生命科學(xué)系, 山西 呂梁 033000; 2中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東 廣州 510275

青藏高寒牧區(qū)草場(chǎng)的高寒草甸是青藏高原地區(qū)面積最大的生態(tài)系統(tǒng),是國(guó)家生態(tài)安全屏障,也是牧民農(nóng)牧業(yè)賴以生存的自然資源。據(jù)報(bào)道,青藏高寒牧區(qū)草場(chǎng)的草原毛蟲GynaephoraqinghaiensisChou et Ying危害嚴(yán)重,蟲害暴發(fā)時(shí)每平方米可達(dá)上千條,往往牧草剛返青就被啃食殆盡(范小建, 2011)。在草原毛蟲危害嚴(yán)重的年份,采用化學(xué)農(nóng)藥大面積捕殺成為主要方法,嚴(yán)重破壞了青藏高寒牧區(qū)的生態(tài)平衡,且加劇了農(nóng)藥殘留污染。因此,尋找適合的可對(duì)草原毛蟲進(jìn)行生物防治的寄生天敵昆蟲,研究草原毛蟲的生物防治方法,是實(shí)現(xiàn)綠色、環(huán)保、無公害、可持續(xù)控制草原毛蟲蟲害的有效途徑,對(duì)保護(hù)青藏高寒牧區(qū)草甸生態(tài)環(huán)境、促進(jìn)高寒牧區(qū)農(nóng)牧業(yè)健康有序發(fā)展具有重要意義。

三江源草原毛蟲金小蜂PteromalussanjiangyuanicusYang是王海貞(2020)在草原毛蟲蛹期采集到的一種寄生蜂,后經(jīng)過楊忠岐等(2020)從形態(tài)學(xué)水平鑒定為金小蜂科的一種新種。研究表明,三江源草原毛蟲金小蜂對(duì)寄主草原毛蟲蛹的自然寄生率較高,且出蜂量較大,是草原毛蟲蛹期的優(yōu)勢(shì)寄生天敵昆蟲,可作為擴(kuò)繁的天敵昆蟲對(duì)草原毛蟲進(jìn)行生物防治(王海貞,2020)。但是作為金小蜂科的一種新種,分子標(biāo)記水平的物種鑒定還未完成,以及在進(jìn)化過程中系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系目前還不清楚,不利于這個(gè)新物種分類學(xué)及遺傳結(jié)構(gòu)的深入研究,制約了其對(duì)草原毛蟲生物防治潛能的挖掘。

線粒體DNA (mitochondria DNA, mtDNA)是一種群體遺傳學(xué)研究常用的分子標(biāo)記(王玲等,2018; 殷玉生等,2012; 張桂芬等,2014; 張莉麗等,2016; Oleksiyetal.,2022),具有進(jìn)化速度快、母系遺傳、基因重組缺失以及易于擴(kuò)增等特點(diǎn)(Djebbietal.,2018; Palrajuetal.,2018; Wangetal.,2021),是國(guó)際公認(rèn)的廣泛應(yīng)用于昆蟲種類鑒別的分子生物學(xué)技術(shù)之一(Janzenetal.,2017; Zhengetal.,2019)。目前,昆蟲線粒體基因研究中結(jié)構(gòu)與功能研究較為深入的是線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)基因,在傳粉小蜂Wiebesiapumilae(Hill)(吳文珊等,2013)、榕小蜂Eupristinasp.(陳友鈴等,2013)、赤眼蜂Trichogrammasp.(李虹兵等,2018)等多種寄生蜂的遺傳多樣性及種群結(jié)構(gòu)中廣為應(yīng)用。

本研究基于線粒體COⅠ基因,采用分子生物學(xué)手段對(duì)三江源草原毛蟲金小蜂進(jìn)行物種輔助鑒定,并通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,探索三江源草原毛蟲金小蜂的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,為支持三江源草原毛蟲金小蜂的形態(tài)學(xué)物種鑒定結(jié)果,以及深入研究三江源草原毛蟲金小蜂的系統(tǒng)發(fā)育提供了科學(xué)依據(jù),對(duì)草原毛蟲的生物防治具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

