陳瀟航 王澤平 黃海榮 張小秋 宋修鵬 李文教 雷敬超 黃冬梅 李秋芳 顏梅新

摘 要：為明確不同殺菌劑對甘蔗梢腐病病原菌的抑菌效果以便后續(xù)科學地指導病害防治，本文分別使用42.4%唑醚·氟酰胺懸浮劑，62.5 g/L精甲·咯菌腈懸浮種衣劑，250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油，325 g/L苯甲·嘧菌酯懸浮劑，25%吡唑醚菌酯乳油，43%氟菌·肟菌酯懸浮劑，60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑和19%啶氧·丙環(huán)唑懸浮劑對甘蔗梢腐病病原菌擬輪枝鐮孢菌（Fusarium verticillioides）采用菌絲生長速率法進行室內藥劑篩選，并通過掃描電鏡（SEM）觀測不同殺菌劑對病原菌孢子與菌絲的影響。結果表明，不同殺菌劑對病原菌菌絲生長均有一定抑制作用。掃描電鏡結果表明，經不同殺菌劑處理后，病原菌孢子和菌絲均有不同程度的潰爛、畸形、干癟甚至穿孔。其中，19%啶氧·丙環(huán)唑懸浮劑和325 g/L苯甲·嘧菌酯懸浮劑的抑菌效果較好，抑制中濃度（EC50）分別為0.260 μg/mL和0.042 μg/mL；而62.5 g/L精甲·咯菌腈懸浮種衣劑的抑菌效果較差，EC50高達2504.060 μg/mL。供試藥劑中，三唑類殺菌劑與甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的復配劑抑菌效果最好，其EC50均小于1.000 μg/mL。

關鍵詞：甘蔗梢腐病；擬輪枝鐮孢菌；殺菌劑篩選

中圖分類號：S566.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? 文章編號：2095-820X（2023）02-0019-06

0 引言

甘蔗種植是廣西重要的支柱產業(yè)，廣西甘蔗產量占全國總產量的65%以上［1］。甘蔗梢腐病是重要的甘蔗真菌病害之一，廣泛發(fā)生于廣東、廣西、云南、福建等主要甘蔗產區(qū)。甘蔗梢腐病對甘蔗的產量及品質造成巨大危害，可使受害甘蔗減產40%～60%，糖分降低40.8%～64.5%［2］，甘蔗梢腐病已成為糖業(yè)發(fā)展的重要障礙之一。甘蔗梢腐病于1896年由Walker和Went首次在爪哇發(fā)現(xiàn)［3］，迄今為止，世界各個甘蔗種植區(qū)域均有記載甘蔗梢腐病發(fā)生。3至7個月大的甘蔗苗最易感染甘蔗梢腐?。?］，感染初期甘蔗葉片出現(xiàn)皺縮、卷曲、縮短等畸形［4， 5］，隨后在葉片褪綠部上產生不規(guī)則的紅色條紋或斑點［6］，葉鞘也可能褪綠并出現(xiàn)紅色不規(guī)則壞死斑［7］。如果病原菌侵染局限在葉部，甘蔗通常能自行恢復，如果侵染至甘蔗頂端梢，會使頂端生長點畸形、潰爛，心葉部壞死，最終導致植株枯萎死亡［8］。

甘蔗梢腐病由鐮刀菌復合體侵染致病，在不同甘蔗種植區(qū)域，主要致病菌有所不同。馬來西亞蔗區(qū)梢腐病的主要致病菌為Fusarium moniliforme［9］，而南非蔗區(qū)主要致病菌為F.sacchari，F(xiàn).proliferatum和F.andiyazi［10］，中國蔗區(qū)的致病菌則以F.verticillioides和 F.proliferatum為主［11］。

由于我國早期甘蔗種植管理粗放且對甘蔗病害的影響不夠重視，因此在甘蔗育種中較少進行抗梢腐病品種的選育工作［12］。我國推廣種植的甘蔗品種相對單一，且種植年限較長，這些推廣品種都不同程度地受到甘蔗梢腐病的威脅［13］。然而選育出品質優(yōu)良的抗梢腐病甘蔗新品種需要大量時間，并且新培育出的抗病品種也往往由于病原菌生理小種變異而在幾年的大規(guī)模生產種植后抗性降低。因此尋找行之有效的藥劑防治甘蔗梢腐病仍是解決燃眉之急的重要措施。

本研究對從廣西蔗區(qū)梢腐病發(fā)病蔗株上分離到的梢腐病菌進行了8種殺菌劑的室內生物活性測定，通過分析不同殺菌劑對菌絲生長速率的影響，確定病原菌對不同殺菌劑的敏感程度，為生產中選擇高效低毒的防控殺菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

