熊小婷,饒 璞,陳意光,郭燕華,宋梓鋒,李慧勇,黃曉鋼,何國(guó)山

(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院,國(guó)家包裝產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心(廣州),廣東 廣州 511447)

三聚氰胺-甲醛(簡(jiǎn)稱“密胺”)餐具具有輕巧、美觀、不易碎裂等優(yōu)點(diǎn),在餐飲和兒童用品行業(yè)深受歡迎,2021年密胺餐具全球市場(chǎng)規(guī)模已達(dá)到7.56億美元[1-4]。合格的密胺餐具在常溫非酸性條件下較穩(wěn)定,但是在酸性、高溫長(zhǎng)期使用等苛刻條件下,三聚氰胺-甲醛樹脂可發(fā)生水解,釋放出甲醛、三聚氰胺及其他化學(xué)成分,存在危害人體健康的風(fēng)險(xiǎn)[5-8]。

目前,關(guān)于密胺餐具中三聚氰胺、三聚氰胺酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的遷移量檢測(cè)方法和遷移規(guī)律的研究已有報(bào)道,主要采用高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法[9-10],且均為特定目標(biāo)物的靶向檢測(cè)。超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-QTOF MS)及其配套軟件、數(shù)據(jù)庫(kù),可以非靶向地獲取和分析樣品中大量成分的精確分子質(zhì)量、碎片離子、色譜保留時(shí)間、色譜峰形、相對(duì)含量等信息[11],廣泛用于食品非法添加、產(chǎn)品鑒別、食品接觸材料風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)篩查等方面[12-14],但尚未見非靶向篩查密胺制品水解產(chǎn)物及其遷移情況的報(bào)道。

本工作擬采用UPLC-QTOF MS結(jié)合三聚氰胺-甲醛樹脂的合成原理、化學(xué)結(jié)構(gòu)碎片分析軟件,研究食品接觸密胺制品在酸性溶液中的高溫水解產(chǎn)物,以及水解產(chǎn)物在密胺餐具酸性遷移液中的遷移情況,希望為密胺制品毒理學(xué)研究和食品安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

Aquity UPLC H-Class Plus超高效液相色譜儀:美國(guó)Waters公司產(chǎn)品;X500B四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀:美國(guó)SCIEX公司產(chǎn)品,配有電噴霧離子源(ESI)及SCIEX OS集成軟件(3.0.0.3339版);Milli-Q IQ7000超純水器:美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品;SECURA225D-1CN、BSA224S分析天平:德國(guó)Sartorius公司產(chǎn)品;25 mL水熱反應(yīng)釜:內(nèi)罐材質(zhì)為聚四氟乙烯。

1.2 主要材料與試劑

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.8%)、甲酸(色譜純):上海安譜實(shí)驗(yàn)科技公司產(chǎn)品;甲醇、乙腈(色譜純):上海麥克林生化科技公司產(chǎn)品;濃鹽酸(優(yōu)級(jí)純)、乙酸(分析純)、乙酸銨(分析純):廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品;實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

密胺樹脂:廣東順德恒業(yè)公司產(chǎn)品;16批次密胺餐具:購(gòu)自廣州市場(chǎng)。

1.3 溶液配制

準(zhǔn)確稱取5 mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中,用水定容、混勻,配制500 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,于-20 ℃下保存。

移取0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中,用水定容、混勻,配制10 mg/L標(biāo)準(zhǔn)中間溶液,于4 ℃下保存。

移取0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL容量瓶中,用水定容、混勻,配制200 μg/L標(biāo)準(zhǔn)中間溶液1,于4 ℃下保存。

分別移取1、0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液,2.5、0.5、0.25 mL標(biāo)準(zhǔn)中間液1于10 mL容量瓶中,用水定容、混勻,配制標(biāo)準(zhǔn)工作液,現(xiàn)配現(xiàn)用。

鹽酸溶液:移取10 mL濃鹽酸于1 L容量瓶中,用水定容、混勻。

5 mmol/L乙酸銨:稱取0.385 g乙酸銨于燒杯中,用1 L水溶解、混勻,過(guò)濾后使用。

4%乙酸溶液(體積分?jǐn)?shù)):量取20.0 mL乙酸,加入480 mL水,混勻。

1.4 樣品處理

密胺制品:稱取5.00 g密胺樹脂于內(nèi)襯錫紙的50 mL燒杯中,用不銹鋼片壓實(shí),將錫紙包裹好。將燒杯置于130 ℃烘箱中,放置1 h,取出樣品冷卻至室溫。該樣品為自制密胺制品。

