蘇州雅睿生物技術(shù)股份有限公司 徐樂

Q-PCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)）實(shí)現(xiàn)了在體外進(jìn)行DNA 片段的擴(kuò)增與定量的結(jié)合。本文提出一種基于光纖的熒光光路檢測系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)16 孔5 通道的熒光數(shù)據(jù)采集，簡單介紹了CCD 結(jié)構(gòu)的光路檢測方式與PD 結(jié)構(gòu)的光路檢測方式，后采用價(jià)格更便宜的PD 結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)熒光激發(fā)驅(qū)動光源電路、PD 電路、光路板，基于STM32H743VIT6 處理芯片可控制光源的亮滅，控制電機(jī)旋轉(zhuǎn)一周采集PD 光路信號。光路系統(tǒng)對16 孔樣品進(jìn)行光路實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果表明：PCR 儀光路系統(tǒng)可以檢測16 孔，5 通道的熒光數(shù)據(jù)，空孔熒光波動小于5%，CT 不大于1，CV 不大于1.5%，能滿足PCR 光學(xué)需求，達(dá)到較好的應(yīng)用效果。

PCR 儀器是一種生物儀器（基因擴(kuò)增），可以在體外借助多種酶對特定的DNA 片段進(jìn)行快速的擴(kuò)增。Q-PCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)）[1,2]是在PCR 儀器所用的耗材中增加熒光物質(zhì)，在PCR 工作過程里DNA在不斷地?cái)U(kuò)增，熒光信號也隨之增強(qiáng)，通過檢測熒光信號，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以對DNA 進(jìn)行定量、定性的分析。

PCR 擴(kuò)增分為4 個(gè)時(shí)期，分別為基線期（基線期DNA 進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，DNA 數(shù)量小及熒光信號較弱）、指數(shù)擴(kuò)增期（指數(shù)擴(kuò)增期DNA 進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，DNA 數(shù)量及熒光信號進(jìn)行指數(shù)增強(qiáng)）、線性增長（DNA 沒有進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增）以及平臺期（DNA 數(shù)量穩(wěn)定）。在指數(shù)增長期，熒光擴(kuò)增產(chǎn)物DNA 分子總數(shù)量y=x（1+e）n，x為原始模板DNA 分子數(shù)量，公式中的指數(shù)n表示PCR 反應(yīng)的循環(huán)數(shù)，e表示PCR 擴(kuò)增的效率（0 ≤e≤1）。由于基線期與指數(shù)擴(kuò)增期具有指數(shù)擴(kuò)增關(guān)系，可以進(jìn)行精確的定量檢測，通過PCR 儀器檢測樣品熒光信號，將閾值線定到指數(shù)擴(kuò)增期，可以實(shí)現(xiàn)對DNA 起始模板量的定量檢測分析。

1 光學(xué)系統(tǒng)原理

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀熒光檢測系統(tǒng)由激發(fā)光系統(tǒng)、檢測光系統(tǒng)組成。

CCD 結(jié)構(gòu)的光學(xué)系統(tǒng)，采用鹵素?zé)糇鳛榧ぐl(fā)光源，激發(fā)光系統(tǒng)還包括濾光片、光纖。檢測光系統(tǒng)是由CCD相機(jī)、濾光片、光纖、多元鏡組成。鹵素?zé)艚?jīng)過濾光片傳到前端光纖，到反應(yīng)孔，經(jīng)過光纖孔板上的熒光試劑，再經(jīng)過后端光纖、濾光片和鏡頭，最后CCD 相機(jī)采集熒光信號（需要調(diào)節(jié)CCD 定位、設(shè)置曝光時(shí)間等操作）。檢測熒光波長范圍由380nm ～780nm，F(xiàn)AM 激發(fā)波長470nm±10nm，檢測波長520nm±10nm；VIC 激發(fā)波長525nm±10nm，檢測波長570nm±10nm；ROX 激發(fā)波長570nm±10nm，檢測波長620nm±10nm；CY5 激發(fā)波長630nm±10nm，檢測波長670nm±10nm；CY5.5激發(fā)波長680nm±10nm，檢測波長710nm±10nm。

如圖1 所示是PD 結(jié)構(gòu)的光學(xué)系統(tǒng)[3]，由激發(fā)光系統(tǒng)與檢測光系統(tǒng)組成。激發(fā)光系統(tǒng)由LED 燈、濾光片、光纖組成，檢測光系統(tǒng)由PD、濾光片、光纖、多元鏡組成。選擇激發(fā)波長范圍380nm ～780nm 的LED 燈經(jīng)過濾光片傳到前端光纖，到反應(yīng)孔，經(jīng)過光纖孔板上的熒光試劑，再經(jīng)過后端光纖、濾光片和鏡頭，最后PD 將熒光光學(xué)信號轉(zhuǎn)化為模擬信號送入至光路板進(jìn)行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化。