供試菌株甘蔗梢腐病菌株擬輪枝鐮刀菌（Fusarium verticillioides）由廣西農業(yè)科學院甘蔗研究所實驗室保存提供。

1.1.2 供試殺菌劑及培養(yǎng)基

試驗中使用的培養(yǎng)基為廣東環(huán)凱生物馬鈴薯葡萄糖瓊脂干粉培養(yǎng)基（PDA）。供試殺菌劑具體信息如表1所示。

1.2 室內生物活性測定

采用菌絲生長速率法［14］對擬輪枝鐮孢菌進行室內殺菌劑篩選。先通過預試驗確定各藥劑抑制率在5%～95%之間的濃度范圍后，使用無菌水把供試的殺菌劑配制成有效成分含量為100 μg/mL的母液，再根據表2用無菌水配制不同濃度梯度的藥液。

用移液槍分別吸取1 mL藥液混入49 mL 50 ℃左右的未凝固PDA培養(yǎng)基中，加入頭孢菌素后混勻制成帶藥平板，以等量無菌水替代藥劑加入PDA培養(yǎng)基制成的平板作為空白對照。將保存在4 ℃的病原菌菌株用接種針挑取小塊帶菌培養(yǎng)基塊置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，用直徑6 mm打孔器在菌落邊緣幼嫩菌絲處打孔獲取菌餅，分別置于對照平板與含藥平板中央，每個處理3次重復。在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，使用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落直徑的平均值與菌絲生長抑制率。計算公式為：

菌絲生長抑制率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/（對照組菌落直徑）×100%。

將各殺菌劑抑制率與對應濃度用SPSS 26軟件進行數據處理，可以獲得毒力方程，以及殺菌劑對甘蔗梢腐病菌的抑制中濃度（EC50）。

1.3 有效殺菌劑對甘蔗梢腐病菌的作用效果

以甘蔗梢腐病菌菌體（孢子和菌絲）作為測試對象，將保存在4 ℃的病原菌菌株用接種針挑取小塊帶菌培養(yǎng)基塊置于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，用10 mL無菌水將平板上的菌體洗脫，將菌體懸液加入有效中濃度對甘蔗梢腐病菌有抑制作用的殺菌劑，以不加藥為對照，28 ℃，200 r/min下處理30 min；5000 r/min常溫離心，去掉上清液，加入等體積電鏡固定液FAA（甲醛、乙酸、乙醇，5∶5∶90）重懸浮。處理過的甘蔗梢腐病菌進行掃描電鏡測試，掃描電鏡方法參考Marques等［15］。

2 結果與分析

2.1 供試殺菌劑對菌絲生長的抑制作用

8種殺菌劑對甘蔗梢腐病菌菌絲的生長抑制效果如表3所示，19%啶氧·丙環(huán)唑、325 g/L苯甲·嘧菌酯和250 g/L苯醚甲環(huán)唑這3種殺菌劑的活性較強，EC50分別為0.042、0.260和1.090 μg/mL，均小于10.000 μg/mL。43%氟菌·肟菌酯、25%吡唑醚菌酯和60%唑醚·代森聯(lián)的EC50分別為24.410、30.480和63.870 μg/mL，EC50在10.000～100.000 μg/mL范圍內，抑菌活性次之。而42.4%唑醚·氟酰胺和62.5 g/L精甲·咯菌腈的EC50均大于100.000 μg/mL，表明這2種殺菌劑的抑菌活性最差。供試殺菌劑對病原菌的梯度抑制效果如圖1所例。

2.2 供試殺菌劑不同作用類型特點對比

供試的2種單劑6種復配殺菌劑中共有6種不同作用類型的殺菌劑，根據殺菌劑的作用類型分類對比其EC50。由表4可知，三唑類殺菌劑表現(xiàn)出較強的抑菌活性，并且甲氧基丙烯酸酯類和三唑類復配藥劑的抑菌活性更為突出，EC50均小于1.000 μg/mL。

