高糖、高脂飲食對(duì)小鼠腸道屏障功能及炎癥的影響

邵君琳，田苗新，王富康，孫奕煒，王光強(qiáng)，艾連中，夏永軍

（上海理工大學(xué) 上海 200093）

隨著生活水平的提高，越來(lái)越多的人受肥胖困擾，這與飲食習(xí)慣密不可分。高糖、高脂飲食（HSFD）的長(zhǎng)期攝入是造成肥胖的元兇之一，同時(shí)會(huì)伴隨一些并發(fā)癥。HSFD 具有較高能量，短期攝入后會(huì)使機(jī)體血糖和胰島素快速上升，脂肪組織積累，而脂肪組織的長(zhǎng)期堆積會(huì)引起血脂和肝功能異常，進(jìn)而增加冠心病、肝炎、代謝綜合征等發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[1]。多項(xiàng)研究顯示，長(zhǎng)期攝入高糖、高脂的飲食會(huì)打破機(jī)體固有免疫，引起全身慢性炎癥、心血管、神經(jīng)類等疾病的發(fā)生，其作用方式主要通過(guò)改變微生物群組成，激活或抑制相關(guān)受體和細(xì)胞以及影響線粒體功能等[2]。

炎癥性腸病（inflammatory bowel diseases，IBD）是一種嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的免疫機(jī)制失衡的慢性胃腸道疾病，臨床上主要將IBD 劃分為克羅恩氏?。–rohn's disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）兩類，其發(fā)病機(jī)制雖暫未明確，但一致認(rèn)為遺傳、環(huán)境、腸道屏障的缺陷是其最主要的致病因素[3]。其臨床表現(xiàn)為腹瀉、黏液膿血便等，該病治愈難度大且易于復(fù)發(fā)。目前對(duì)UC 常見(jiàn)的藥物治療主要包括抗炎藥、免疫抑制藥和腎上腺皮質(zhì)激素等。然而，這些治療方法具有許多缺點(diǎn)，例如腹部疼痛、高血壓和過(guò)敏反應(yīng)等。近年來(lái)，益生菌、糞菌移植、多糖、間充質(zhì)干細(xì)胞移植和中醫(yī)治療等為研究熱點(diǎn)，上述方法有明確的藥效和較少的副作用，用來(lái)預(yù)防和治療UC 及其并發(fā)癥[4]。

研究表明，HSFD 與炎癥性腸?。↖BD）之間存在一定聯(lián)系，其會(huì)引起脂肪過(guò)度積累，機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，腸道菌群紊亂，致病菌破壞黏液層結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生相關(guān)次級(jí)膽汁酸，造成腸上皮細(xì)胞功能障礙，從而促進(jìn)IBD 的發(fā)生[5]。腸上皮屏障功能障礙是潰瘍性結(jié)腸炎的主要致病因素，緊密連接結(jié)構(gòu)作為腸上皮屏障的主要部分，能防止腸腔內(nèi)的一些致病菌、病毒等進(jìn)入黏膜固有層和血液循環(huán)[6]。然而，HSFD 對(duì)小鼠結(jié)腸緊密連接結(jié)構(gòu)以及結(jié)腸炎癥的影響并不明確。本文考察HSFD 對(duì)小鼠腸道屏障功能、炎癥水平以及結(jié)腸的影響，為探究HSFD 與IBD 的內(nèi)在聯(lián)系、發(fā)生機(jī)制以及選擇合適的治療方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠（3 周齡，雄性，平均體質(zhì)量13 g±2 g），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006，購(gòu)于上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部。標(biāo)準(zhǔn)飼料購(gòu)自蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司，為了探討過(guò)多攝入脂肪和糖類對(duì)腸道的具體影響，對(duì)照飼料選取低糖、低脂飲食，高糖、高脂飲食TP26303 和低糖、低脂飲食TP26342 均購(gòu)于南通特洛菲飼料科技有限公司，成分表如表1 所示。

