◎ 徐子雯，陳舒悅，羅怡婕，周鈺雯，張慧恩

（浙江萬(wàn)里學(xué)院，浙江 寧波 315100）

酒是人類生活中重要的飲品之一。中國(guó)酒文化歷史悠久，博大精深，早在幾千年前，中國(guó)人就創(chuàng)造出獨(dú)特的酒曲復(fù)式發(fā)酵法并用于大量釀造黃酒。如今，酒對(duì)于中國(guó)人來(lái)說(shuō)，已不僅僅是食物，更是一種融合物質(zhì)生產(chǎn)和精神創(chuàng)作的飲食文化[1-3]。

現(xiàn)代酒類產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，酒類的產(chǎn)量銷量與市場(chǎng)規(guī)模不斷擴(kuò)大。目前，市場(chǎng)上受歡迎的酒類主要有白酒、啤酒、果酒。在果酒領(lǐng)域內(nèi)，藍(lán)莓酒雖屬小眾品類，但也擁有悠久的釀造歷史，早在明代就有了藍(lán)莓酒可美容養(yǎng)顏、抵御濕寒、活血化瘀、強(qiáng)身健體等功效的文獻(xiàn)記錄。因此，自古以來(lái)，藍(lán)莓酒就被認(rèn)為具有美容的神奇功效，并一直流傳至今。現(xiàn)代科學(xué)已經(jīng)確定，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后的藍(lán)莓酒可以刺激更多活性成分的產(chǎn)生，藍(lán)莓酒不僅味道比藍(lán)莓和藍(lán)莓汁更吸引人，而且其含有的花青素和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更易被身體吸收。相較于其他的酒類，飲用藍(lán)莓酒更有利于身體健康。在歐洲，藍(lán)莓酒被譽(yù)為“給人類壽命帶來(lái)第三次飛躍”的神奇之物。不同于在歐洲的知名度，藍(lán)莓酒在中國(guó)是個(gè)鮮為人知的小眾酒類，遠(yuǎn)不如葡萄酒的市場(chǎng)知名度。由于最近幾年酒類市場(chǎng)迎來(lái)消費(fèi)升級(jí)轉(zhuǎn)型，使得市場(chǎng)更偏年輕化，更易接受新奇酒類，消費(fèi)者更加注重酒類風(fēng)味多樣化、低酒精度數(shù)及健康飲酒，藍(lán)莓酒因此打開了中國(guó)市場(chǎng)[4]。

當(dāng)前，頂空固相微萃取-氣質(zhì)譜聯(lián)用（HSSPME-GC/MS）技術(shù)已應(yīng)用于各種類型酒樣（如葡萄酒、紅酒和白酒等）中揮發(fā)性香氣成分的分析[5]。此外，主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLSDA），都是利用原始數(shù)據(jù)呈現(xiàn)組間及組內(nèi)差異的可視化技術(shù)，可從不同維度反映不同樣本間的代謝組成的差異[6]。

雖然近幾年酒類風(fēng)味物質(zhì)的研究受到學(xué)者的高度關(guān)注，但是相較于其他酒類，藍(lán)莓酒的相關(guān)研究還比較少。盡管近幾年藍(lán)莓酒越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞，但是少有聚焦于藍(lán)莓酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和藍(lán)莓酒的主要香氣特征的研究?；诖耍疚睦脷庀嗌V質(zhì)譜聯(lián)用儀結(jié)合代謝組學(xué)對(duì)不同酵母發(fā)酵藍(lán)莓酒風(fēng)味物質(zhì)的影響進(jìn)行研究，旨在全面了解和認(rèn)識(shí)不同酵母對(duì)于藍(lán)莓酒風(fēng)味物質(zhì)的基礎(chǔ)差異，從而選擇最適合釀造藍(lán)莓酒的釀酒酵母，為以后有關(guān)藍(lán)莓酒香氣物質(zhì)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀8890-5977B（安捷倫公司）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相萃取頭及萃取手柄（美國(guó) Supelco公司）；電子天平B124S（賽多利斯有限公司）；磁力加熱攪拌器RT2（賽默飛公司）。

1.2 材料與試劑

藍(lán)莓：購(gòu)于奉化藍(lán)莓基地，充分成熟，采摘后立即于-18 ℃保存；酵母AU、DE、RA購(gòu)自煙臺(tái)帝伯仕自釀機(jī)有限公司；氯化鈉（分析純）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藍(lán)莓酒的發(fā)酵工藝流程