2.3 殺菌劑對甘蔗梢腐病菌作用的電鏡掃描分析

電鏡掃描結果表明，對照中甘蔗梢腐病菌呈長柱形，表面較光滑（圖2-A）。甘蔗梢腐病菌菌體經325 g/L苯甲·嘧菌酯懸浮劑處理后，孢子與菌絲表面粗糙潰爛、孢子畸形（圖2-B）；經殺菌劑43%氟菌·肟菌酯懸浮劑處理后，孢子表面形成孔洞凹陷（圖2-C）；經250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油處理后，孢子與菌絲組織呈腐爛狀，孢子干癟或畸形（圖2-D）；經25%吡唑醚菌酯乳油處理后，孢子表面形成凹陷、畸形，菌絲表面潰爛、干癟甚至穿孔（圖2-E）；經19%啶氧·丙環(huán)唑懸浮劑處理后，孢子與菌絲表面潰爛（圖2-F）。

3 討論

本研究中以甘蔗梢腐病菌擬輪枝鐮孢菌作為研究對象，采用菌絲生長速率法，測試了250 g/L 苯醚甲環(huán)唑乳油、25%吡唑醚菌酯乳油、19%啶氧·丙環(huán)唑懸浮劑、325 g/L苯甲·嘧菌酯懸浮劑、42.4%唑醚·氟酰胺懸浮劑、43%氟菌·肟菌酯懸浮劑、60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑和62.5 g/L精甲·咯菌腈懸浮種衣劑8種殺菌劑對擬輪枝鐮孢菌的室內生物活性。檢測結果表明8種殺菌劑對甘蔗梢腐病菌F. verticillioides均有明顯抑制效果。19%啶氧·丙環(huán)唑懸浮劑的抑菌效果最好，是防治甘蔗梢腐病首選，其次為325 g/L苯甲·嘧菌酯懸浮劑和250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油，對甘蔗梢腐病菌也有較明顯抑制作用。通過分析殺菌劑作用方式類型發(fā)現(xiàn)，三唑類殺菌劑250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油的抑菌活性顯著，EC50可達1.090 μg/mL。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑和三唑類殺菌劑的復配藥劑19%啶氧·丙環(huán)唑懸浮劑和325 g/L苯甲·嘧菌酯懸浮劑的抑菌活性遠高于同類型殺菌劑單劑，分別達到0.042和0.260 μg/mL。而甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑與琥珀酸脫氫酶抑制劑類殺菌劑的復配藥劑表現(xiàn)出的抑菌活性差異較大，43%氟菌·肟菌酯懸浮劑的EC50為24.410 μg/mL，而42.4%唑醚·氟酰胺懸浮劑的EC50卻高達507.680 μg/mL。綜上所述，250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油作為三唑類殺菌劑對甘蔗梢腐病菌F. verticillioides的抑菌活性較出色，三唑類殺菌劑與甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的復配制劑抑菌活性更佳，本研究中復配藥劑19%啶氧·丙環(huán)唑懸浮劑和325 g/L苯甲·嘧菌酯懸浮劑的防效最佳，EC50分別為0.042和0.260 μg/mL。

苯醚甲環(huán)唑屬于三唑類殺菌劑，三唑類殺菌劑具有高效低毒、殺菌譜廣、作用持久、對植物兼具保護和治療作用等優(yōu)點，20世紀70年代起逐漸成為全球使用最廣泛的一類殺菌劑。三唑類殺菌劑主要通過影響病原菌麥角甾醇的合成路徑，破壞病原菌的細胞膜的結構與功能，達到抑菌功效［16］。黃海娟等［17］研究表明三唑類殺菌劑的三唑酮對于擬輪枝鐮孢菌有較強抑制作用，室內毒力EC50為2.672 mg/L，20 %三唑酮800倍液對甘蔗梢腐病的田間防治效果高于96%。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是以嗜球果傘素A為先導化合物研發(fā)的微生物源仿生類殺菌劑。該類殺菌劑活性高、殺菌譜廣，幾乎對所有的真菌和卵菌類病害均有良好的防治效果。甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的作用機理是通過與病原菌線粒體復合物Ⅲ輔酶Q的氧化位點（Qo）結合，阻斷細胞色素b和c1之間的電子傳遞，進而干擾細胞三磷酸腺苷（ATP）的合成，使病原菌因能量不足而死亡［18］。李宇峰等［19］的研究表明，22.5%啶氧菌酯懸浮劑對梢腐病病原菌的菌絲生長有較好的抑制作用，室內毒力測定EC50為0.4699 mg/L。本研究掃描電鏡結果表明，325 g/L苯甲·嘧菌酯懸浮劑，43%氟菌·肟菌酯懸浮劑，250 g/L苯醚甲環(huán)唑乳油，25%吡唑醚菌酯乳油和19%啶氧·丙環(huán)唑懸浮劑對甘蔗梢腐病菌菌絲和孢子造成不同程度的破壞，從而有效抑制病菌生長。