表1 飲食成分表Table 1 Diet composition table

髓過(guò)氧化物酶（MPO）試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇（highdensity lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒，南京建成生物工程研究所；便隱血試劑盒，貝索企業(yè)；阿利新藍(lán)、蘇木素，Sigma；伊紅Y、包埋石蠟、中性樹(shù)膠，國(guó)藥集團(tuán)；Trizol、DEPC處理水，上海生工生物有限公司；異丙醇、三氯甲烷、無(wú)水乙醇（分析純），Thermo Fisher Scientific；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、HiScript III RT SuperMix for qPCR，南京諾唯贊生物科技有限公司；qPCR SYBR Green Master Mix，翊圣生物有限公司；引物由華大基因合成異硫氰酸熒光素標(biāo)記葡聚糖（FITC-Dextran）（分子質(zhì)量40 000），上海源葉生物科技有限公司；Occludin 抗體、ZO-1 抗體，Abcam；ELISA 試劑盒，上海通蔚。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax i3x 型酶標(biāo)儀，奧地利美谷分子儀器有限公司；GT 200 研磨儀，北京格瑞德曼儀器設(shè)備有限公司；3-18K 冷凍離心機(jī)，德國(guó)Sigma 公司；Bio-rad S1000 梯度PCR 儀、電泳儀、凝膠成像儀，美國(guó)伯樂(lè)Bio-rad 生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品上海有限公司；NanoDrop 2000 分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Scientific；Light Cycler 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，羅氏制藥有限公司；病理切片機(jī)，德國(guó)Leica RM 2016 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)；組織攤烤片機(jī)，武漢俊杰JK-6 生物組織攤烤片機(jī)；顯微鏡，尼康E100 型生物顯微鏡；數(shù)碼單反相機(jī)，佳能550 D。

1.3 動(dòng)物分組和處理

小鼠生長(zhǎng)環(huán)境溫度控制在（22±2）℃，濕度為（50±10）%，自由飲食、飲水，以4 g/d 進(jìn)食量為參考，每12 h 晝夜交替。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的程序嚴(yán)格按照中國(guó)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的相關(guān)飼養(yǎng)規(guī)范和法律規(guī)定進(jìn)行，本研究遵循動(dòng)物試驗(yàn)委員會(huì)所制訂的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)為倫審-KYSB-2016-97，許可號(hào)：SCXK-（滬）-2013-0006。

小鼠經(jīng)過(guò)1 周的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，隨機(jī)分為高糖、高脂飲食（HSFD）組，低糖、低脂（LFD）組兩組，每組8 只，飲食干預(yù)4 周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每周記錄小鼠體重。第5 周末，小鼠禁食過(guò)夜，第2 天采用眼球取血的方式處死，立刻收集血液樣品，置于1.5 mL 的無(wú)菌離心管中，室溫靜置30～40 min 左右，4 ℃下4 500 r/min 離心10 min，小心分離血清，放入-80 ℃環(huán)境冷藏備用，避免反復(fù)凍融。迅速解剖小鼠，收集肝臟、結(jié)腸組織用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 小鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分 為了評(píng)估實(shí)驗(yàn)期間結(jié)腸炎癥狀的發(fā)展，每天對(duì)小鼠DAI 進(jìn)行監(jiān)測(cè)[7]。DAI 包括體重變化、便血情況和糞便形態(tài)。隱血試劑盒測(cè)量糞便中的潛血，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 疾病活性指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Disease activity index scoring standards

1.4.2 血清生化指標(biāo)測(cè)定 小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C 含量按照試劑盒要求測(cè)定[8]。

1.4.3 肝臟和結(jié)腸病理學(xué)檢測(cè) 肝臟進(jìn)行油紅O和HE 染色，結(jié)腸采用HE 和阿利新蘭染色。油紅O 是一種偶氮染料，作為一種強(qiáng)脂溶劑和染脂劑，溶于細(xì)胞和組織中的脂質(zhì)，用于顯示組織中脂質(zhì)的聚集情況[9]。HE 染色能夠使細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)則呈橙紅色。阿利新藍(lán)是一種大分子共軛染料，能將黏液層的黏蛋白染成藍(lán)色，腸道黏蛋白的變化用阿利新藍(lán)進(jìn)行評(píng)估[10]。肝臟和結(jié)腸組織采用多聚甲醛固定24 h 后，常規(guī)脫水處理、浸蠟包埋、切片，烤片并脫蠟、結(jié)腸和肝臟采用蘇木精伊紅染色，另取一份同樣操作的結(jié)腸切片進(jìn)行阿利新藍(lán)（pH 2.5）染色處理，然后在顯微鏡下觀察炎癥情況和黏膜損傷情況。