基本工藝流程：藍(lán)莓果→挑選→解凍→打漿→調(diào)整成分（添加偏重亞硫酸鉀、蔗糖、碳酸鈣）→接種酵母→裝罐→主發(fā)酵→倒罐→陳釀→成品酒。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定

萃取條件：取5.0 mL藍(lán)莓酒樣，加入20.0 mL頂空瓶中，加入1 g NaCl，在水浴鍋中50 ℃平衡10 min，將SPME手動(dòng)進(jìn)樣柄（萃取頭型號(hào)：50/30 μm PD-MS/DVB/CAR）插入進(jìn)樣瓶中，50 ℃萃取30 min，取出萃取頭插入氣相色譜儀進(jìn)樣口，解析5 min后取出[7-8]。

GC 條件：HP-5MS 色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），不分流進(jìn)樣，柱溫采用程序升溫，50 ℃保持1 min，以5 ℃/min升至90 ℃保持1 min，再以1 ℃/min升至100 ℃保持3 min，再以2 ℃/min升至120 ℃保持1 min，最后以6 ℃/min升至250 ℃。進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣為氦氣，流速1.0 mL/min[9-10]。

MS 條件：電離方式 EI，電離電壓 70 eV，離子源和四極桿的溫度分別為230 ℃和150 ℃燈絲電流 0.25 mA，電子倍增器電壓為1 500 V，掃描范圍40～550 m/z[11]。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

①定性分析。通過(guò)檢索與NIST17標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，選擇匹配度≥70%的物質(zhì)為有效物質(zhì)。②定量分析。采用峰面積歸一法計(jì)算。③主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA），由MetaboAnalyst網(wǎng)站進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母藍(lán)莓酒風(fēng)味物質(zhì)分析

（1）利用GC-MS對(duì)3組不同酵母發(fā)酵的藍(lán)莓酒中的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行采集和數(shù)據(jù)分析。經(jīng)NIST 17.0數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后，共鑒定出76個(gè)化合物（見表1）。按照其化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)可分為5類，包括有機(jī)酸類、酯類、醇類、萜烯類、酚類。其中，醇類26種，酯類15種，酸類15種，萜烯類13種，酚類7種。3種酒中醇類和酸類物質(zhì)占比最多，其次是酯類。醇類物質(zhì)是果酒香氣的主要成分，醇類物質(zhì)能夠促進(jìn)酯類物質(zhì)香氣成分的散發(fā)，使酒體更加飽滿[12-13]。

（2）3 種酒樣含量較高的主要香氣成分為異戊醇、苯乙醇、異丁醇、芳樟醇、α-松油醇。異戊醇具有酒精味和特殊的指甲油的味道[14]；芳樟醇和苯乙醇具有玫瑰花香[15]。RA酵母釀造藍(lán)莓酒中醇類占比最高，對(duì)感官風(fēng)味影響較大；DE釀造的藍(lán)莓酒醇類物質(zhì)含量最低，這是由于釀酒所用酵母不同導(dǎo)致的。

（3）酯類是賦予果酒豐富果香、花香的物質(zhì)，與果酒整體風(fēng)味的呈現(xiàn)具有重要關(guān)系。藍(lán)莓酒中主要酯類物質(zhì)有丁二酸二乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯等，這些酯類物質(zhì)增加了酒體的果香與花香。結(jié)果顯示，AU酵母釀造藍(lán)莓酒中酯類占比最高，其次是DE。

（4）藍(lán)莓酒中含有較多的有機(jī)酸，主要來(lái)自藍(lán)莓鮮果。有機(jī)酸能夠影響藍(lán)莓酒的酸甜比，對(duì)酒的口感具有較大影響。當(dāng)酸類含量過(guò)高時(shí)，會(huì)大大降低果酒的香味，口感舒適度降低；當(dāng)酸類含量較低時(shí)，能夠帶來(lái)清爽的口感，增加酒體的復(fù)雜性。相比較DE釀造的藍(lán)莓酒有機(jī)酸含量最低，AU釀造的藍(lán)莓酒有機(jī)酸含量有所增加。

