青蒿素對急性胰腺炎腺泡細胞炎癥、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機制研究

寨 旭，裴紅紅，劉 俊，丁新愛

（西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院急診科，西安 710006）

蛋白酪氨酸激酶2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與激活因子3（JAK2/STAT3）通路是常見的調(diào)節(jié)細胞炎癥、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的通路[1]。研究[2]證實，JAK2/STAT3通路的失活能夠減輕重癥急性胰腺炎大鼠的炎癥反應(yīng)；而青蒿素抑制JAK2/STAT3通路激活促進肝癌細胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。因此，推測青蒿素通過JAK2/STAT3通路可改善急性胰腺炎損傷。本研究以雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細胞為研究對象，分析AR42J細胞的炎癥反應(yīng)、遷移、侵襲能力和EMT標志物的水平，為急性胰腺炎治療提供新的理論方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 鼠胰腺炎腺泡（AR42J）細胞購自河南省工業(yè)微生物菌種工程技術(shù)研究中心。

1.1.2 藥品與試劑 青蒿素、雨蛙素、JAK2/STAT3通路抑制劑AG490和激動劑colivelin（上海源葉公司）；胎牛血清（FBS）、F12-K培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；Transwell小室（美國Corning）；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（杭州主諾生物技術(shù)有限公司）；細胞計數(shù)試劑盒（CCK-8）[西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司]；青-鏈霉素混合液、0.1%結(jié)晶紫水溶液、基質(zhì)膠、4%甲醇（北京索萊寶科技有限公司）；胰酶細胞消化液、RIPA裂解液、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、脫脂奶粉（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；鼠源[JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、E-鈣粘蛋白（E-cadherin）、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纖連蛋白（FN）及β-actin一抗]、HP標記的山羊抗鼠IgG（二抗）（武漢三鷹公司）。

1.1.3 儀器 H4-20kr型低溫高速離心機24孔板轉(zhuǎn)子（湖南可成儀器設(shè)備有限公司）；DMI1 LED型倒置顯微鏡（德國Leica）；Multiskan FC型酶標儀（賽默飛世爾科技）；311X型二氧化碳培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技）；DYX-1A型低負壓吸引器（上海寶佳醫(yī)療器械有限公司）；Mini-PROTEAN?Tetra小型垂直電泳儀（美國BIO-RAD）；OI1000型凝膠成像系統(tǒng)（廣州廣儀儀器有限公司）；SK-L330-Pro型搖床[大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）股份公司]等。

1.2 實驗方法

1.2.1 AR42J細胞培養(yǎng) 將凍存的AR42J細胞復(fù)蘇，接種于含F(xiàn)12-K培養(yǎng)基（20% FBS和1%青-鏈霉素混合液）的培養(yǎng)皿中，置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種后第1天換液，此后每2～3 d進行培養(yǎng)液的更換，細胞傳代在細胞貼壁數(shù)＞80%時進行，取AR42J（對數(shù)生長期）進行后續(xù)實驗。

1.2.2 分組及給藥 胰酶細胞消化液消化處于對數(shù)生長期的AR42J細胞，收集細胞消化混合液，1 000 rpm·min-1離心5 min，向細胞沉淀中加入適量培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，接種于培養(yǎng)板或者培養(yǎng)皿中。

1.2.2.1 青蒿素實驗濃度篩選 將AR42J細胞分為對照組、雨蛙素組和實驗組，對照組細胞不做處理，雨蛙素組細胞用100.0 nmol·L-1的雨蛙素干預(yù)24 h[4]，實驗組細胞先用100.0 nmol·L-1的雨蛙素干預(yù)24 h，再加入12.5 μmol·L-1、25.0 μmol·L-1、50.0 μmol·L-1和100.0 μmol·L-1青蒿素培養(yǎng)24 h和48 h，隨后對細胞活力進行檢測篩選出青蒿素的最佳作用濃度。

1.2.2.2 實驗分組與干預(yù) 將細胞分為6組，分別為對照組（處理如上）、雨蛙素組（處理如上）、青蒿素組、AG490組、抑制劑組、激動劑組，青蒿素組是在雨蛙素組基礎(chǔ)上加入50.0 μmol·L-1青蒿素，AG490組是在雨蛙素組基礎(chǔ)上加入50.0 μmol·L-1AG490，抑制劑組是在青蒿素組基礎(chǔ)上加入50.0 μmol·L-1AG490，激動劑組是在青蒿素組基礎(chǔ)上加入50.0 μg·mL-1JAK2/STAT3信號通路激動劑colivelin，每組設(shè)置3個復(fù)孔，干預(yù)24 h。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞活力 細胞給藥24 h后，向96孔板的各孔中加入10 μL CCK-8溶液，在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，用酶標儀檢測各孔在450 nm處的吸光度（OD）值。細胞活力（%）=（雨蛙素組或?qū)嶒灲MOD值/對照組OD值）×100%。

1.2.4 ELISA試劑盒檢測炎癥因子表達水平 細胞給藥24 h后，收集細胞上清液，4 000 rpm·min-1離心20 min，離心后保留細胞上清液并按照ELISA試劑盒說明書操作以檢測上清液中白細胞介素（IL）-1β和腫瘤壞死因子（TNF）-α的表達水平。

1.2.5 Transwell小室法檢測細胞的遷移能力 細胞給藥24 h后，收集細胞沉淀，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞并制成濃度為每毫升5×105個的細胞懸液，取0.25 mL置于小室上方，在下室中加入0.5 mL完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。擦去上室細胞，對下室細胞進行4%多聚甲醛固定20 min、0.1%結(jié)晶紫染色10 min。干燥后，在光學(xué)顯微鏡下對下室表面染色陽性細胞進行觀察并拍照（5個視野/小室）。Image-J圖像分析軟件對染色陽性細胞進行細胞計數(shù)。