1.4.4 結(jié)腸長(zhǎng)度的測(cè)定 解剖后快速取小鼠結(jié)腸部位，卡尺測(cè)量盲腸末端至肛門(mén)的長(zhǎng)度。

1.4.5 髓過(guò)氧化物酶活性 準(zhǔn)確稱量結(jié)腸組織質(zhì)量，按照試劑盒要求進(jìn)行樣品前處理，檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織MPO 活性[11]。

1.4.6 FITC-葡聚糖檢測(cè)小鼠腸道通透性 小鼠禁食、禁水4 h 后，用異硫氰酸熒光素標(biāo)記葡聚糖（FITC-Dextran）（100 mg/mL，無(wú)菌PBS 配制，分子質(zhì)量40 000），120 μL/只，灌胃小鼠。灌胃4 h 后眼球取血，血液樣品靜置30～40 min，4 500 r/min 離心15 min，收集100 μL 血清。將100 mg/mL 異硫氰酸熒光素標(biāo)記葡聚糖（FITC-Dextran）稀釋為標(biāo)準(zhǔn)品。在激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm的條件下，用酶標(biāo)儀讀取吸光度值（OD 值）[15]。

1.4.7 小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白和黏液蛋白基因表達(dá)測(cè)定 取結(jié)腸約1 cm，Trizol 法提取RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將制備好的cDNA 置于-20℃中保存?zhèn)溆?，可長(zhǎng)期保存于-80℃。根據(jù)qPCR SYBR Green Master Mix 使用要求對(duì)ZO-1、Occludin、MUC-2 等基因進(jìn)行PCR 的擴(kuò)增。HPRT1 作為內(nèi)參基因，引物信息如表3 所示，2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表3 qPCR 引物序列Table 3 Primer sequence

1.4.8 結(jié)腸組織中ZO-1、Occludin、Muc-2、TNFα、IL-10 基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定 同1.3.8 節(jié)的方法，測(cè)定結(jié)腸中ZO-1、Occludin、Muc-2、TNFα、和IL-10 的基因相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表3。

1.4.9 免疫熒光法觀察及測(cè)定結(jié)腸組織中ZO-1、Occludin 的表達(dá) 取1～2 cm 結(jié)腸組織進(jìn)行同1.3.4節(jié)的組織包埋、切片后進(jìn)行室溫脫蠟，檸檬酸抗原修復(fù)液微波進(jìn)行修復(fù)，自然冷卻后PBS 洗滌3 次，每次5 min，甩干水分，加山羊血清封閉液，室溫30 min，甩掉封閉液，分別加入按一定比例配好的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，室溫復(fù)溫30 min，PBS 洗滌3次，每次5 min，蒸餾水洗滌3 次，每次5 min。加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育30 min 后PBS 及蒸餾水進(jìn)行洗滌。熒光顯色液中顯色10 min，PBS及蒸餾水進(jìn)行洗滌。再重復(fù)以上步驟更換一抗進(jìn)行第2 次孵育完成熒光雙標(biāo)。隨后，DAPI 核復(fù)染避光孵育10 min、封片、鏡檢，在不同染料的激發(fā)波長(zhǎng)下進(jìn)行拍照（紫外激發(fā)波長(zhǎng)330～380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)420 nm；FITC 綠光激發(fā)波長(zhǎng)465～495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515～555 nm；CY3 紅光激發(fā)波長(zhǎng)510～560 nm，發(fā)射波長(zhǎng)590 nm[13]。隨后用Image J 進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測(cè)定。

