王 英，李云飛，陳庚超，朗帕實，袁梓程，高 燕，彭 云，吳思超*

（1.昆明海關(guān)技術(shù)中心,云南 昆明 650208；2.黃埔海關(guān)技術(shù)中心,廣東 東莞 523071）

三七作為一種重要的藥用植物資源和保健食品[1]，具有抗炎、抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、止血活血等藥理作用[2-7]。由于三七在生長過程中，極易遭受各種病蟲的侵害，因此在種植過程中難免會使用農(nóng)藥，藥農(nóng)過量使用農(nóng)藥防治三七的病蟲害，導(dǎo)致三七中的農(nóng)藥殘留超標[8-9]，不僅對人類健康造成威脅還造成嚴重的環(huán)境污染。由于農(nóng)藥殘留超標導(dǎo)致我國出口中藥被封存、銷毀或者退貨的情形[10-11]時有發(fā)生，因此建立三七中農(nóng)藥多殘留的快速篩查方法十分必要。

三七在種植過程中使用的農(nóng)藥主要包括殺蟲劑、殺菌劑、除草劑、生長調(diào)節(jié)劑等，按照化學(xué)結(jié)構(gòu)可以分為有機氯、有機磷、擬除蟲菊醋和氨基甲酸酯等類型[8]。目前農(nóng)藥殘留前處理凈化方法主要包括凝膠滲透色譜法(GPC)[12]、固相萃取法(SPE)[13]以及QuEChERS 法[14]。檢測技術(shù)上主要采用氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、高分辨質(zhì)譜法等[15-18]。隨著農(nóng)藥種類的不斷增加，亟須發(fā)展高通量、快速有效的同時篩查多類農(nóng)藥殘留的檢測方法[19]，四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法具有選擇性高、靈敏度高、掃描速度快等優(yōu)點，在沒有標準物質(zhì)的情況下通過全掃描數(shù)據(jù)實現(xiàn)定性確證[20]，適用于多種目標化合物的篩查和確證分析[21]。

本實驗采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜建立了三七中66 種農(nóng)藥殘留的快速篩查檢測方法，較普通液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜具有更高的分辨率，該方法前處理簡單、快捷、實用性強，可為保障三七安全性評估提供參考，同時也可為解決中藥中多種農(nóng)藥殘留檢測問題、保障中藥質(zhì)量提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三七藥材購于云南鴻翔一心堂藥業(yè)（集團）股份有限公司；66 種農(nóng)藥液體混合對照品溶液（具體種類詳見表1）購自上海安譜實驗科技股份有限公司，質(zhì)量濃度為50 mg/L；甲醇（色譜純）購自美國Sigma 公司；乙腈（色譜純）購自美國Sigma 公司；甲酸銨、冰乙酸（色譜純）購自上海安譜實驗科技股份有限公司；甲酸（分析純）購自西隴科學(xué)股份有限公司；無水MgSO4和NaCl（分析純）、石墨化碳黑氨基復(fù)合SPE 小柱均購自上海安譜實驗科技股份有限公司；300 mgPSA+300 mg C18+900 mg 無水MgSO4+90 mgGCB，購自山東青云實驗耗材有限公司。

表1 66 種農(nóng)藥的分子式、保留時間、相對質(zhì)量偏差、母離子和碎片離子Tab.1 Molecular formulas,retention times,relative mass deviations,precursor ions and fragment ions of the 66 pesticide residues

1.2 儀器與設(shè)備

UltiMate 3000 Q-Exactive 超高效液相色譜－四級桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Orbitrap HRMS，美國Thermo Fisher 公司）；高速冷凍離心機（3-30K，德國Sigma 公司）；渦旋振蕩器（HS501，德國IKA 公司）；分析天平（XPE105，德國Sigma 公司）；超純水系統(tǒng)（電導(dǎo)率為18.2 MΩ，美國Millipore公司）；氮吹儀（TurboVap LV，瑞典Biotage 公司）；旋渦混合儀(瑞士Mettler Toledo)；凝膠色譜儀（GPC Ultra 10836，德國LC Tech 公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準品的配置

精密量取上述66 種農(nóng)藥液體混合對照品溶液1 mL 置于5 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度配置為10 mg/L 的標準儲備液，置于4 ℃冰箱避光保存；精密量取上述適量農(nóng)藥標準儲備液0.5 mL置于5 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度配置為各目標化合物相應(yīng)質(zhì)量濃度（1.0 mg/L）的混合標準工作液。

