肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長及生物膜形成的影響

胡文靜，劉小雪，梁 棟，焦凌霞

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453003）

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterristris）主要存在于酸性土壤及蘋果汁、番茄汁等酸性果汁中，是一種革蘭氏陽性細(xì)菌，具有嗜酸耐熱特性，好氧、無致病性，由該菌污染引起的果汁營養(yǎng)損失、風(fēng)味劣變、出現(xiàn)沉淀等質(zhì)量問題已成為制約果蔬加工及出口貿(mào)易的瓶頸[1-3]。據(jù)報(bào)道，35%的果汁產(chǎn)品變質(zhì)問題都是因酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染引起的。該菌在不利條件下可形成抗逆性極強(qiáng)的芽孢，條件適宜時(shí)芽孢便會(huì)萌發(fā)生長，產(chǎn)生愈創(chuàng)木酚、2，6-二溴苯酚和2，6-二氯苯酚等代謝產(chǎn)物，散發(fā)出難聞氣味并引起產(chǎn)品沉淀，是果汁加工行業(yè)比較棘手的問題[4-6]。作為果汁產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵質(zhì)量因子，關(guān)于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的控制研究已有30 多年。在已報(bào)道的滅菌方法中，物理法控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的能源及經(jīng)濟(jì)消耗較大[7]。高溫處理是生產(chǎn)中常用的控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的方法，熱處理雖具有殺菌時(shí)間短、滅菌效果好的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)果汁的營養(yǎng)成分和感官品質(zhì)破壞嚴(yán)重[8]。新型滅菌技術(shù)中超高壓滅菌法對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的殺滅效果較好，能較好地保存果汁產(chǎn)品的營養(yǎng)成分，然而對(duì)儀器的要求較高，經(jīng)濟(jì)耗費(fèi)較大[9]。化學(xué)法對(duì)抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌也有一定的效果，生產(chǎn)上常用苯甲酸、亞氯酸、次氯酸鈉等來抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌，然而苯甲酸含有刺激性氣味，會(huì)影響果汁口感，亞氯酸在室溫下不穩(wěn)定，極易分解，在使用過程中對(duì)操作技術(shù)的要求較高[10-11]。隨著人們健康意識(shí)的增強(qiáng)，具有抑菌性能的天然物質(zhì)及其衍生物逐漸被開發(fā)并應(yīng)用到食品工業(yè)中[12]。有研究報(bào)道天然化合物如石榴提取物、葡萄籽提取物、胡椒提取物等對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌有一定的抑菌效果，但多數(shù)植物提取物含有葉綠素、花色素、黃酮類色素等或者具有不良?xì)馕兜膿]發(fā)性氣體，而且達(dá)到生產(chǎn)要求的抑菌效果的使用劑量較大，往往會(huì)影響產(chǎn)品的色澤、口感及風(fēng)味等感官品質(zhì)[13]。因此，果汁工業(yè)急需開創(chuàng)新型高效的有利于保存果汁營養(yǎng)成分的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌控制技術(shù)。

肌苷，又稱次黃苷，屬于人體的正常成分，無色、無味，目前常用于食品加工和制藥行業(yè)[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，肌苷可以促進(jìn)細(xì)菌芽孢的復(fù)蘇，對(duì)蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌的芽孢復(fù)蘇均有促進(jìn)的效果[16-17]。然而，課題組在研究肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢萌發(fā)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，它不僅不能促進(jìn)該菌芽孢的萌發(fā)，反而能延緩其芽孢萌發(fā)并導(dǎo)致萌發(fā)后的營養(yǎng)菌體死亡。鑒于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌具有獨(dú)特的嗜酸耐熱生理特性，推測(cè)肌苷在酸性條件下對(duì)該菌可能有特異性抑菌作用。本文通過測(cè)定肌苷處理前、后的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長和生存情況，形態(tài)變化及生物膜形成能力來檢測(cè)肌苷對(duì)該菌的抑制效果，研究較好抑菌效果的肌苷添加量對(duì)橙汁酸度、糖度、色度及口感的影響，為開發(fā)控制酸性果蔬制品中酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的新型綠色高效抑菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterristris DSM 3922T），購于德國菌種保藏中心；肌苷、戊二醛、無水乙醇均為分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；橙子為市售鮮果。