1.4.10 ELISA 檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中IL-10、TNFα 的水平 取2～3 cm 結(jié)腸準(zhǔn)確稱重后添加組織勻漿液，一般采用預(yù)冷的PBS（pH 7.4），研磨充分后10 000 g 離心10 min，隨后按照ELISA 說(shuō)明書(shū)取上清進(jìn)行檢測(cè)[14]。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。運(yùn)用Excel 進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 25.0 進(jìn)行單因素方差分析（Oneway ANOVA），當(dāng)P≤0.05 時(shí)，使用Duncan 檢驗(yàn)來(lái)比較各組間差異，P≤0.05 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 高糖、高脂飲食對(duì)小鼠體質(zhì)量及肝臟影響

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1a 所示，經(jīng)過(guò)1 周適應(yīng)性喂養(yǎng)后進(jìn)行HSFD 干預(yù)4 周。圖1c 結(jié)果顯示，較LFD 組，HSFD 干預(yù)組整個(gè)周期的體重顯著增加（P<0.01）。由圖1b 肝臟圖片可知，HSFD 干預(yù)組小鼠肝臟顏色偏黃，較脆弱，容易出現(xiàn)撕裂現(xiàn)象，這可能是甘油三酯的過(guò)度積累造成的[15]。肝臟油紅O染色顯示，HSFD 小鼠肝臟出現(xiàn)了較多紅色脂滴，且脂質(zhì)液滴發(fā)生積聚，LFD 對(duì)照組只能觀察到少數(shù)的紅色脂滴，這可能是HSFD 后，肝脂質(zhì)代謝功能障礙導(dǎo)致脂肪沉積在肝臟中，造成大面積脂滴生成。肝臟HE 染色顯示，HSFD 小鼠肝脂肪變性，且出現(xiàn)炎癥性細(xì)胞局灶性浸潤(rùn)（如圖1b 黑色箭頭所示）細(xì)胞出現(xiàn)膨脹，脂肪變性（圖1b 黃色箭頭所示），肝索和肝血竇位置無(wú)明顯邊界，而LFD 對(duì)照組肝細(xì)胞排列整齊，形態(tài)完整，可以清晰觀察到肝索位置?？偟膩?lái)說(shuō)，HSFD 會(huì)引起小鼠食欲亢進(jìn)，導(dǎo)致體重迅速增加，對(duì)肝臟細(xì)胞造成損傷，肝臟部位脂肪的過(guò)度積累可能會(huì)引起脂肪酸組成變化并影響肝腸軸，進(jìn)而影響腸道細(xì)胞[16]。

圖1 動(dòng)物喂養(yǎng)周期及高糖、高脂飲食對(duì)小鼠體質(zhì)量及肝臟影響Fig.1 Effects of animal feeding cycle and high-sugar and high-fat diet on weight and liver of mice

2.2 高糖、高脂飲食對(duì)小鼠血脂指標(biāo)的影響

經(jīng)過(guò)4 周的飲食干預(yù)之后，對(duì)小鼠血脂指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，與LFD 組相比，HSFD 干預(yù)組小鼠血清中TC、TG（P<0.05）、LDL-C 含量顯著提高（P<0.01），HDL（P<0.01）含量顯著下降（圖2），其中HSFD 小鼠TC、TG、LDL-C 含量分別顯著升高74%，34%，105%，HDL-C 含量顯著降低36%，說(shuō)明HSFD 飲食4 周后顯著影響小鼠血脂狀態(tài)。HSFD 干預(yù)后能夠?qū)е轮痉e累、脂質(zhì)代謝異常，進(jìn)一步可能誘發(fā)高血脂癥，并可能演變?yōu)閯?dòng)脈粥樣硬化[17]。

圖2 高糖、高脂飲食對(duì)血清中TC、TG、HDL、LDL 的影響Fig.2 The influence of high-sugar and high-fat diet on the concentration of TC，TG，HDL-C and LDL-C in serum

