楊光彬，王瑾，陳愷琳，單慶云，崔蘇菲，熊程2,,4,5，鄒學(xué)校2,,4,5，劉峰2,,4,5*

辣椒MADS–box基因家族的鑒定及表達(dá)分析

楊光彬1，王瑾3,6，陳愷琳3，單慶云3，崔蘇菲3，熊程2,3,4,5，鄒學(xué)校2,3,4,5，劉峰2,3,4,5*

(1.湖南大學(xué)隆平分院，湖南 長沙 410125；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)實驗室，廣東 廣州 510642；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，湖南 長沙 410128；4.園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育教育部工程研究中心，湖南 長沙 410128；5.蔬菜生物學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；6.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095)

利用辣椒的全基因組數(shù)據(jù)鑒定到104個MADS–box基因，對它們的理化性質(zhì)、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、蛋白保守基序和組織表達(dá)水平進(jìn)行分析。結(jié)果表明：辣椒MADS–box基因家族各成員在染色體上的分布不均，理化性質(zhì)差異較大，104個家族成員編碼的氨基酸長度為100～567 aa，蛋白相對分子質(zhì)量為11 203.9～ 63 559.7，蛋白理論等電點(PI)為4.63～10.46，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，辣椒MADS–box基因家族可分為2大類，與擬南芥和番茄的進(jìn)化關(guān)系類似；組織表達(dá)水平分析結(jié)果表明，主要在花、果實和種子中表達(dá)，在葉片中表達(dá)量相對較低，推測MADS–box基因可能參與調(diào)控果實的發(fā)育和成熟。

辣椒；MADS–box基因家族；基因表達(dá)

辣椒(L.)是一種重要的蔬菜和香料作物，由于辣椒素和抗壞血酸含量較高，越來越被關(guān)注[1–2]。研究表明，MADS–box基因在植物的發(fā)育過程中(尤其是在花器官形成和果實成熟過程中)發(fā)揮重要作用[3–8]。研究人員已經(jīng)對多種植物進(jìn)行了MADS–box基因的全基因組分析[9–11]，但對辣椒MADS–box基因研究較少，僅有4個辣椒MADS–box基因被初步驗證功能[12–15]。本研究中，根據(jù)辣椒全基因組序列[16–17]鑒定了104個辣椒MADS–box基因，分析了它們的基本信息，包括進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、保守基序、染色體定位和種間共線性，同時預(yù)測了它們的亞細(xì)胞定位、順式元件和表達(dá)模式，并通過qRT–PCR驗證基因表達(dá)圖譜，旨在了解辣椒的MADS–box家族成員及潛在功能，為研究MADS–box家族在辣椒中的作用提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

供試?yán)苯凡牧蠟橐吧汀甋8’，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院提供。

1.2　方法

1.2.1辣椒MADS–box基因的鑒定

通過蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域提取號PF00319 (SRF–TF結(jié)構(gòu)域)和PF01486 (K–box結(jié)構(gòu)域)從Pfam數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)[18]下載MADS結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型(HMM)圖譜，設(shè)定截斷參數(shù)≤0.01，運用HMMER SEARCH 3.0程序在下載的HMM譜中識別含有MADS結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)[19]。利用SMART(simple modular architecture research tool)數(shù)據(jù)庫預(yù)測辣椒中存在MADS–box保守結(jié)構(gòu)域的候選蛋白[20]，參考2個高質(zhì)量的辣椒基因組數(shù)據(jù)CM334(http://peppergenome.snu.ac.kr/download.php)和Zunla–1(http://peppersequence.genomics.cn/)，運用ExPaSy在線工具(https://web.expasy.org/compute_pi/)計算相對分子質(zhì)量和理論等電點[21]，并通過softberry online tool(http://www.softberry.com)預(yù)測基因的亞細(xì)胞定位。

1.2.2保守基序、基因結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育分析

運用在線工具M(jìn)ultiple EM(MEME，https:// meme–suite.org/meme/tools/meme)挖掘基序(motif)，并用DNAMAN8.0.8(Lynnon Biosoft)進(jìn)行比對；運用Gene Structure Display Server繪制CaMADSs的基因結(jié)構(gòu)[22]；利用MEGA–X程序[23]根據(jù)1000次步長檢驗(bootstrap test)的相鄰連接法(NJ)構(gòu)建CaMADSs的無根系統(tǒng)發(fā)育樹，CaMADSs的完整蛋白質(zhì)序列來源于Zunla–1參考基因組。