ZQTY-70F 全溫振蕩培養(yǎng)箱，常州普天儀器制造有限公司；TGL-16B 臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；ES-315 全自動(dòng)高壓滅菌器，上海民儀電子有限公司；H1987 手持糖度折光儀，邢臺(tái)德延科技有限公司；CR400 便攜式色差儀，深圳市百誠欣電子科技有限公司；環(huán)境掃描電子顯微鏡，北京普瑞賽司有限公司；Varioskan LUX 多功能酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技公司；MJBL80Y21 美的榨汁機(jī)，河南省萱格商貿(mào)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基的制備

AAM 液體培養(yǎng)基：葡萄糖2.0 g，酵母浸粉2.0 g，氯化鈣0.38 g，磷酸二氫鉀1.2 g，七水硫酸鎂1.0 g，一水硫酸錳0.38 g，硫酸銨0.4 g，加滅菌水定容至1 L，調(diào)pH 值至4.0，121 ℃高壓滅菌15 min；

AAM 固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%～1.8%的瓊脂。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)條件 將冷凍保藏的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌接種于AAM 液體培養(yǎng)基中，在45 ℃、250 r/min 條件下活化培養(yǎng)12 h，然后按1%接種量再轉(zhuǎn)接至AAM 培養(yǎng)基中，45 ℃、250 r/min 振蕩培養(yǎng)。

1.3.2 光密度法測(cè)定酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長曲線 將活化12 h 的菌液按1%的接種量分別接種于含肌苷濃度為0，1，5，10，20，30 mmol/L 的AAM液體培養(yǎng)基中，45 ℃、250 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，每2 h 測(cè)定一次菌液吸光值（OD600nm）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作不同濃度肌苷處理下酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長曲線。

1.3.3 結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物膜形成量 根據(jù)朱軍莉等[18]采用的96 孔板定量法，取20 μL 106CFU/mL 菌懸液置于96 孔板中，每孔分別加入200 μL 含0，1，5，10，20，30 mmol/L 肌苷濃度的AAM 培養(yǎng)液。然后將96 孔板置于45 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，使細(xì)菌完全附著在孔板表面。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔中加入0.01 mol/L 的無菌PBS 緩沖液清洗3 次。待96 孔板風(fēng)干后，加入無水甲醇固定15 min，棄去孔中廢液后風(fēng)干。然后加入1%的結(jié)晶紫溶液，置于室溫下染色15 min 后，用流動(dòng)去離子水洗去孔板中殘余的結(jié)晶紫染料后風(fēng)干，再加入200 μL 33%的冰乙酸溶液進(jìn)行脫色。脫色完成后，用酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的OD600nm值，分析生物被膜形成量。

1.3.4 環(huán)境掃描電子顯微鏡檢測(cè)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌形態(tài) 根據(jù)潘旭遲等[19]描述的方法，將活化至對(duì)數(shù)期的菌液以1%接種量分別加入肌苷濃度為0 mmol/L 和5 mmol/L 的培養(yǎng)液中，45 ℃、250 r/min 振蕩培養(yǎng)，分別取培養(yǎng)6，12，18，24 h 的菌液，離心收集菌體，用預(yù)冷的無菌水反復(fù)清洗3～5 次，加入體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛溶液，置于4 ℃環(huán)境下固定2 h 以上。將固定好的樣品用預(yù)冷的無菌水反復(fù)清洗后，利用35%，50%，70%，80%，90%和100%體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行梯度脫水后再用無水乙醇重懸。取適量菌懸液滴加于玻片上，自然風(fēng)干后噴金，利用環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)。

1.3.5 平板計(jì)數(shù)法測(cè)定酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生存情況 將菌體濃度為107CFU/mL 的菌液分別接種至含0，1，5，10，20，30 mmol/L 濃度肌苷的AAM培養(yǎng)液中，調(diào)整該菌液的初始菌濃度分別為105CFU/mL 和106CFU/mL，45 ℃，250 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)72 h。每6 h 取100 μL 菌液梯度稀釋后涂布于AAM 固體平板上，45 ℃，倒置培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，檢測(cè)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的存活情況。