2.3 高糖、高脂飲食對(duì)小鼠結(jié)腸炎狀況及腸道通透性的影響

接下來(lái)，研究HSFD 是否會(huì)對(duì)小鼠結(jié)腸造成影響。DAI 評(píng)分能夠在一定程度上表征結(jié)腸炎癥狀。MPO 是一種主要存在于嗜中性粒細(xì)胞的溶酶體蛋白，當(dāng)病原體侵入時(shí)，中性粒細(xì)胞將病原體吞噬，從而保證機(jī)體的正常運(yùn)行，其活性作為中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)組織和急性炎癥的重要生物標(biāo)志物之一，酶活的降低代表中性粒細(xì)胞積聚得到抑制[18]。腸道通透性增加是結(jié)腸炎發(fā)生的促進(jìn)因素之一，利用FITC-Dextran 可以直接測(cè)定腸道屏障的完整狀況。

對(duì)小鼠結(jié)腸進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，HSFD 干預(yù)后，DAI 評(píng)分、結(jié)腸組織MPO 活性顯著提高（圖3a、3b，P<0.01）、結(jié)腸長(zhǎng)度縮短（圖3c，P<0.05）證明HSFD 能夠?qū)е滦∈蠼Y(jié)腸炎的發(fā)生。接著為了探究高糖、高脂引發(fā)結(jié)腸炎癥狀是否和小鼠腸道通透性有關(guān)，利用FITC-Dextran 對(duì)小鼠腸道屏障的通透性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，HSFD 干預(yù)組小鼠血清中FITC-Dextran 的質(zhì)量濃度為（0.066±0.006）μg/mL，約為L(zhǎng)FD 飲食組的1.73 倍（P<0.05），這證明HSFD 干預(yù)后顯著提高了小鼠腸道屏障通透性（圖3d）。HSFD 的攝入通過(guò)提高結(jié)腸部分MPO 活性以及腸道屏障通透性，這可能是腸道菌群失衡導(dǎo)致有害菌進(jìn)入腸腔，導(dǎo)致黏液降解和緊密連接結(jié)構(gòu)遭到破壞，腸道免疫系統(tǒng)失衡，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)腸部位炎癥的發(fā)生[19]。

圖3 高糖、高脂飲食對(duì)小鼠結(jié)腸炎癥狀及腸道通透性影響Fig.3 Effects of high-sugar and high-fat diet on the symptoms of colitis and intestinal permeability in mice

2.4 高糖、高脂飲食對(duì)小鼠糞便形態(tài)及結(jié)腸上皮組織影響

由于小鼠腸道通透性發(fā)生了顯著變化，因此進(jìn)一步探究HSFD 干預(yù)是否對(duì)小鼠的結(jié)腸上皮組織和黏液層造成了損傷。首先對(duì)小鼠糞便進(jìn)行觀察，如圖4A 所示，HSFD 干預(yù)組小鼠糞便較為干燥并可觀察到血便情況（圖4A 紅色箭頭所示），便隱血測(cè)試顏色較深，（藍(lán)紫色越深，便血情況越嚴(yán)重）LFD 組小鼠糞便色澤與形態(tài)較好，經(jīng)便隱血測(cè)試沒(méi)有便血情況，與上述試驗(yàn)結(jié)果一致，HSFD 干預(yù)導(dǎo)致了小鼠結(jié)腸炎的發(fā)生。對(duì)結(jié)腸進(jìn)行病理學(xué)染色，由HE 染色可知，HSFD 干預(yù)組小鼠結(jié)腸黏膜出現(xiàn)炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4B 藍(lán)色箭頭所示）、部分隱窩結(jié)構(gòu)改變（圖4B 黑色箭頭所示）、中性粒細(xì)胞增多、上皮結(jié)構(gòu)被破壞、杯狀細(xì)胞減少，LFD 組小鼠腸上皮結(jié)構(gòu)和隱窩完整富含杯狀細(xì)胞，沒(méi)有炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)或黏膜損傷，具有完整的腸上皮結(jié)構(gòu)。黏液降解的增加可以作為IBD 的生物標(biāo)記。由阿利新蘭染色可知（圖4C），與LFD 組相比，HSFD 干預(yù)組小鼠黏蛋白的分泌量明顯減少，黏液層結(jié)構(gòu)被破壞，這與杯狀細(xì)胞大量損傷有關(guān)，黏液層的破壞會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌穿透滲入，侵襲上皮細(xì)胞引起腸黏膜損傷[10]。結(jié)合以上結(jié)果可知，HSFD 的攝入會(huì)破壞結(jié)腸正常組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞損傷，影響結(jié)腸黏液層的生長(zhǎng)速度和滲透性導(dǎo)致結(jié)腸黏液層迅速惡化。可能是腸道致病菌利用上皮細(xì)胞譜系、分泌酶降解黏液并破壞緊密連接結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致腸道完整性遭到破壞[19]。