圖1 16 孔5 通道PD 架構(gòu)光學(xué)系統(tǒng)Fig.1 16-hole 5-channel PD architecture optical system

如圖2 所示是采用PD 類型的光學(xué)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)盤圖。PD 類型的光學(xué)系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)分為固定盤與轉(zhuǎn)盤。圓盤為旋轉(zhuǎn)盤，內(nèi)圈為LED 燈通道，外圈為PD 檢測通道；上面與步進(jìn)電機(jī)固定的盤為固定盤，外圈16 孔用于檢測（與旋轉(zhuǎn)盤外圈相對應(yīng)），插入光纖通過旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)盤方式有序掃描光路信號，內(nèi)圈16 孔插入光纖用于激發(fā)（與旋轉(zhuǎn)盤內(nèi)圈相對應(yīng)），發(fā)射與檢測光路孔的配對數(shù)及為所能檢測的樣本孔數(shù)，LED 與PD 的配對數(shù)及為所能檢測樣本的通道數(shù)，后期可以通過改動旋轉(zhuǎn)盤里L(fēng)ED 與PD 配對數(shù)可以擴(kuò)展通道、變化固定盤孔的個(gè)數(shù)可以擴(kuò)展樣本孔數(shù)。

圖2 PD 架構(gòu)旋轉(zhuǎn)圖Fig.2 PD architecture rotation diagram

轉(zhuǎn)盤帶有原點(diǎn)復(fù)位功能，轉(zhuǎn)盤旋轉(zhuǎn)一圈就是測試一輪光路信號，采用步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動的方式，16 細(xì)分及步進(jìn)電機(jī)走3200 步轉(zhuǎn)盤旋轉(zhuǎn)一圈。將采集到的20 步光學(xué)數(shù)據(jù)通過排序，濾波取最大的四個(gè)數(shù)做平均得出光強(qiáng)，定位圓盤復(fù)位點(diǎn)需注意傳感器的觸發(fā)區(qū)域?yàn)檫B續(xù)區(qū)域，整個(gè)區(qū)域約25 步(一圈3200 步)，在圓盤設(shè)計(jì)時(shí)，盡量避免孔對準(zhǔn)位置在復(fù)位區(qū)域。

2 光學(xué)電路設(shè)計(jì)

2.1 PD 型光學(xué)檢測系統(tǒng)原理

如圖3 所示為PD 型熒光檢測系統(tǒng)圖，中位機(jī)發(fā)送采光指令給光路板，光路板開始開燈、控制電機(jī)、轉(zhuǎn)換處理PD 信號，電機(jī)回到原點(diǎn)關(guān)燈、停止電機(jī)運(yùn)動、停止處理PD 信號、發(fā)送數(shù)據(jù)。

圖3 PD 型熒光檢測系統(tǒng)圖Fig.3 PD fluorescence detection system diagram

2.2 光路板電路設(shè)計(jì)

光路板采用STM32H743VIT6 主控芯片，包括SWD燒錄接口、25MHz 有源晶振、復(fù)位電路、EEPROM 采用AT24C128 用于存儲數(shù)據(jù)的功能、運(yùn)用16 位ADC1，可以采集6 個(gè)PD 信號、可控制6 路LED 燈的亮與滅、控制步進(jìn)電機(jī)的PWM 占空比與使能信號、接收原點(diǎn)復(fù)位信號、與中位機(jī)進(jìn)行通信功能。

光路板LED 恒流驅(qū)動電路，通過PS2801 光耦芯片將單片機(jī)數(shù)字信號與LED 燈使能信號隔離，弱信號控制LED 燈的亮與滅，單片機(jī)信號沒有或者信號為高時(shí)LED燈不使能，單片機(jī)信號為低電平時(shí)LED 燈使能點(diǎn)亮。

PD 電路板輸出的模擬信號經(jīng)過ADA4522 運(yùn)算放大器放大,每路放大比例需根據(jù)實(shí)際光路進(jìn)行調(diào)整，由于單片機(jī)參考電壓不能超過4V，運(yùn)放供電電壓大于4V，對運(yùn)放輸出進(jìn)行了分壓，使單片機(jī)最大接收電壓不超過3V，滿足各芯片對電壓的需求。

2.3 PD 板設(shè)計(jì)

選用濱松品牌規(guī)格為S6931，濱松生產(chǎn)的PD 批次間較好，還具有響應(yīng)速度快、靈敏度高、噪聲低的優(yōu)點(diǎn)。光譜響應(yīng)范圍為320nm ～1000nm，暗電流只有20pA，上升時(shí)間0.5us。