用于水解的密胺制品粉末的制備:用電鉆分別鉆取自制密胺制品及16批次密胺餐具,獲得密胺制品粉末。

密胺制品粉末水解溶液的制備:分別稱取0.06 g密胺制品粉末于2 mL塑料離心管中,用4.5 mL鹽酸溶液分3次洗滌,棄去洗液;再用4.5 mL鹽酸溶液將粉末全部轉(zhuǎn)移至25 mL水熱反應(yīng)釜聚四氟乙烯內(nèi)罐中,封罐;將水熱反應(yīng)釜置于110 ℃烘箱中,放置(60±5) min;取出,冷卻至室溫,開罐,將罐中的粉末和液體全部轉(zhuǎn)移至100 mL比色管中,用水洗滌罐內(nèi)壁,將洗滌液轉(zhuǎn)移至同一比色管中,用水定容到刻度,渦旋混勻;取約1 mL溶液過(guò)聚醚砜濾膜,待測(cè)。

密胺餐具遷移實(shí)驗(yàn):對(duì)16批次密胺餐具中的10批次進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn),每批次樣品均按采用4%(體積分?jǐn)?shù))乙酸在100 ℃下浸泡0.5 h和4%(體積分?jǐn)?shù))乙酸在40 ℃下浸泡24 h這2個(gè)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?？紤]到樣品均為可重復(fù)使用,參考遷移試驗(yàn)通則GB31604.1—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品接觸材料及制品遷移試驗(yàn)通則》中的相關(guān)要求,本研究用于測(cè)試的樣品溶液均為第3次遷移液,即將樣品用新鮮模擬液按浸泡條件重復(fù)浸泡3次,取第3次浸泡液用于研究。

1.5 實(shí)驗(yàn)條件

1.5.1色譜條件 月旭Ultimate HILIC amide色譜柱(100 mm×2.1 mm×5 μm);流動(dòng)相:5 mmol/L乙酸銨(A)-乙腈(B);梯度洗脫:0～1.0 min(10%A),1.0～6.0 min(10%～30%A),6.0～10.0 min(30%A),10.0～11.0 min(30%～10%A),11.0～15.5 min(10%A);流速0.40 mL/min;柱溫為室溫;進(jìn)樣量2 μL。

1.5.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源正離子(ESI+)模式,信息相關(guān)掃描方式(IDA),噴霧電壓3 500 V,噴霧氣壓強(qiáng)414 kPa,輔助加熱氣壓強(qiáng)414 kPa,氣簾氣壓強(qiáng)276 kPa,溫度650 ℃,碰撞氣壓強(qiáng)48 kPa。TOF MS條件:質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000,采集時(shí)間0.3 s, 去簇電壓(DP)60 V,碰撞能10 V。TOF MS/MS條件:質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 000,采集時(shí)間0.1 s,去簇電壓60 V,碰撞能20 V。

采用SCIEX OS軟件的Analytical模塊自動(dòng)提取色譜峰,Explorer模塊手動(dòng)提取色譜峰,質(zhì)量提取窗口0.04 u。Explorer模塊的“Formula Finder”功能用于分子式檢索,“Fragments pane”功能用于推測(cè)離子碎片的化學(xué)結(jié)構(gòu)以驗(yàn)證解析結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

密胺制品的預(yù)期水解產(chǎn)物主要為含氨基、羥基的強(qiáng)極性成分,采用常見的C18、C8反相色譜柱會(huì)導(dǎo)致水解產(chǎn)物在色譜柱上沒(méi)有保留,均在色譜柱死時(shí)間附近出峰,無(wú)法通過(guò)保留時(shí)間、色譜峰形等條件分析化學(xué)成分,且各成分及其裂解質(zhì)譜峰可能相互干擾,從而導(dǎo)致錯(cuò)誤判斷。參考文獻(xiàn)[15],采用氨基柱(親水性柱、HILIC)進(jìn)行色譜分離,以增強(qiáng)水解成分的色譜保留;在水相中添加乙酸銨,以提高方法的穩(wěn)定性,改善色譜峰形。經(jīng)流動(dòng)相梯度洗脫條件優(yōu)化后,三聚氰胺的保留良好,保留時(shí)間為2.3 min(在0.4 mL/min流速下,色譜柱的死時(shí)間約為0.6 min),且洗脫程序在較強(qiáng)的洗脫條件下(30%水相)保持4 min,以使保留較強(qiáng)的成分被洗脫,獲得盡量多的成分信息。