圖4 高糖、高脂飲食對(duì)小鼠糞便形態(tài)及結(jié)腸上皮組織影響Fig.4 Influence of high-sugar and high-fat diet on fecal morphology and colonic epithelial tissue of mice

2.5 高糖、高脂飲食對(duì)結(jié)腸屏障相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

作者研究發(fā)現(xiàn)HSFD 破壞腸上皮完整性，接下來(lái)探究相關(guān)緊密連接蛋白的表達(dá)是否會(huì)受到影響。腸道通透性的主要決定因素之一是細(xì)胞間緊密連接（TJs），能維持上皮細(xì)胞的完整性，同時(shí)發(fā)揮其屏障功能，防止腸腔內(nèi)的致病菌進(jìn)入腸道[19]。ZO 蛋白家族是最早被研究的蛋白，ZO-1 是緊密連接的骨架蛋白，呈蜂窩或點(diǎn)狀均勻分布在腸上皮細(xì)胞周?chē)?，在TJs 中起核心連接作用。研究表明，ZO-1 表達(dá)的下降先于腸道炎癥的發(fā)生，其表達(dá)的下調(diào)意味著TJs 功能極可能受到影響，而TJs功能障礙可能是IBD 發(fā)病的起始因素[20]。Occludin在TJs 的屏障功能和調(diào)控大分子物質(zhì)進(jìn)入腸道中起著重要作用，能維持和調(diào)節(jié)腸黏膜的通透性并抑制炎癥因子的釋放。MUC-2 由腸道上皮組織的杯狀細(xì)胞分泌，遍布小腸和大腸，其水平降低可能與多種腸道疾病有關(guān)，敲除MUC-2 的小鼠會(huì)導(dǎo)致結(jié)腸炎的發(fā)生[21]。

為研究在蛋白表達(dá)水平上，HSFD 對(duì)腸道通透性的影響，對(duì)結(jié)腸相關(guān)蛋白進(jìn)行了測(cè)定。如圖5A所示，與LFD 對(duì)照組相比，HSFD 干預(yù)組ZO-1、Occludin、Muc-2 這3 種屏障蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)且差異顯著（P<0.05）。HSFD 對(duì)小鼠結(jié)腸MUC-2 基因相對(duì)表達(dá)量的影響與阿利新藍(lán)染色結(jié)果一致。免疫熒光結(jié)果如圖5B 和圖5C 所示，HSFD 干預(yù)組，這兩種緊密連接蛋白表達(dá)出現(xiàn)明顯減少，且結(jié)腸完整形態(tài)被破壞，LFD 組ZO-1、Occludin 蛋白排列整齊且表達(dá)量高，進(jìn)一步證明HSFD 影響腸道相關(guān)緊密連接蛋白的表達(dá)，對(duì)小鼠腸道屏障具有一定的破壞性，腸道滲透性的增加，可能是由于過(guò)量的脂質(zhì)積累導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而激活免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)引起的[19]。

圖5 結(jié)腸組織中ZO-1、Occludin、MUC-2 基因相對(duì)表達(dá)量以及ZO-1、Occludin 免疫熒光蛋白染色及定量Fig.5 The relative expression of ZO-1，Occludin，and MUC-2 genes in colon tissue，as well as the staining and quantification of ZO-1 and Occludin immunofluorescent protein