1.3.6 鮮榨橙汁制備 選取成熟、飽滿的新鮮橙子，清洗干凈后加入適量純水，使用榨汁機(jī)制汁，用干凈的紗布過濾3～4 次，90 ℃，5 min 殺菌備用。

3.播種田間濕度 田間土壤持水量為70%—80%播種最佳，即田間土壤能手捏成團(tuán)，但不能擠壓出水。如果田間土壤含水量大，則播種后不急于蓋膜，待田間土壤水分適當(dāng)蒸發(fā)后再蓋膜。如果田間土壤干燥，則播種后每窩適當(dāng)灌水0.3—0.5公斤左右后再蓋膜。

1.3.7 果汁理化指標(biāo)測(cè)定 在鮮榨橙汁中分別加入終濃度為0，1，5，10，20，30 mmol/L 的肌苷，按照鄧紅等[20]所述檢測(cè)方法，利用pH 儀、手持式糖度折光儀、便攜式色差儀測(cè)定橙汁的酸度、糖度（可溶性固形物含量，TSS）、顏色參數(shù)等理化指標(biāo)。樣品總色差計(jì)算公式為：

式中L*代表明暗度，a*代表紅綠色值，b*代表黃藍(lán)色值。

1.3.8 果汁感官評(píng)定 參考崔燕等[21]對(duì)果汁感官鑒定的方法，制訂表1 中鮮榨橙汁的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，選擇10 名食品專業(yè)的學(xué)生分別從氣味、色澤、口感、狀態(tài)4 個(gè)方面對(duì)橙汁進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，總分為100分。

表1 鮮榨橙汁的感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory scoring standard for fresh orange juice

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3 次，采用Origin9.0 進(jìn)行繪圖，運(yùn)用SPSS 23 軟件Duncan 進(jìn)行方差分析（ANOVA）（P<0.05），試驗(yàn)結(jié)果以表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌苷對(duì)低濃度的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑制效果

將過夜活化的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌以1%接種量接種于含不同濃度肌苷的AAM 液體培養(yǎng)基中，經(jīng)平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定，菌液的初始菌體濃度為104CFU/mL。如圖1 所示，在不含肌苷的對(duì)照組AAM 培養(yǎng)液中，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長良好，培養(yǎng)2 h 后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)至12 h 時(shí)菌體密度最高，OD600nm值達(dá)到1.36，12 h 后菌體密度略有下降，菌株生長進(jìn)入穩(wěn)定期，培養(yǎng)24 h 時(shí)其OD600nm值為1.057，這和課題組前期研究中測(cè)定的同一培養(yǎng)條件下的生長曲線保持一致[22]。在含1 mmol/L 肌苷的AAM 培養(yǎng)液中，菌體生長稍慢，培養(yǎng)至12 h 時(shí)，菌體密度最高，OD600nm值僅為0.57，是對(duì)照組的0.42 倍。培養(yǎng)24 h 后，菌體的OD600nm值為0.342，是對(duì)照組的0.32 倍。培養(yǎng)液中肌苷濃度升至5 mmol/L 時(shí)，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長明顯被抑制，培養(yǎng)12 h 時(shí)的菌液OD600nm值僅為0.40，是對(duì)照組的0.29 倍。培養(yǎng)至24 h，菌液OD600nm值降至0.17，是對(duì)照組的0.16 倍。隨著肌苷濃度的繼續(xù)增加，對(duì)該菌的抑制效果也有所增強(qiáng)。肌苷濃度分別為10，20，30 mmol/L 的AAM 培養(yǎng)液中，菌液最高OD600nm值分別為0.337，0.328 和0.315。表明肌苷濃度高于5 mmol/L 時(shí)，抑菌效果并沒有明顯提升。因此，對(duì)初始污染菌含量不高于104CFU/mL 時(shí)，5 mmol/L 的肌苷濃度即能達(dá)到較好的抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長繁殖的效果。