1.2.3染色體定位和共線性分析

利用Zunla–1參考基因組獲取染色體位置，運用TBtools進(jìn)行分析和繪圖[24]；利用MCScanX分析基因共線性和同線性；通過KaKs_Calculator1.2[25]計算同義替換率(s)和非同義替換率(a)。

1.2.4啟動子區(qū)域的順式元件分析

運用PlantCARE在線工具(http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)預(yù)測CaMADSs啟動子區(qū)順式元件[26]。

1.2.5辣椒MADS–box基因家族表達(dá)分析

用于RNA–seq分析的原始數(shù)據(jù)均來源于PepperHub (http://PepperHub.hzau.edu.cn/)[27]，通過Fastqc[28]和Trimmmatic–0.36[29]過濾低質(zhì)量序列；利用HISAT2比對參考基因組Zunla–1序列，獲得配對末端測序讀數(shù)[30]，并通過FeatureCounts計算讀數(shù)之和[31]；采用Rv3.6.1中的DESeq2包實現(xiàn)計數(shù)數(shù)據(jù)歸一化[32]，并構(gòu)建熱圖。

1.2.6總RNA的提取和qRT–PCR分析

取‘S8’的花蕾、完全開放的花、未成熟綠色果、綠色成熟果、破色期果、成熟果、幼葉、成熟葉、綠色成熟果中的種子以及成熟果中的種子，采用TransZol Up(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)提取樣品總RNA，然后使用Evo M–MLV預(yù)混物(艾科瑞生物技術(shù)公司)合成用于qRT–PCR的cDNA。按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊，南京)20 μL體系配制反應(yīng)試劑，通過LightCycle? 96實時熒光定量PCR儀(Roche，瑞士)運行qRT–PCR程序，以辣椒基因Capana04g001698為內(nèi)參[33]，進(jìn)行3次重復(fù)。采用2???Ct方法計算基因相對表達(dá)水平[34]。所有引物均通過GenScript網(wǎng)站(https://www.genscript.com/tools/real–time–pcr–taqman–primer–design–tool)設(shè)計，如表1所示。

表1　用于qRT–PCR 的基因和引物

1.2.7統(tǒng)計分析

使用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)果與分析

2.1　辣椒MADS–box基因家族的鑒定

依據(jù)HMM MADS模型找到了104個包含在CM334和Zunla–1基因組數(shù)據(jù)庫的辣椒MADS–box基因，根據(jù)其染色體位置，將其重命名為…。通過分析，其氨基酸序列的長度為100～567 aa，相對分子質(zhì)量為11 203.9～63 559.7，基因的等電點(PI)為4.63～10.46。亞細(xì)胞定位的預(yù)測結(jié)果表明，除(Capana11g001822)存在于胞外結(jié)構(gòu)中，其余均定位在細(xì)胞核中。

2.2　辣椒MADS–box基因的分類和系統(tǒng)發(fā)育分析

運用MEGA 5.02并采用NJ方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，結(jié)果表明，分類結(jié)果與擬南芥、番茄類似[10]，104個基因可分為分支I和II，幾乎所有只含MADS結(jié)構(gòu)域的基因都屬于分支I (Capana08g002103和Capana12g000929只含1個MADS結(jié)構(gòu)域除外)，其余小部分基因?qū)儆诜种I。

黃色圓點代表僅含MADS結(jié)構(gòu)域的基因；藍(lán)色圓點代表含有MADS結(jié)構(gòu)域和K–box結(jié)構(gòu)域的基因；綠色圓點代表僅含K–box 結(jié)構(gòu)域的基因。

2.3　辣椒MADS–box基因的保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

為深入了解MADS–box基因的結(jié)構(gòu)多樣性、相似性及進(jìn)化關(guān)系，分析了內(nèi)含子–外顯子的排列和保守基序，從結(jié)果(圖2)可以看出，辣椒MADS–box基因包含0～9個內(nèi)含子，50%以上的基因沒有內(nèi)含子，104個MADS–box基因中只有21個(20.2%)含有5個以上的內(nèi)含子。另外，在辣椒MADS–box蛋白中鑒定到8個保守基序。

圖2　辣椒MADS–box 基因的基序位置和基因結(jié)構(gòu)

2.4　辣椒MADS–box基因的染色體定位和種間共線性分析

根據(jù)辣椒基因組注釋，繪制了辣椒MADS–box基因的染色體定位及基因共線性圖(圖3)。結(jié)果表明，MADS–box基因不均勻地分布在12條染色體上。辣椒MADS–box基因多數(shù)集中在08至12染色體上，許多被定位在00染色體上，01至07染色體上辣椒MADS–box基因數(shù)量相對較少，05染色體上只有2個MADS–box基因，03染色體上只有3個MADS–box基因。紅色曲線表示5組CaMADS重復(fù)基因?qū)?，每組重復(fù)基因?qū)Φ腶和s值及其比值(a/s)列于表2，重復(fù)基因?qū)Φ腶值為0.280～0.329，s值為0.997～2.145。a/s值為評價進(jìn)化選擇壓力的指標(biāo)，均小于1.00，說明辣椒在進(jìn)化過程中存在純合選擇。