本研究所用的三江源草原毛蟲金小蜂樣品采集自青海省玉樹州治多縣海拔4580 m高寒草甸的草原毛蟲蛹內(nèi),并浸泡于非凍型DNA組織保存液(天恩澤)中,4 ℃保存,用于樣品總DNA的提取。

1.2 總DNA提取與檢測(cè)

三江源草原毛蟲金小蜂總DNA的提取參照基因組DNA提取試劑盒說明書(Axygen)進(jìn)行。采用Nanodrop 2000分光光度計(jì) (Thermo Fisher Scientific)檢測(cè)樣品DNA的濃度和純度。如果提取的樣品DNA濃度過高,在進(jìn)行PCR試驗(yàn)前需對(duì)樣品DNA進(jìn)行稀釋。

1.3 COⅠ基因擴(kuò)增反應(yīng)

三江源草原毛蟲金小蜂線粒體COⅠ基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)參照小蜂總科COⅠ基因通用引物(吳文珊等,2013),上游引物序列為5′-CAACATTTATTTTGATTTTTTGG-3′,下游引物為5′-TCCAATGCACTAATCTGCCATATTA-3′。PCR反應(yīng)的總體積為50 μL,其中含有4 μL DNA模板(40 ng·μL-1),各2 μL雙向引物(10 μmol·L-1),5 μL 10×rTaqBuffer (20 mmol·L-1Mg2+),4 μL dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1),0.25 μL rTaqDNA 聚合酶(5 U·μL-1),32.75 μL ddH2O;PCR擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性3 min, 94 ℃變性45 s,53 ℃退火1 min,72 ℃延伸 1 min,35 個(gè)熱循環(huán),最后在72 ℃延伸7 min。 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳進(jìn)行驗(yàn)證,并挑選擴(kuò)增效果較好的樣品,委托華大基因科技有限公司進(jìn)行正反鏈雙向測(cè)序。

1.4 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

1.4.1 COⅠ基因序列拼接及堿基組成分析 利用Seqman軟件對(duì)測(cè)序所得的三江源草原毛蟲金小蜂線粒體COⅠ基因正反向序列進(jìn)行拼接,刪除頭尾載體序列,通過觀察測(cè)序峰圖校正可疑位點(diǎn),然后將拼接完成后的序列保存為Fasta格式的文件,并對(duì)拼接后的基因序列堿基組成進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.2 基于COⅠ基因的物種分子鑒定與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹物種選擇 本研究將測(cè)序得到的COⅠ基因序列在NCBI中Nucleotide BLAST (basic local alignment search tool)進(jìn)行序列比對(duì),根據(jù)比對(duì)序列的相似度,進(jìn)行物種分子鑒定。同時(shí),挑選與三江源草原毛蟲金小蜂線粒體COⅠ基因序列相似度較高且具有科、屬代表性的膜翅Hymenoptera小蜂總科Chalcidoidea寄生蜂(共5科9屬11種)用于遺傳關(guān)系的分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建(表1)。選取的COⅠ基因序列通過登錄號(hào)從GenBank中下載,并保存為Fasta格式文件,用于物種間基因序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析。

表1 GenBank中收錄的11種寄生蜂COⅠ基因信息Table 1 Information of COⅠ gene of eleven parasitic wasps from GenBank

1.4.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 應(yīng)用Mega 6.0軟件,基于Kimura 2-paramter模型,計(jì)算物種間的遺傳距離;通過鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育N-J樹,采用自舉法(bootstrap)重復(fù)抽樣1000次檢驗(yàn)系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度(Tamuraetal.,2013)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因序列分析與物種分子鑒定

獲得的三江源草原毛蟲金小蜂線粒體COⅠ基因正向序列長(zhǎng)度為847 bp,反向序列長(zhǎng)度為845 bp。采用Seqman軟件對(duì)正反向序列進(jìn)行拼接組裝,得到校正后的COⅠ基因序列長(zhǎng)度為812 bp,A、T、C、G堿基含量分別為34.36%、42.61%、10.59%、12.44%,AT含量達(dá)76.97%,GC含量達(dá)23.03%,AT含量顯著高于GC含量,具有明顯的AT偏好性。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast結(jié)果顯示,三江源草原毛蟲金小蜂與蝶蛹金小蜂Pteromaluspuparum(L.) COⅠ基因相似度最高,為91.12%。