圖1 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在添加不同濃度肌苷的AAM 培養(yǎng)液中的生長曲線Fig.1 Growth curve of A.acidoterristris in AAM medium with different concentrations of inosine

2.2 肌苷對(duì)高初始菌體濃度的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的抑制效果

實(shí)際生產(chǎn)上常用的抑菌劑在產(chǎn)品初始污染菌含量高時(shí)便會(huì)失去防腐效果。為檢測(cè)肌苷對(duì)高初始菌體濃度的抑制效果，本文檢測(cè)了初始菌體濃度分別為105CFU/mL 和106CFU/mL 的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在不同濃度肌苷作用下的存活情況。如圖2a 所示，初始菌體濃度為105CFU/mL 的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌營養(yǎng)菌體在不含肌苷的培養(yǎng)液中，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，菌落數(shù)也穩(wěn)定增長，12 h 后達(dá)到最高，為7.41 lg（CFU/mL）。在1 mmol/L 肌苷培養(yǎng)液中，培養(yǎng)初期，菌落數(shù)呈上升趨勢(shì)，作用12 h 后，菌體數(shù)量逐漸下降，最高菌落數(shù)達(dá)6.9 lg（CFU/mL）。隨著肌苷濃度增大，菌體生長受到了明顯的抑制，在5，10，20，30 mmol/L 的肌苷培養(yǎng)液中，最高菌落數(shù)分別為4.53，4.30，4.20，4.17 lg（CFU/mL），與初始菌體量相比，菌體數(shù)量下降了1個(gè)數(shù)量級(jí)。

圖2 肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of inosine on A.acidoterristris

當(dāng)初始菌體密度為106CFU/mL 時(shí)，在不含肌苷的培養(yǎng)液中，菌落數(shù)最高可達(dá)7.49 lg（CFU/mL）。在含在1，5，10，20，30 mmol/L 的肌苷培養(yǎng)液中，菌落數(shù)最高分別為6.94，6.10，6.03，5.82，5.66 lg（CFU/mL），與初始菌體量相比，菌體數(shù)量沒有增加。結(jié)果表明，5 mmol/L 的肌苷濃度在初始污染菌含量高達(dá)105CFU/mL 和106CFU/mL 時(shí)，仍具有較好的抑菌效果。

2.3 肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌菌體形態(tài)的影響

掃描電子顯微鏡檢測(cè)結(jié)果如圖3 所示，不添加肌苷的對(duì)照組的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌在培養(yǎng)至6 h 時(shí)，菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，表面光滑飽滿，菌體呈長桿狀，處于分裂增殖階段；12 h 時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體呈正常的桿狀；18 h 時(shí)，菌體頂端膨大，大部分菌體變短變圓，開始形成芽孢；24 h 時(shí)，絕大部分營養(yǎng)菌體已形成芽孢。5 mmol/L 肌苷處理的試驗(yàn)組中，肌苷作用6 h 時(shí)，與同時(shí)段對(duì)照組的菌體形態(tài)相比，菌體形態(tài)較完整，飽滿度稍差，但也存在分裂增殖現(xiàn)象；作用12 h 時(shí)，大部分菌體細(xì)胞壁受損，表面凹陷；作用時(shí)間增至18 h 和24 h 時(shí)，細(xì)胞壁受損加重，菌體干癟皺縮，表面粗糙，出現(xiàn)嚴(yán)重的破裂和孔洞，而且菌體顏色逐漸加深，可能是由于細(xì)胞裂解、細(xì)胞內(nèi)容物泄露導(dǎo)致菌體的導(dǎo)電性降低造成的。結(jié)果表明，肌苷能夠破壞和損傷酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜。

2.4 肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生物膜形成的影響

如圖4 所示，肌苷處理后，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生物被膜形成量與對(duì)照組相比明顯降低（P<0.05）。隨著肌苷濃度的增加，生物被膜的含量逐漸減小。經(jīng)1，5，10，20，30 mmol/L 肌苷作用的酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生物被膜形成量在OD600nm的吸光值 由0.57 分別下降至0.51，0.30，0.29，0.26和0.25，表明肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生物被膜的形成有顯著的抑制作用（P<0.05）。