隨著殺菌劑種類不斷推陳出新，能夠用于防治甘蔗梢腐病的殺菌劑種類將會越來越多，因此應是不斷篩選不同作用機理的殺菌劑對甘蔗梢腐病進行防治。本研究僅對2種單劑、6種4類復配殺菌劑進行了室內篩選試驗。但不同的藥劑劑型以及同類作用機制殺菌劑的不同品種藥劑的防治效果仍可能存在較大差異，因此應進一步確認同類殺菌劑中其他藥劑或其他劑型對甘蔗梢腐病的防治效果。李苗等［20］從油樟葉中分離出對擬輪枝鐮孢菌抑菌率達到80%的內生細菌貝萊斯芽胞桿菌（Bacillus velezensis），甘蔗健康植株中是否同樣含有抑制甘蔗梢腐病病原菌的內生細菌有待進一步研究。

參考文獻

［1］ 李炳楊. 廣西甘蔗種植現(xiàn)狀， 問題及對策［J］. 熱帶農業(yè)科學， 2018， 38（4）： 119-127.

［2］ Singh A， ?Chauhan S S， Singh A ， et al. Deterioration in sugarcane due to pokkah boeng disease［J］. Sugar Tech， 2006，8（2-3）：187-190.

［3］ Martin J， Handojo H， Wismer C. Pokkah boeng［M］// Ricaud C， Egan B T， Gillaspie A G. Diseases of sugarcane： Major disease. New York：Elsevier， 1989： 211-229.

［4］ Edgerton C W. Sugarcane and its diseases［M］. Baton Rouge： Louisiana State University Press，1958.

［5］ Leslie J F， Frederiksen R A. Disease analysis through genetics and biotechnology：Interdisciplinary bridges to improved sorghum and millet crops［C］//Disease Analysis Through Genetics & Biotechnology： Interdisciplinary Bridges to Improved Sorghum & Millet Crops. 1995.

［6］ Martin J P， Hong H L， Wismar C A. Sugar-cane diseases of the world［M］. New York： Elsevier，1961.

［7］ Siddique S. Pathogenicity and aethiology of Fusarium species associated with pokkah boeng disease on sugarcane［J］. Penang：Universiti Sains Malaysia， 2007.

［8］ Blackburn F. Sugarcane［M］. New York： Longman， 1984.

［9］ Geh S L. Current status of diseases and pests of sugarcane in West Malaysia［R］//MARDI Report，1973：4-6.

［10］ Govender P， McFarlane S A， Rutherford R S. Fusarium species causing pokkah boeng and their effect on Eldana saccharina walker（Lepidoptera： Pyralidae）［C］//Proceedings of South African Sugarcane Technology Association. 2010， 83： 267-270.

［11］ Lin Z， Xu S， Que Y， et al. Species-specific detection and identification of Fusarium species complex， the causal agent of sugarcane pokkah boeng in China［J］. PLoS One，2014，9（8）： e104195.

［12］ 黃鴻能. 淺淡甘蔗病害在廣東蔗區(qū)的為害及其主要防治對策［J］. 甘蔗糖業(yè)，1993（3）：13-16.

［13］ 郭強，馬文清，唐利球，等. 甘蔗梢腐病研究現(xiàn)狀與展望［J］. 廣東農業(yè)科學，2018，45（06）：78-83.

［14］ 方中達. 植病研究方法［M］. 北京：中國農業(yè)出版社， 1995.

［15］ Marques J P R， Appezzato-da-Gloria B， Hoy J W， et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum［J］. Frontiers in Plant Science， 2018，9：698.

［16］ 張靜靜. 三唑類殺菌劑研究［J］. 生物化工，2019，5（6）：126-128.

［17］ 黃海娟，李界秋，蒙姣榮，等. 9種殺菌劑對甘蔗梢腐病菌毒力測定及其田間藥效試驗［C］//中國植物病理學會2018年學術年會論文集，2018：475.

［18］ 趙平，嚴秋旭，李新，等. 甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的開發(fā)及抗性發(fā)展現(xiàn)狀［J］. 農藥，2011，50（8）：547-551.

［19］ 李宇峰，王海玄，李奕莎，等. 6種殺菌劑對甘蔗梢腐病菌和卷葉病菌的室內毒力測定［J］. 亞熱帶農業(yè)研究，2017，13（4）：241-245.

［20］ 李苗，李彥銘，馮瑞章，等. 特色香料作物油樟葉內生Bacillus velezensis YZ12的鑒定及拮抗病原菌活性［J］. 生物資源，2020，42（4）：414-420.