2.2 遺傳距離分析

遺傳距離分析結(jié)果如表2所示,三江源草原毛蟲金小蜂與蝶蛹金小蜂遺傳距離最小,為0.060,與Apocryptasp.遺傳距離最大,為2.760,表明進(jìn)化過程中三江源草原毛蟲金小蜂與蝶蛹金小蜂親緣關(guān)系最近,與Apocryptasp.親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表2 基于小蜂總科比對(duì)物種COⅠ基因遺傳距離矩陣Table 2 The matrix of genetic distance for COⅠ gene of comparing Chalcidoidea species

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

系統(tǒng)發(fā)育N-J樹(圖1)顯示,Aphelinidae sp.PC124、Aphelinidae sp.、Apocryptasp. PC123這3個(gè)物種先后聚為一支,并從小蜂總科其他物種中分離出來,表明這3個(gè)物種與其他物種在進(jìn)化上不屬于一個(gè)分類階層;三江源草原毛蟲金小蜂先后與Eupelmussp.、Sycoscaptersp.、Idiomacromerussp.、Diaziellabizarre、Eurytomasp.聚為一支,且與Idiomacromerussp.+ (Diaziellabizarre+Eurytomasp.) + (Eupelmussp.+Sycoscaptersp.)形成姊妹群。

圖1 基于COⅠ基因構(gòu)建的三江源草原毛蟲金小蜂系統(tǒng)發(fā)育N-J樹Fig.1 Phylogenetic N-J tree of P. sanjiangyuanicus based on COⅠ gene

3 討論與結(jié)論

寄生天敵昆蟲種類鑒定是害蟲生物防控的前提,而建立在形態(tài)學(xué)特征觀察基礎(chǔ)上的物種鑒定,通常情況下會(huì)因?yàn)橛^察者的主觀性而導(dǎo)致物種鑒定不準(zhǔn)確,同時(shí),傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒別技術(shù)需要由專業(yè)的高技術(shù)人員識(shí)別,而且受樣本保存情況、樣品發(fā)育階段、細(xì)微差異的近緣種等因素的限制(盧西西等,2022)。隨著DNA條形碼技術(shù)在昆蟲分類學(xué)中的應(yīng)用,利用形態(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)相結(jié)合的技術(shù)逐漸取代了單一依靠形態(tài)學(xué)觀察的物種鑒定方法,為物種鑒定提供了更加全面的證據(jù),也為發(fā)現(xiàn)隱存種、新物種提供了新的依據(jù)(Ogden &Lindsay,2016)。本研究在前期已經(jīng)對(duì)從草原毛蟲蛹中采集到的寄生蜂進(jìn)行了形態(tài)學(xué)物種鑒定,并認(rèn)為是金小蜂科的新種——三江源草原毛蟲金小蜂(楊忠岐等,2020),但未對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)物種輔助鑒定。為了使鑒定結(jié)果更加科學(xué)準(zhǔn)確,本研究采用COⅠ基因分子標(biāo)記技術(shù),對(duì)采集到的寄生蜂樣品再次進(jìn)行物種輔助鑒定,NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast結(jié)果顯示,本研究采集到的寄生蜂與蝶蛹金小蜂COⅠ基因序列相似度最高,而蝶蛹金小蜂為金小蜂科寄生蜂,表明所采樣品也可能為金小蜂科寄生蜂,但根據(jù)楊忠岐等(2020)的形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果,所采樣品與金小蜂科其他寄生蜂種類在形態(tài)特征方面存在差異,因此,可以確定本研究從草原毛蟲蛹內(nèi)采集到的寄生蜂為金小蜂科的新種,再次支持了形態(tài)學(xué)物種鑒定結(jié)果。形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法為三江源草原毛蟲分類學(xué)的深入研究提供了參考依據(jù),豐富了草原毛蟲生物防控寄生天敵資源庫(kù)。