圖4 不同濃度肌苷處理酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌后生物膜的形成量Fig.4 Biofilm formation treated with different concentrations of inosine

2.5 肌苷對(duì)橙汁理化特性及感官品質(zhì)的影響

果汁的酸度、糖度及色澤是影響果汁品質(zhì)的主要指標(biāo)。肌苷無色無味，推測(cè)其對(duì)果汁的品質(zhì)應(yīng)該不產(chǎn)生影響。經(jīng)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)（表2），相同處理時(shí)間下肌苷添加量高低對(duì)橙汁的酸度、糖度（TSS 含量）及色澤均無顯著影響（P<0.05）；但是隨著處理時(shí)間延長，不添加肌苷的對(duì)照組和添加不同濃度肌苷的試驗(yàn)組中，橙汁的糖度（TSS 含量）和L*值（明暗度）都有所增加。這可能是由于取樣測(cè)定過程中有空氣混入導(dǎo)致果汁營養(yǎng)成分發(fā)生氧化所致。在24 h 的肌苷處理過程中，添加不同肌苷濃度的橙汁的總色差（ΔE）最大值為1.86，一般ΔE>3 時(shí)，才能肉眼觀察出顏色的變化[23]。因此，肌苷對(duì)橙汁色澤的影響是肉眼覺察不到的。在相同處理時(shí)間下，肌苷添加量低于5 mmol/L 的試驗(yàn)組果汁的酸度、糖度（TSS 含量）及色澤均與對(duì)照組無顯著差異（P<0.05）。

表2 肌苷對(duì)橙汁理化特性的影響Table 2 Effects of inosine on physicochemical properties of orange juice

感官鑒定可更直觀的分析果汁的品質(zhì)。由表3 可知，添加不同濃度肌苷的橙汁，在相同放置時(shí)間下，與不添加肌苷的對(duì)照組相比，果汁原有的香味、口感、色澤、狀態(tài)等均無明顯變化（P<0.05）。隨放置時(shí)間延長，果汁的口感和香味略有降低，可能由于取樣時(shí)的空氣混入導(dǎo)致橙汁中的醛類及酚類物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)，從而影響果汁的香氣和口感[24]。

表3 添加不同肌苷濃度的橙汁的感官評(píng)價(jià)結(jié)果Table 3 Sensory evaluation of orange juice with different inosin concentration

3 討論與結(jié)論

酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌廣泛存在于自然界和土壤中，其菌體和芽孢可附著在水果表面，在加工過程中不可避免地會(huì)導(dǎo)致果汁生產(chǎn)設(shè)備和產(chǎn)品被污染。尤其是濃縮果汁生產(chǎn)中，一般會(huì)利用回收果汁濃縮時(shí)蒸發(fā)的水分清洗設(shè)備，由于回收的冷凝水溫度較高且呈微酸性，給酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生長繁殖提供了良好的環(huán)境。該菌在設(shè)備表面能形成致密的生物被膜[25]，形成生物被膜的細(xì)菌內(nèi)部有致密的三維空間結(jié)構(gòu)，使細(xì)菌可以大量繁殖、擴(kuò)散，對(duì)環(huán)境的耐受性也增強(qiáng)，導(dǎo)致其難以從加工設(shè)備的表面被清除[26]。因此，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌往往通過污染生產(chǎn)設(shè)備、生產(chǎn)材料（加工水果）及半成品（濃縮果汁）等導(dǎo)致水果加工產(chǎn)品污染，對(duì)酸性果蔬產(chǎn)品的加工和保藏造成了嚴(yán)重危害，再加上該菌嗜酸耐熱的特性及其芽孢的高抗逆性，也對(duì)酸性果蔬制品的滅菌工藝提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。鑒于果蔬汁中熱敏性營養(yǎng)成分豐富，果汁加工中尤為重視殺菌工藝對(duì)果汁品質(zhì)的影響，如何采用溫和的方式控制該菌污染一直是食品殺菌領(lǐng)域亟待解決的問題。