圖3　辣椒MADS–box基因的染色體定位及基因共線性

表2　辣椒MADS–box基因的復(fù)制基因?qū)?/p>

2.5　辣椒MADS–box基因啟動子區(qū)順式元件的預(yù)測

本研究鑒定到7個細(xì)胞發(fā)育順式調(diào)控元件，負(fù)責(zé)胚乳、分生組織、柵欄葉肉細(xì)胞、類黃酮生物合成和細(xì)胞周期調(diào)控；預(yù)測了13個與激素相關(guān)的順式元件，涉及乙烯、茉莉酸甲酯、赤霉素、水楊酸和生長素；還預(yù)測到33個與脅迫相關(guān)的順式調(diào)控元件，包括非生物脅迫(光、低溫、干旱反應(yīng)和厭氧誘導(dǎo))和生物脅迫(創(chuàng)傷響應(yīng)等)。其中71個基因含有參與ABA反應(yīng)的ABRE順式作用元件，73個基因含有參與乙烯反應(yīng)的ERE順式作用元件。

2.6　辣椒MADS–box基因在不同器官中的表達(dá)譜預(yù)測

基于PepperHub數(shù)據(jù)集構(gòu)建了分層聚類熱圖(圖4)，包含了花發(fā)育的9個時期(F1、F2、…、F9)、果實發(fā)育的11個時期(G1、G2、…、G11)、葉片發(fā)育的10個時期(L1、L2、…、L10)和種子發(fā)育的11個時期(S1、S2、…、S11)?；虮磉_(dá)譜顯示，辣椒中大量基因在花、果實和種子中高表達(dá)，在葉中低表達(dá)。

F1、F2、…、F9代表花的9個發(fā)育階段；G1、G2、…、G11代表果實的11個發(fā)育階段；L1、L2、…、L10代表葉片的10個發(fā)育階段；S1、S2、…、S11代表種子的11個發(fā)育階段。

2.7　辣椒MADS–box基因在果實發(fā)育階段的差異表達(dá)分析

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集選擇了6個呈現(xiàn)不同表達(dá)趨勢的辣椒MADS–box基因，在整個發(fā)育時期均有表達(dá)，其中，在果實發(fā)育成熟階段表達(dá)量較高；在花、果、葉中均有表達(dá)，在果實發(fā)育初期表達(dá)量較高；在花和幼果中的表達(dá)量相對較高；在果實和種子中表達(dá)量較高，且隨著果實和種子逐漸成熟，表達(dá)量顯著增加；在各階段均有表達(dá)，在種子發(fā)育成熟時期表達(dá)水平尤為突出；在果實發(fā)育后期和成熟種子中的表達(dá)水平較高。通過qRT–PCR進(jìn)行驗證，結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)表達(dá)量在花、果實和種子發(fā)育期間均呈現(xiàn)上升趨勢，在果實成熟階段達(dá)最高值。在果實發(fā)育初期表達(dá)量最高，約為花中的4倍，成熟果的2倍。在花器官中具有較高的表達(dá)水平，在其余組織中幾乎無表達(dá)。在成熟果實中表達(dá)量最高，隨果實逐漸成熟表達(dá)量顯著增加，在葉中表達(dá)量接近0。在成熟種子中表達(dá)量最高(197.02)，約是花中表達(dá)量的70倍，成熟果表達(dá)量的8倍。在果實初期幾乎不表達(dá)，但隨果實發(fā)育表達(dá)量迅速上升，果實成熟時達(dá)到最高值(216.59)，在成熟種子中的表達(dá)量也較高，達(dá)133.70。qRT–PCR驗證結(jié)果與表達(dá)譜預(yù)測趨勢基本一致。

表3　辣椒中6個MADS–box基因4種組織不同發(fā)育階段的相對表達(dá)量

YFB花蕾；F完全開放的花；IMG未成熟綠色果；MG綠色成熟果；BR破色期果；MF成熟果；YL幼葉；ML成熟葉；SG綠色成熟果中種子；SR成熟果中種子。不同小寫字母示同行數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(＜0.05)。