根據(jù)儀器的溶劑流速-氣體流速-氣體溫度推薦參數(shù)(當(dāng)化合物性質(zhì)穩(wěn)定時(shí),輕微改變推薦離子源參數(shù)不會(huì)對(duì)化合物的響應(yīng)產(chǎn)生顯著影響,在非靶向篩查時(shí),通常采用推薦離子源參數(shù))設(shè)置質(zhì)譜離子源條件。采用單去簇電壓(DP spread=0)、單碰撞能(CE spread=0)參數(shù)設(shè)置,降低1次采集循環(huán)采集的譜圖數(shù),增加單張質(zhì)譜圖的采集時(shí)間,提高質(zhì)量穩(wěn)定性。

參考文獻(xiàn)[16-18],采用鹽酸這一較為常見的氨基樹脂水解促進(jìn)劑,在可預(yù)期的最嚴(yán)苛條件下對(duì)樣品進(jìn)行水解,最終水解液中仍存在大量粉末,只有少部分樣品發(fā)生水解,但已經(jīng)能夠反映產(chǎn)品在極端嚴(yán)苛條件下的水解情況。

2.2 質(zhì)量誤差和三聚氰胺工作曲線

由于密胺制品的預(yù)期水解產(chǎn)物為含三聚氰胺結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分,因此采用三聚氰胺作為數(shù)據(jù)采集質(zhì)量穩(wěn)定性的質(zhì)控物質(zhì)。在1.5節(jié)條件下,序列中三聚氰胺準(zhǔn)分子離子峰質(zhì)荷比測(cè)量值與理論值的示值相對(duì)誤差均小于5×10-6。

2.3 水解溶液中化合物的鑒定

根據(jù)所提取色譜峰的精確相對(duì)分子質(zhì)量推測(cè)分子式,根據(jù)密胺制品的合成原理推測(cè)化學(xué)結(jié)構(gòu)[3,9,19],再用SCIEX OS Fragment pane(FP)功能結(jié)合化學(xué)成分的二級(jí)質(zhì)譜碎片驗(yàn)證化學(xué)結(jié)構(gòu)的合理性。

由于三聚氰胺環(huán)結(jié)構(gòu)是相對(duì)穩(wěn)定的共軛結(jié)構(gòu),三聚氰胺-甲醛樹脂固化后主要形成以>N—CH2—N<和>N—CH2—O—CH2—N<橋聯(lián)鍵(還可能有—NH—橋聯(lián)鍵)連接的三聚氰胺環(huán)[20-21]。理論上,酸水解反應(yīng)會(huì)發(fā)生在橋聯(lián)鍵上,產(chǎn)生三聚氰胺-甲醛寡聚物及其甲醛衍生物、三聚氰胺-甲醛衍生物,三聚氰胺-甲醛衍生物可進(jìn)一步水解產(chǎn)生三聚氰胺,三聚氰胺上的胺基可生成羥基取代衍生物。三聚氰胺-甲醛寡聚物及其甲醛衍生物的特征碎片離子有m/z127.07、139.07、151.07、163.07、169.08、181.08、277.14、289.14等,示于圖1。當(dāng)水解成分中含有這些特征碎片離子時(shí),可推斷為三聚氰胺-甲醛寡聚物。通過(guò)水解成分分子式中的氮原子數(shù)可以推斷寡聚物中的三聚氰胺環(huán)數(shù)(每個(gè)三聚氰胺環(huán)含6個(gè)氮原子)。分子式中的碳原子數(shù)-3×三聚氰胺環(huán)數(shù)=結(jié)構(gòu)中的亞甲基數(shù),以此推斷三聚氰胺-甲醛寡聚物可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)。部分檢出成分可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖2。如,成分8、9為含有2個(gè)三聚氰胺環(huán)、2個(gè)亞甲基和1個(gè)氧原子的同分異構(gòu)體;成分8存在m/z277.14[M+H-H2O]+碎片離子,可見結(jié)構(gòu)中存在1個(gè)羥甲基;成分9只有m/z127.07、139.07碎片離子,結(jié)構(gòu)中不存在羥甲基,而是2個(gè)三聚氰胺環(huán)通過(guò)醚鍵相連。

注:圖中質(zhì)子加和位置和正電荷所在位置未經(jīng)驗(yàn)證圖1 三聚氰胺、三聚氰胺-甲醛寡聚物及其甲醛衍生物的特征碎片離子Fig.1 Characteristic fragment ions of melamine, melamine-formaldehyde oligomer and its fromaldehyde derivatives

圖2 部分檢出成分可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.2 Possible chemical structures of some components detected in hydrolysis solutions of melamine-formaldehyde products