1.3.2 數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

通過全掃描模式對1.0 mg/L 的農(nóng)藥混合標準工作液進行分析，得到66 種農(nóng)藥的一級離子流圖，保留時間、母離子精確質(zhì)量數(shù)等信息，同時采用ddMS2二級質(zhì)譜掃描模式，獲得目標化合物的二級質(zhì)譜圖和特征碎片離子[19]，利用Trace finder 軟件對每種農(nóng)藥的保留時間，母離子、子離子精確質(zhì)量數(shù)及二級特征碎片離子與各自目標化合物名稱、化學(xué)式相關(guān)聯(lián)進行數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建（見表1）。

根據(jù)建立的數(shù)據(jù)庫對三七樣品中的農(nóng)藥殘留進行定性篩查確證，依據(jù)保留時間、精確質(zhì)量數(shù)偏差與數(shù)據(jù)庫進行匹配，若獲得2 個或2 個以上特征碎片離子匹配，質(zhì)量數(shù)的偏差小于或等于5.00×10-6，保留時間偏差在±2.5%之內(nèi)，可以判定試樣中含有該種農(nóng)藥。以各目標化合物母離子作為定量離子，并采用基質(zhì)標曲外標法定量[19]。

1.3.3 實驗條件的優(yōu)化

1.3.3.1 色譜條件的優(yōu)化

由于66 種農(nóng)藥的理化性質(zhì)各異，本實驗分別比較了Accucore aQ 色譜柱(150 mm×2.1 mm,2.6 μm)、Hypersil GOLD C18 色譜柱（100×2.1 mm，1.9 μm）、ACQUITY BEH C18 色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)對目標化合物的分離效果，發(fā)現(xiàn)Accucore aQ 色譜柱對66 種農(nóng)藥有較好的分離效果。同時，比較了水相中添加不同濃度的甲酸、乙酸、甲酸銨，有機相為甲醇、乙腈的不同流動相的色譜分離效果，發(fā)現(xiàn)5 mmol/L 甲酸銨（含0.1%甲酸）+甲醇組合能夠更好地分離目標化合物并能提供良好的色譜峰型，同時具有較高的響應(yīng)強度，總離子色譜圖見圖1。

圖1 Accucore aQ 色譜柱總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of Accucore aQ column

1.3.3.2 前處理方式的優(yōu)化

本研究分別考察了GPC、石墨化碳黑氨基復(fù)合SPE 小柱和經(jīng)典的QuEChERS 方法3 種前處理方法。以空白三七樣品10 μg/kg 為加標濃度進行加標回收實驗，其回收率結(jié)果如圖2 所示。由圖2可知，QuEChERS 方法有64 個化合物的加標回收率集中在70%～120%，優(yōu)于其他兩種前處理方法，因此本實驗采用QuEChERS 方法進行前處理，該方法具有簡便、快速、高效、靈敏度高等優(yōu)勢非常適合多類農(nóng)藥殘留的檢測前處理。

圖2 66 種農(nóng)藥不同前處理回收率(10 μg/kg) (n=3)Fig.2 Recoveries of 66 kinds of pesticide residues under different pretreatments (10 μg/kg) (n=3)

1.3.4 三七樣品的測定

1.3.4.1 樣品前處理

采用QuECHERS 方法對三七樣品進行前處理：精密稱定三七樣品粉末（過三號篩）3 g，加入1%冰乙酸溶液15 mL，渦旋放置30 min，精密加入乙腈15 mL，震蕩提取5 min，加入無水MgSO4和NaCl（4 g+1 g），渦旋混勻之后4 200 r/min 離心5 min，取上清液10 mL 加入凈化劑（300 mg PSA+300 mg C18+900 mg 無水MgSO4+90 mg GCB）渦旋混勻，震蕩提取5 min 后，4 200 r/min 離心5 min，通過0.22 μm 有機相微孔濾膜，待測定。

1.3.4.2 色譜條件

色譜柱：Accucore aQ 色譜柱(150 mm×2.1 mm,2.6 μm)；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：A為水相由5 mmol/L 甲酸銨（含0.1%甲酸）水溶液組成；B為有機相由甲醇溶液組成；梯度洗脫方式，具體系統(tǒng)程序詳見表2。

表2 梯度洗脫表Tab.2 Gradient elution program

1.3.4.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；正離子Full MS-ddMS2掃描模式；噴霧電壓：3 000 V；鞘氣壓力：40 arb；輔助氣壓力：10 arb；離子源溫度：325 ℃；離子傳輸管溫度：300 ℃；碰撞氣：Medium；一級質(zhì)譜掃描范圍m/z 100～1 000；二級質(zhì)譜掃描范圍m/z 50～800；一級質(zhì)譜全掃描分辨率70 000，二級分辨率為17 500。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)效應(yīng)考察