2.6 高糖、高脂飲食對(duì)小鼠結(jié)腸組織炎癥因子表達(dá)的影響

已經(jīng)了解HSFD 的攝入會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，接下來(lái)探究腸道部位的炎癥因子表達(dá)情況。機(jī)體正常情況下免疫系統(tǒng)處于穩(wěn)態(tài)，當(dāng)受到外界干擾時(shí)，先天免疫信號(hào)會(huì)被激活。促炎因子與抑炎因子之間失衡會(huì)導(dǎo)致炎癥的發(fā)生。白細(xì)胞介素對(duì)免疫細(xì)胞的增殖、分化起關(guān)鍵性作用。IL-10 又稱細(xì)胞因子合成抑制因子，可激活JAK1/STAT3 通路，主要通過(guò)調(diào)節(jié)一些免疫細(xì)胞消除微生物的入侵來(lái)發(fā)揮抑炎作用，與UC 的發(fā)生有關(guān)[22]。腫瘤壞死因子TNF-α 是主要的炎癥驅(qū)動(dòng)因素之一，也是結(jié)腸炎發(fā)病機(jī)制中的一種重要促炎因子，它可以聚集中性粒細(xì)胞從而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生，在炎癥性腸病的發(fā)生中起重要作用[23]。

作者從mRNA 以及蛋白水平方面測(cè)定小鼠結(jié)腸組織炎癥因子。由圖6a，RT-PCR 結(jié)果可知，與LFD 對(duì)照組相比，HSFD 干預(yù)組，IL-10 基因表達(dá)上調(diào)，差異極顯著（P<0.01），TNF-α 基因水平也有一定的上調(diào)（P<0.05）。雖然IL-10 被認(rèn)為是一種抗炎因子，但其功能是多方面的。研究表明它是飲食誘導(dǎo)肥胖中產(chǎn)熱的一種特殊調(diào)節(jié)劑。因此HSFD 小鼠IL-10 的上調(diào)可能是HSFD 的二次反饋效應(yīng)[24]。圖6b，ELISA 法檢測(cè)結(jié)腸組織，HSFD 干預(yù)組顯著提高了TNF-α 水平（P<0.05），顯著增加了IL-10 水平（P<0.01）。HSFD 干預(yù)會(huì)促進(jìn)TNF-α抗炎因子的表達(dá)，抑制抑炎因子IL-10 的表達(dá)。這與腸道屏障功能失衡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相對(duì)應(yīng)，HSFD 會(huì)引起小鼠腸道通透性增加，使得更多的炎癥因子通過(guò)腸道屏障，進(jìn)而引起腸道的炎癥反應(yīng)。

圖6 高糖、高脂飲食對(duì)小鼠結(jié)腸組織炎癥因子表達(dá)的影響Fig.6 The effect of high-sugar and high-fat diet on the expression of inflammatory factors in mouse colon

3 結(jié)論

隨著健康意識(shí)的逐漸增強(qiáng)，合理及科學(xué)的飲食結(jié)構(gòu)和生活方式逐漸受到人們的重視。長(zhǎng)期的單一高糖、高脂飲食模式除了導(dǎo)致代謝綜合征、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病之外，還能增加IBD 的易感性。然而低脂飲食、生酮飲食和地中海飲食等被證明可以治療肥胖和高脂血癥，增強(qiáng)抵抗力減輕體內(nèi)炎癥反應(yīng)[25-26]。本試驗(yàn)通過(guò)高糖、高脂干預(yù)以及低糖、低脂飲食作為對(duì)照，研究了高糖、高脂飲食對(duì)小鼠肥胖、腸道屏障功能、炎癥水平以及結(jié)腸炎的影響，本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖、高脂飲食在一定程度上會(huì)導(dǎo)致小鼠血脂異常、促炎因子分泌增多、腸道屏障被破壞，最終導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生，為日常合理膳食，選擇結(jié)腸炎的治療方向以及對(duì)IBD 患者的飲食干預(yù)提供了一定的理論指導(dǎo)。