輸出電流IOUT=IDARK+IPD，IDARK為PD 感光電流，IPD為暗電流（噪聲）。光電二極管有兩種工作模式，分別為光伏、光電導(dǎo)，在光伏模式工作時(shí)，二極管無偏置，暗電流可以達(dá)到最小；光電導(dǎo)模式工作時(shí)，需要施加一個(gè)外部反向電壓，可以提高響應(yīng)速度。本文基于對光電二極管的應(yīng)用速度、暗電流的考慮，選擇光電二極管在光伏模式下工作。

3 光學(xué)下位機(jī)軟件設(shè)計(jì)

光路板單片機(jī)上電初始化（開啟時(shí)鐘、ADC1 外設(shè)6通道使能，DMA1 將AD 采集數(shù)據(jù)存儲到指定內(nèi)存、電機(jī)復(fù)位等），判斷是否接收到采光指令，沒有收到繼續(xù)等待，如果收到正確信息啟動電機(jī)運(yùn)動、開始采集處理熒光數(shù)據(jù)、電機(jī)運(yùn)動一圈回到原點(diǎn)或者采光過程中復(fù)位超時(shí)、電機(jī)超3200 步，關(guān)閉電機(jī)、原點(diǎn)標(biāo)志復(fù)位、處理好光路和狀態(tài)數(shù)據(jù)發(fā)送給中位機(jī)。

4 光路實(shí)驗(yàn)

對PD 結(jié)構(gòu)的光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行光路實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證光學(xué)系統(tǒng)能否工作。進(jìn)行5 色實(shí)驗(yàn)時(shí)，光學(xué)系統(tǒng)需要借助溫度控制模塊、中位機(jī)（帶液晶屏的平板），分別測試5 個(gè)通道FAM、VIC、ROX、CY5、CY5.5 的16 孔 位 數(shù) 據(jù)，如表1 所示。

表1 光學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析表Tab.1 Analysis table of optical experiment data

測試4 個(gè)通道FAM、VIC、ROX、CY5 的A1、A4、B5、B8 孔位數(shù)據(jù)、測試第五通道CY5.5 的A5、A8、B1、B4 孔位數(shù)據(jù)。FAM 通道（測試A1、A4、B5、B8 孔位）：3103-6706，擴(kuò)增效率：2.16；VIC 通道（測試A1、A4、B5、B8 孔位數(shù)據(jù)：3738-8288，擴(kuò)增效率：2.22；ROX通道（測試A1、A4、B5、B8 孔位）：1997-9976，擴(kuò)增效率：5.00；CY5 通道（測試A1、A4、B5、B8 孔位）：2543-8402，擴(kuò)增效率：3.30；CY5.5 通道（測試A5、A8、B1、B4 孔位）：7821-31534，擴(kuò)增效率：4.03。

通過表1 的數(shù)據(jù)，所計(jì)算的CT 值小于1，CV 值小于1.5%，光路系統(tǒng)滿足PCR 儀器的光路要求。

5 結(jié)論

本文闡述了Q-PCR 儀擴(kuò)增原理，后簡單介紹了CCD結(jié)構(gòu)的光路檢測方式與PD 結(jié)構(gòu)的光路檢測方式，PD 結(jié)構(gòu)由于價(jià)格便宜容易操作，提出了基于PD 結(jié)構(gòu)的光路檢測系統(tǒng)，采用轉(zhuǎn)盤掃描方式，設(shè)計(jì)熒光激發(fā)驅(qū)動光源電路、PD 電路、光路板，可以實(shí)現(xiàn)16 孔5 通道的熒光數(shù)據(jù)采集（可以通過改動轉(zhuǎn)盤升級6 通道）。運(yùn)用設(shè)計(jì)的光路系統(tǒng)對16 孔樣品進(jìn)行光路實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果表明：所設(shè)計(jì)的光路系統(tǒng)采集熒光信號平穩(wěn)，可以檢測16 孔，5通道的熒光數(shù)據(jù)，空孔熒光波動小于5%，4 個(gè)孔位光路數(shù)據(jù)，CT 值小于1，CV 值小于1.5%，可以滿足實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀的光學(xué)需求[4]。

引用

[1] 鐘珂珂.光纖型定量PCR儀熒光檢測系統(tǒng)研究[D].杭州.浙江大學(xué),2013.

[2] 毛賀.光纖型定量PCR儀熒光檢測光學(xué)系統(tǒng)性能研究[J].機(jī)電工程技術(shù),2016,45(11):54-56.

[3] 王偉平.96孔實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測系統(tǒng)的開發(fā)[D].杭州.浙江工業(yè)大學(xué),2011.

[4] 梁子英,劉芳.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2020(6):1-3+8.