1.2.6 Transwell小室法檢測細胞的侵襲能力 細胞給藥24 h后，收集細胞沉淀，用無血清培養(yǎng)基重懸細胞沉淀并制備成濃度為每毫升5×105個的細胞懸液。將-20℃冰箱中的基質(zhì)膠提前放入4℃冰箱中融化，按照2:1的比例用無血清培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠并加入到24孔板上室中，基質(zhì)膠凝固后向上室中加入200 μL細胞懸液，下室中加入600 μL含20% FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。取出上室，棄上室中的培養(yǎng)基并將上室內(nèi)細胞擦除，用4%甲醇在室溫下進行固定30 min，0.1%結(jié)晶紫在室溫下進行染色10 min，用顯微鏡進行觀察并拍照（5個視野/小室）記錄細胞侵襲情況。

1.2.7 蛋白免疫印跡（WB）法檢測相關(guān)蛋白表達水平 細胞給藥24 h后，用PBS清洗細胞，除去死去的細胞和培養(yǎng)液，隨后向待提蛋白的孔中加入適量RIPA裂解液，并置于冰上裂解30 min，收集細胞裂解混合液，于4℃離心機上以12 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心15 min，收集上清液，100℃高溫變性20 min。按照待檢測蛋白分子量配置適宜濃度分離膠和5%濃縮膠，每孔20 μL/孔樣品（30 μg蛋白）點樣，凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜，隨后5%脫脂奶粉進行封閉2 h，加入一抗（JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、FN及β-actin），4℃過夜孵育，洗滌后加入二抗，室溫搖床孵育2 h后加入顯影液，置凝膠成像系統(tǒng)中分析記錄。蛋白相對表達量=目的蛋白/內(nèi)參蛋白。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析，Image J 1.8.0計算遷移、侵襲細胞數(shù)和蛋白灰度值。多組間比較采用單因素方差分析；2組間比較，符合正態(tài)分布且方差齊時，采用Dunnett's t檢驗，不符合正態(tài)分布時，采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度青蒿素對雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細胞活力的影響

見圖1。

圖1 不同濃度青蒿素對雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細胞活力的影響

2.2 青蒿素抑制JAK2/STAT3通路活化降低雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細胞中促炎因子IL-1β和TNF-α的分泌水平

ELISA法檢測各組AR42J細胞上清液中IL-1β和TNF-α的表達水平，見圖2。

圖2 ELISA法測定各組細胞上清液中IL-1β和TNF-α的表達水平

2.3 青蒿素抑制JAK2/STAT3通路活化降低雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細胞的遷移能力

Transwell小室法檢測細胞的遷移能力，見圖3。

圖3 Transwell小室法檢測各組細胞的遷移能力

2.4 青蒿素抑制JAK2/STAT3通路活化降低雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細胞的侵襲能力

Transwell小室法檢測細胞的侵襲能力，見圖4。

圖4 Transwell小室法檢測各組細胞的侵襲能力

2.5 青蒿素抑制JAK2/STAT3通路活化減弱雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細胞的EMT進程

WB法檢測各組細胞中EMT相關(guān)蛋白表達水平，見圖5。

圖5 WB法檢測各組細胞中EMT蛋白表達水平

2.6 青蒿素抑制JAK2/STAT3通路活化

WB法檢測各組細胞中JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達水平，見圖6。

圖6 WB法檢測各組細胞中JAK2/STAT3通路蛋白表達水平

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，青蒿素顯著提升雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細胞的細胞活力，且50.0 μmol·L-1青蒿素干預(yù)雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細胞24 h的作用效果最好，可用于后續(xù)實驗。本研究發(fā)現(xiàn)青蒿素能夠減少IL-1β和TNF-α的分泌，改善雨蛙素誘導(dǎo)AR42J細胞的炎癥損傷。本研究檢測了AR42J細胞中EMT標志物的表達，發(fā)現(xiàn)雨蛙素促進AR42J細胞中N-cadherin、Vimentin和FN的蛋白表達，抑制E-cadherin的蛋白水平，從而增強了AR42J細胞的遷移、侵襲能力和EMT進程；同時，也發(fā)現(xiàn)青蒿素抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細胞的遷移、侵襲和EMT進程。

XIA等[5]發(fā)現(xiàn)檸檬素抑制JAK2/STAT3通路激活改善急性胰腺炎小鼠的胰腺組織的病理表現(xiàn)和炎癥反應(yīng)。本研究檢測了AR42J細胞中JAK2/STAT3通路關(guān)鍵蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)雨蛙素促進AR42J細胞中JAK2和STAT3的磷酸化水平，激活JAK2/STAT3通路；同時，青蒿素逆轉(zhuǎn)了雨蛙素對p-JAK2和p-STAT3的促進作用，提示青蒿素可能阻斷JAK2/STAT3通路活化。隨后，本次研究發(fā)現(xiàn)JAK2/STAT3通路抑制劑AG490能夠減輕雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細胞的炎癥反應(yīng)，緩解細胞的遷移、侵襲和EMT進程，且AG490與青蒿素在雨蛙素刺激的AR42J細胞中發(fā)揮協(xié)同累加作用，而JAK2/STAT3信號通路激動劑colivelin則逆轉(zhuǎn)了青蒿素對雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細胞的影響。以上結(jié)果顯示青蒿素阻遏JAK2/STAT3通路活化抑制雨蛙素誘導(dǎo)的AR42J細胞炎癥反應(yīng)、遷移、侵襲和EMT進程。