三聚氰胺的特征碎片離子有m/z85.05[M+H-42]、68.02[M+H-59]、60.06、110.05[M+H-17]。成分41的準(zhǔn)分子離子為m/z112.061[C3H5N5+H]+,特征碎片離子為m/z70.04[M+H-42]和68.02,與三聚氰胺具有相似的裂解方式和特征碎片離子,且分子式比三聚氰胺少NH,推測(cè)為2,4-二氨基-1,3,5-三嗪。成分42的分子式C3H5N5O及特征碎片離子為m/z86.04[M+H-42]、69.01[M+H-59],與文獻(xiàn)[9,15]相同,推測(cè)為三聚氰酸二酰胺。成分43的特征碎片離子有m/z85.05[M+H-56]、99.07[M+H-42]、82.04[M+H-59]、60.06,與三聚氰胺具有相似的裂解方式和特征碎片離子,且分子式比三聚氰胺增加CH2,推測(cè)為甲基三聚氰胺。成分44的特征碎片離子有m/z100.05[M+H-42]、86.04[M+H-56]、83.02[M+H-59],與成分42具有相似的裂解方式,且分子式增加CH2。成分45的特征碎片離子有m/z127.07[M+H-43]、153.05[M+H-17]、85.05、110.05,且分子式比三聚氰胺多CHNO。成分46的特征碎片離子有m/z153.09[M+H-18]、141.09[M+H-30]、124.06[M+H-47],與成分2具有相似的裂解方式,且分子式比成分2多CH2。成分47的分子式由2個(gè)三聚氰胺環(huán)脫去1個(gè)NH3,表明密胺樹脂固化后存在由氮原子直接橋聯(lián)2個(gè)三聚氰胺環(huán),主要的碎片離子并未有單一的三聚氰胺環(huán),通過(guò)氮原子直接橋聯(lián)的2個(gè)三聚氰胺環(huán)結(jié)合得更緊密。成分48的分子式為C22H44N6O9,準(zhǔn)分子離子峰為[M+NH4]+,且存在較弱的m/z89.06、133.09、177.11、221.14、265.16等典型的聚乙二醇碎片離子。成分49～53與成分48類似,成分48～53分子式依次增加C2H4O。成分55的分子式及特征碎片離子與文獻(xiàn)[22]報(bào)道一致,推測(cè)為三乙醇胺。成分56的分子式為C8H19NO4,比三乙醇胺增加C2H4O,特征碎片離子為m/z150.11[M+H-C2H4O]、132.10[M+H-C2H4O-H2O]、 114.09、88.08、70.07,與三乙醇胺相同,推測(cè)為三乙醇胺單乙二醇醚。成分57的分子式為C10H23NO5,比三乙醇胺增加2個(gè)C2H4O,特征碎片離子為m/z220.155[M+H-H2O]、176.13[M+H-H2O-C2H4O]、132.10、114.09,推測(cè)為三乙醇胺雙乙二醇醚。成分54的分子式為C5H13NO2,特征碎片離子為m/z102[M-H2O]、58[M-H2O-C2H4O],與三乙醇胺類似,推測(cè)為N-甲基二乙醇胺。成分58～61未檢測(cè)到明顯的子離子碎片,推測(cè)母離子為[M+Na]+,各成分分子式依次增加C5H8O4(精確相對(duì)分子質(zhì)量132.042 u),且相對(duì)分子質(zhì)量最小的成分為C10H18O9,推測(cè)均為C5H10O5的脫水縮合物,屬于多糖醇,具體結(jié)構(gòu)未明確,其提取離子色譜圖示于圖3。

圖3 成分58～61的提取離子色譜圖Fig.3 Extraction ion chromatogram of component 58-61

在17份密胺制品的水解溶液中發(fā)現(xiàn)61種化學(xué)成分,包括1種三聚氰胺(成分1),5種三聚氰胺-甲醛衍生物(成分2～6),33種三聚氰胺甲醛寡聚物及其甲醛衍生物(成分8～14、16～22、24～31、33～39),7種三聚氰胺結(jié)構(gòu)類似物(成分41～47),6種三聚氰胺-甲醛-聚乙二醇衍生物(成分48～53),4種乙醇胺類(成分54～57),4種多糖醇類(成分58～61)。各成分的精確分子質(zhì)量、分子式、二級(jí)碎片離子、保留時(shí)間等信息列于表1。