肌苷是芽孢桿菌屬細(xì)菌的細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可用做食品、藥品和藥物中間體等，具有改善腎功能，加速肝細(xì)胞的修復(fù)等多種醫(yī)療和保健功能[27]。目前，與肌苷有關(guān)的細(xì)菌方面的研究一方面是肌苷生產(chǎn)細(xì)菌的選育，另一方面是對(duì)細(xì)菌芽孢萌發(fā)的促進(jìn)作用[28]，尚無其抑制細(xì)菌生長繁殖的研究和報(bào)道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌芽孢萌發(fā)的作用與現(xiàn)有報(bào)道截然相反，不僅延緩該菌芽孢萌發(fā)且導(dǎo)致營養(yǎng)菌體死亡。由于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌具有嗜酸耐熱的獨(dú)特生理特性，推測(cè)原因可能與該菌在酸性條件下具有特殊的代謝機(jī)制有關(guān)。大部分抑菌物質(zhì)主要從破壞胞內(nèi)蛋白和遺傳物質(zhì)、損傷菌體細(xì)胞壁及抑制呼吸這三方面來發(fā)揮作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，5 mmol/L濃度的肌苷就對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜具有明顯的損傷作用，并導(dǎo)致菌體死亡。肌苷作為細(xì)胞內(nèi)ATP、輔酶A、核糖核酸及脫氧核糖核酸的組成部分，能直接透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，參與細(xì)胞的核酸代謝、物質(zhì)代謝和能量代謝，并參與蛋白質(zhì)的合成[30-31]，因此，推測(cè)肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的破壞作用可能與肌苷進(jìn)入菌體后對(duì)該菌的正常代謝功能造成了影響，進(jìn)而導(dǎo)致菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜合成受到影響而死亡，其分子機(jī)制有待深入研究。有研究報(bào)道，在橙汁和非碳酸飲料中，當(dāng)該菌的菌體濃度達(dá)到105～106CFU/mL 時(shí)，產(chǎn)生的愈創(chuàng)木酚量就能達(dá)到嗅覺的感官閾值[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)初始污染菌含量高達(dá)105CFU/mL 和106CFU/mL 時(shí)，5 mmol/L 的肌苷添加量仍能將105CFU/mL 的初始菌體的數(shù)量降低1 個(gè)數(shù)量級(jí)，控制營養(yǎng)菌體的數(shù)量使之不能產(chǎn)生達(dá)到嗅覺閾值的愈創(chuàng)木酚量，抑制106CFU/mL的初始菌體數(shù)量不再增加，且對(duì)果汁的理化特性和感官品質(zhì)均無顯著影響。因此，鑒于肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌具有抑制芽孢萌發(fā)和低劑量高效抑殺營養(yǎng)菌體的雙重效果，不失為理想的控制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的高效綠色特異性抑菌劑。

在檢測(cè)肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生物被膜形成能力的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)較低濃度的肌苷便可對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生物被膜量發(fā)揮抑制作用。推測(cè)肌苷可能一方面抑制了酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的生長而影響其生物被膜的形成量[33]，另一方面可能是由于肌苷影響了酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌細(xì)胞代謝，導(dǎo)致其胞外蛋白或多糖分泌減少，降低了菌體的黏附性，干擾了生物被膜的形成[34]。細(xì)菌的生物被膜形成力與多種因素有關(guān)，如營養(yǎng)條件、環(huán)境等，因此肌苷對(duì)酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌生物膜形成的影響機(jī)制需要進(jìn)一步探討。菌體生物被膜含量的減少可以使菌體的活力以及抗性減弱[35]，這為肌苷協(xié)同其它抑菌劑或殺菌技術(shù)發(fā)揮更好的控制該菌污染的作用提供了試驗(yàn)和理論依據(jù)，肌苷有望成為酸性果汁生產(chǎn)中抑制酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌污染的新型高效防腐殺菌劑。研究結(jié)果為開發(fā)能最大程度保存果汁營養(yǎng)成分和感官品質(zhì)的新型酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌的控制技術(shù)提供了試驗(yàn)和理論依據(jù)。