分別以空白三七樣品經(jīng)上述前處理方法后獲得的基質(zhì)溶液和甲醇為溶劑，分別配置質(zhì)量濃度100 μg/L 的農(nóng)藥混標溶液，測定各目標化合物的峰面積響應(yīng)值。基質(zhì)效應(yīng)計算公式[22]如下：

式中：A1為基質(zhì)溶液中目標化合物響應(yīng)值；A2為甲醇溶劑中目標化合物響應(yīng)值。

當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)值大于100%時為基質(zhì)增強效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)值小于100%時為基質(zhì)抑制效應(yīng)[23]。實驗結(jié)果表明，27 種農(nóng)藥產(chǎn)生了不同程度基質(zhì)抑制效應(yīng)，為克服基質(zhì)效應(yīng)的影響，采用基質(zhì)匹配外標法進行定量分析。

2.2 線性范圍與定量限

采用空白三七樣品經(jīng)上述前處理方法制得空白基質(zhì)溶液，配置成質(zhì)量濃度分別為0、0.005、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L 的農(nóng)藥混合標準工作液，以母離子作為定量離子，以各目標化合物色譜峰面積(y)為縱坐標，質(zhì)量濃度(x，μg/L)為橫坐標繪制標準曲線。實驗結(jié)果表明，66 種農(nóng)藥在0.005～0.5 mg/L 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，R2均大于0.99。用基質(zhì)空白溶液逐級稀釋標準溶液至儀器所能檢出的最低濃度確定為檢出限(limit of detection，LOD)[24]，得到各目標化合物檢出限(LOD)在0.005～0.01 mg/kg 范圍內(nèi)，可滿足痕量分析檢測要求，即樣品中待測組分含量低于100 μg/g 的分析工作[25](見表3)。

表3 66 種農(nóng)藥線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限Tab.3 The linear equation,correlation coefficient and LODs of 66 pesticide residues

2.3 回收率與精密度

為驗證檢測方法的準確度、精密度，向空白三七樣品中分別添加質(zhì)量濃度分別為10、50、100 μg/L 的66 種農(nóng)殘混合標準溶液，按照相同的前處理方法和儀器條件進行檢測，各水平重復(fù)6 次。以測定結(jié)果的相對標準偏差考察方法的精密度，并計算不同濃度的加標回收率。由表4 可知，66 種農(nóng)藥平均回收率在71.7%～110.3%之間，相對標準偏差(RSD)在1.2%～6.8%之間，說明本方法回收率高，精密度高，可用于三七中多種農(nóng)藥殘留的檢測分析。

表4 66 種農(nóng)藥加標回收率及相對標準偏差（n=6）Tab.4 The piked recoveries and relative standard deviations of 66 pesticide residues

2.4 實際樣品的測定

通過檢測市售三七樣品，進一步評估該方法在實際樣品檢測的實用性。將該方法應(yīng)用于50 個三七樣本進行非靶向篩查分析，將獲得的三七樣品的色譜信息和質(zhì)譜信息與數(shù)據(jù)庫進行搜索對比，確定所測三七樣品中含有農(nóng)藥烯酰嗎啉、惡霜靈、戊唑醇、甲基硫菌靈和苯醚甲環(huán)唑。

利用基質(zhì)匹配外標法，對待測三七樣品中的烯酰嗎啉、惡霜靈、戊唑醇、甲基硫菌靈和苯醚甲環(huán)唑進行定量分析，得到待測三七樣品中烯酰嗎啉含量為0.058～2.45 mg/kg、惡霜靈含量為0.045～1.38 mg/kg、戊唑醇含量為0.44～2.30 mg/kg、甲基硫菌靈含量為0.072～0.86 mg/kg、苯醚甲環(huán)唑含量為0.065～5.40 mg/kg。

3 結(jié)論

本研究基于超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜，建立了三七中66 種農(nóng)藥殘留的檢測方法，該方法快捷簡便、特異性好、靈敏度高、回收率好，可針對性地對農(nóng)藥殘留進行快速篩查。在沒有對照品的情況下，可與所建質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中一級、二級質(zhì)譜的精確質(zhì)量數(shù)和碎片離子信息等進行匹配，可以實現(xiàn)非目標化合物的定性篩查。該方法可為中藥農(nóng)藥殘留的快速篩查提供技術(shù)參考。