表1中,碎片離子采用相對(duì)豐度由高到低排列,大部分碎片離子可通過(guò)FP提供的裂解方式解釋。理論上,成分3應(yīng)為三聚氰胺的同一氮原子二羥甲基衍生物,但FP功能無(wú)法計(jì)算解釋m/z139.073碎片離子。成分3和4的提取離子色譜圖示于圖4,質(zhì)譜圖示于圖5。含羥甲基的三聚氰胺甲醛寡聚物可以同時(shí)存在[M+H]+和[M+H-H2O]+準(zhǔn)分子離子峰,且可能[M+H-H2O]+響應(yīng)更高,可檢測(cè)到的三聚氰胺-甲醛低聚物最多含有6個(gè)三聚氰胺環(huán)。

圖4 成分3和4的提取離子色譜圖Fig.4 Extraction ion chromatogram of component 3 and 4

圖5 成分3(a)和4(b)的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectra of fragment ions of component 3 (a) and 4 (b)

在一定條件下,三聚氰胺的胺基會(huì)逐步被羥基取代,生成三聚氰酸二酰胺、三聚氰酸一酰胺和三聚氰酸[9]。在本實(shí)驗(yàn)條件下,只檢出三聚氰酸二酰胺(成分42)。

成分43、45、46是三聚氰胺的甲基取代衍生物及其酸解產(chǎn)物和羥甲基化產(chǎn)物,目前未見密胺制品中存在該類化合物或者以三聚氰胺的甲基取代衍生物為起始物質(zhì)合成密胺-甲醛樹脂的報(bào)道。GB 9685—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》未列入三聚氰胺甲基衍生物,該類成分的來(lái)源有待進(jìn)一步研究。

成分48～53為三聚氰胺的聚乙二醇衍生物,推測(cè)為密胺樹脂中添加了聚乙二醇[3-4],且聚乙二醇可與羥甲基三聚氰胺成醚。

成分54～57為三乙醇胺及其相關(guān)化合物。三乙醇胺是密胺樹脂合成添加劑之一,主要用于調(diào)節(jié)體系酸堿性[18]。

2.4 密胺餐具遷移液測(cè)試結(jié)果

10批次密胺餐具的遷移測(cè)試結(jié)果列于表2。除三聚氰胺及表2中的8種成分(1種三聚氰胺-甲醛衍生物、1種三聚氰胺-甲醛寡聚物、4種三聚氰胺結(jié)構(gòu)類似物、2種乙醇胺類)外,其他成分均未檢出。大部分批次樣品在高溫(100 ℃)條件下的檢出量高于長(zhǎng)時(shí)間(24 h)條件,同一化學(xué)成分在不同檢出批次的檢出量差別可達(dá)10倍以上。

表2 密胺餐具遷移液中測(cè)得的水解成分Table 2 Hydrolyzate detected in migration solution from 10 melamine-formaldehyde tableware samples

2.5 水解成分的安全性

三乙醇胺在多種食品接觸材料中的特定遷移限量為0.05 mg/kg[22],重復(fù)攝入三乙醇胺會(huì)對(duì)生命體產(chǎn)生肝、腎損傷。在有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站(Pub Chem,網(wǎng)址:https:∥pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和Toxtree平臺(tái)(網(wǎng)址:http:∥toxtree.sf.net/predict)檢索和預(yù)測(cè)成分2、7、41、42、43、45毒性。Pub Chem數(shù)據(jù)庫(kù)可檢索到:成分42能夠?qū)е乱暰W(wǎng)膜退化,成分43小鼠腹腔注射半數(shù)致死量為270 mg/kg,成分45存在急性毒性(Acute Tox. 4)、皮膚刺激(Skin Irrit. 2)和眼刺激(Eye Irrit. 2A)的危害,其他成分尚未有毒性數(shù)據(jù)。Toxtree平臺(tái)無(wú)法對(duì)上述6種成分進(jìn)行分類和毒性預(yù)測(cè)。

Toxtree無(wú)法預(yù)測(cè)三聚氰胺-甲醛衍生物、三聚氰胺-甲醛寡聚物及其甲醛衍生物的毒性數(shù)據(jù),但相關(guān)成分在胃酸條件下均可進(jìn)一步水解產(chǎn)生甲醛和三聚氰胺,其毒性不可忽略。

3 結(jié)論

本研究在密胺制品酸性高溫水解溶液中檢出61種成分,包括三聚氰胺、三聚氰胺-甲醛衍生物、三聚氰胺甲醛寡聚物及其甲醛衍生物、三聚氰胺結(jié)構(gòu)類似物、三聚氰胺-甲醛-聚乙二醇衍生物、乙醇胺類、多糖醇類等。部分成分可在密胺餐具的酸性食品模擬物中遷出,且不同樣品的檢出量存在較大差異。這些可遷出成分存在潛在的食品安全風(fēng)險(xiǎn),有待進(jìn)一步研究。