3　結(jié)論與討論

基因家族的全基因組分析方法是了解基因結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和功能的有效分析方法。本研究結(jié)果顯示，辣椒MADS家族中104個基因，與番茄中131個MADS家族成員[10]數(shù)量接近，推測該家族在進(jìn)化中是保守的。對外顯子和內(nèi)含子數(shù)量和分布特征的分析結(jié)果表明，大多數(shù)基因具有相似的結(jié)構(gòu)。表明這些基因在植物發(fā)育中的生物學(xué)功能相對保守。

鑒于基因的表達(dá)模式能反映其功能[35]，對不同生育時期辣椒MADS–box基因家族在花、果實、葉和種子的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，該家族基因主要在生殖器官中出現(xiàn)高的表達(dá)量，在葉片中的表達(dá)量相對較低。qRT–PCR結(jié)果顯示，6個基因的表達(dá)水平均隨果實發(fā)育升高或降低，可能正向或反向調(diào)控果實發(fā)育。和隨果實的成熟其相對表達(dá)量上升，表明它們可能促進(jìn)果實成熟。此外，這4個基因在成熟種子中表達(dá)。根據(jù)這些結(jié)果推測，辣椒的MADS–box基因可能參與調(diào)控果實的發(fā)育和成熟，包括影響果實成熟時間、果實色澤和風(fēng)味等[36–39]，這在很多作物，如番茄、草莓等中已經(jīng)被驗證。在花器官中的表達(dá)水平較高，但在果實中顯著降低，這可能意味著該基因主要參與花器官發(fā)育的調(diào)控。此外，和都屬于分支II，推測分支II中的轉(zhuǎn)錄因子更可能參與調(diào)控辣椒果實的發(fā)育和成熟，這與呂山花等[40]的研究結(jié)果基本一致。但其潛在的功能與分子調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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Identification and expression analysis of the MADS-box gene family in

YANG Guangbin1，WANG Jin3,6，CHEN Kailin3，SHAN Qingyun3，CUI Sufei3，XIONG Cheng2,3,4,5，ZOU Xuexiao2,3,4,5，LIU Feng2,3,4,5*

(1.Longping Branch, Hunan University, Changsha, Hunan 410125, China; 2.Laboratory of Lingnan Modern Agriculture, Guangzhou, Guangdong 510642, China; 3.College of Horticulture, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 4.ERC for Germplasm Innovation and New Variety Breeding of Horticultural Crops, Changsha, Hunan 410128, China; 5.Key Laboratory for Vegetable Biology of Hunan Province, Changsha, Hunan 410128, China; 6.College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu 210095, China)

In this study, 104 MADS-box genes were identified from pepper by using the whole genome data of pepper, and their physical and chemical properties, chromosome location, phylogenetic relationship, protein conserved motifs and tissue expression levels were analyzed. The results showed that the members of MADS-box gene family in pepper were uneven distribution on chromosomes and their physical and chemical properties were quite different. The length of amino acids encoded by 104 family members was 100-567 aa, the relative molecular masses of proteins were 11 203.9-63 559.7, and the theoretical isoelectric points(PI) of proteins were 4.63-10.46. Phylogenetic analysis showed that the MADS-box gene family of pepper could be divided into two categories, which were similar to the evolutionary relationship betweenand tomato. The analysis of tissue expression level showed that CaMADSs were mainly expressed in flowers, fruits and seeds, and was less expressed in leaves, speculating that MADS-box gene might be involved in regulating fruit development and ripening.

pepper; MADS-box gene family; gene expression

S641.3；Q786

A

1007–1032(2023)05–0558–09

楊光彬，王瑾，陳愷琳，單慶云，崔蘇菲，熊程，鄒學(xué)校，劉峰．辣椒MADS–box基因家族的鑒定及表達(dá)分析[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2023，49(5)：558–566．

YANG G B，WANG J，CHEN K L，SHAN Q Y，CUI S F，XIONG C，ZOU X X，LIU F．Identification and expression analysis of the MADS-box gene family in[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(5)：558–566．

http://xb.hunau.edu.cn

2022–12–06

2023–10–18

國家自然科學(xué)基金項目(32002058、32130097)；國家自然科學(xué)基金聯(lián)合基金項目(U19A202)；湖南省科技創(chuàng)新計劃項目(2021JC 0007)

楊光彬(1999—)，女，湖南常德人，碩士研究生，主要從事辣椒果實發(fā)育及分子育種研究，gbinyang@163.com；*通信作者，劉峰，博士，研究員，主要從事辣椒種質(zhì)資源重要性狀功能基因挖掘及新種質(zhì)創(chuàng)制研究，liufengrich@126.com

10.13331/j.cnki.jhau.2023.05.009

責(zé)任編輯：毛友純

英文編輯：柳正