草原毛蟲是分布在我國(guó)青藏高原高寒牧區(qū)的一種重要害蟲,對(duì)高寒草甸植被破壞相當(dāng)嚴(yán)重(王海貞和劉昕,2022)。青藏高原地理環(huán)境異常極端惡劣,因此,國(guó)內(nèi)外對(duì)草原毛蟲寄生天敵資源調(diào)查研究報(bào)道較少。1980年,沈南英等(1980)在草原毛蟲蛹內(nèi)發(fā)現(xiàn)了膜翅目金小蜂科寄生蜂草原毛蟲金小蜂PteromalusqinghaiensisLiao。三江源草原毛蟲金小蜂與草原毛蟲金小蜂雖然在形態(tài)上都保留了金小蜂科的特征,但也有一些細(xì)微差異,因此被鑒定為2個(gè)不同的種(楊忠岐等,2020)。由于草原毛蟲金小蜂沒有分子方面的基因信息資源,因此無法與三江源草原毛蟲做序列比對(duì),進(jìn)行深入的系統(tǒng)發(fā)育研究。故此,本研究只能選用小蜂總科中與三江源草原毛蟲金小蜂COⅠ序列相似度較高的11種寄生蜂進(jìn)行序列比對(duì),以此來研究三江源草原毛蟲金小蜂在小蜂總科中的進(jìn)化地位。遺傳距離是評(píng)估物種之間親緣關(guān)系的最直接證據(jù),三江源草原毛蟲金小蜂與蝶蛹金小蜂的遺傳距離最小,揭示在進(jìn)化過程中三江源草原毛蟲金小蜂與蝶蛹金小蜂親緣關(guān)系最近。這在一定程度上再次支持了三江源草原毛蟲金小蜂的形態(tài)學(xué)物種鑒定結(jié)果。系統(tǒng)發(fā)育樹聚類結(jié)果顯示,三江源草原毛蟲金小蜂先后與Eupelmussp.、Sycoscaptersp.、Idiomacromerussp.、Diaziellabizarre、Eurytomasp.聚為一支,且與Idiomacromerussp.+(Diaziellabizarre+Eurytomasp.)+(Eupelmussp.+Sycoscaptersp.)形成姊妹群,表明三江源草原毛蟲金小蜂在進(jìn)化上可能與這5種寄生蜂處于同一分類階層。

選擇合適的分子標(biāo)記,是用DNA序列進(jìn)行準(zhǔn)確分析的前提,不同的DNA序列在生物體中行使不同的功能,所承受的環(huán)境選擇壓力不同,因而在序列進(jìn)化速度上存在差異(梁宏偉等,2018; 李愛梅等,2022; 許佳丹等,2019)。對(duì)生物不同分類階元進(jìn)行鑒定時(shí),對(duì)所選擇的分子標(biāo)記的變異速度有不同的要求。在對(duì)亞種、種、屬等較低的分類階元進(jìn)行研究時(shí),要求所選擇的分析標(biāo)記要有較快的變異速度,這樣才能確保在親緣關(guān)系較近的不同個(gè)體之間存在足夠的變異能夠?qū)⑺鼈儏^(qū)別開來(吳文珊等,2013)。在本研究中,與三江源草原毛蟲金小蜂進(jìn)行序列比對(duì)的11個(gè)寄生蜂物種均為小蜂總科昆蟲,屬于較低級(jí)的分類單元,因此選用進(jìn)化速度相對(duì)較快的COⅠ序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究。此外,很多學(xué)者認(rèn)為,僅僅利用一個(gè)基因的分子標(biāo)記進(jìn)行物種鑒定時(shí),可能存在一定的誤差風(fēng)險(xiǎn)(吳文珊等,2013),因此,今后應(yīng)利用線粒體COⅡ、Cytb基因及核糖體16S、28S基因?qū)θ床菰x金小蜂進(jìn)行更加全面的分子生物學(xué)物種鑒定。