2.2 藍(lán)莓酒風(fēng)味物質(zhì)PCA和PLS-DA分析

（1）PCA分析是無(wú)監(jiān)督的，即PCA分析并不考慮樣品的分組信息。PCA的目標(biāo)是選擇幾個(gè)相互獨(dú)立的因子代表所有代謝物，這些因子保留了關(guān)于原始代謝物變異的最大信息量。對(duì)此，本研究選擇保留最多信息的2個(gè)因子，并構(gòu)建一個(gè)散點(diǎn)圖，顯示一組代謝物的樣本之間的結(jié)構(gòu)差異[16]。

（2）進(jìn)行PCA主成分分析利用之前提取到的化合物，了解三組藍(lán)莓酒之間的總體化合物表型差異。結(jié)果表明，3種不同酵母的藍(lán)莓酒前2個(gè)主成分PC1和PC2的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)69.7%（如圖1），這說(shuō)明主成分很好地概括了樣品的原始數(shù)據(jù)信息。其中，PC1占48.5%，PC2占21.2%。PCA模型包含4個(gè)主成分，擬合參數(shù)為R2X=0.924、Q2=0.860，圖中3組樣品明顯分布在不同區(qū)域，區(qū)分顯著，說(shuō)明3種藍(lán)莓酒的風(fēng)味物質(zhì)組成結(jié)構(gòu)差異。

圖1 PCA主成分分析得分圖

（3）除了無(wú)監(jiān)督模式的主成分分析PCA以外，本試驗(yàn)還使用Metaboanalyst對(duì)所有樣本建立偏最小二乘判別分析（PLS-DA）。判別最小二乘分析是受控的，即分析時(shí)需要聚類信息，PLS-DA可用于尋找樣本組間最大可能差異的因子。判別分析將要預(yù)測(cè)的連續(xù)分類變量編碼為潛變量，在解釋變量和潛變量之間建立回歸，并使用最小二乘回歸理論求解。PLS-DA通過(guò)將預(yù)測(cè)變量和觀測(cè)變量分別投射到一個(gè)新的空間來(lái)尋找線性回歸模型，這表明PLS-DA模型的判別能力更強(qiáng)[17]。其中，變量重要性因子（VIP）可以量化每個(gè)變量對(duì)分類的貢獻(xiàn)。當(dāng) VIP 值>1 時(shí)，對(duì)應(yīng)變量可定義為判別模型的關(guān)鍵變量，VIP值越大，對(duì)模型的重要性越大[18]。

PLS-DA的得分圖（見圖2）表明3組藍(lán)莓酒有明顯的分離，PC1和PC2分別解釋了總方差的46.3%和23.0%，3組藍(lán)莓酒的點(diǎn)云分布在不同的區(qū)域，PLSDA 模型包含2個(gè)主成分，擬合參數(shù)為R2X=0.825、Q2=0.629。R2X越接近1表明模型越穩(wěn)定，Q2>0.5 表明預(yù)測(cè)率較高[19]。

圖2 PLS-DA分析得分圖

根據(jù) VIP 值（VIP>1）和P值（P<0.05）篩選出關(guān)鍵揮發(fā)性成分，結(jié)果顯示共篩選出15種差異揮發(fā)性物質(zhì)（見圖3）。其中，有機(jī)酸4種，酯類2種，醇類3種，萜烯類4種，酚類2種。分別為己酸、辛酸、壬酸、3-氨基丁酸、乙酸異戊酯、丁二酸二乙酯、異丁醇、異戊醇、苯乙醇、薄荷醇、芳樟醇、α-松油醇、4-萜品醇、2,4-二叔丁基酚、3,5-二叔丁基苯酚。

圖3VIP圖

2.3 藍(lán)莓酒的感官評(píng)價(jià)

感官品評(píng)是評(píng)價(jià)食品感官質(zhì)量最有效、最直觀的方法，特別是在酒類食品中，感官評(píng)價(jià)是任何先進(jìn)儀器無(wú)法替代的[20]。本次試驗(yàn)將綜合10名受過(guò)訓(xùn)練的食品專業(yè)學(xué)生的得分求取平均值，盡量減小試驗(yàn)誤差。由表2可知，藍(lán)莓酒外觀澄清透明，呈寶石紅色。其中，AU藍(lán)莓酒顏色為悅?cè)松钭蠈毷t色，果香濃郁，平衡性好；DE藍(lán)莓酒果香濃郁但顏色較淺；RA藍(lán)莓酒顏色悅?cè)说珔f(xié)調(diào)性略顯薄弱。綜合相關(guān)評(píng)語(yǔ)和得分可以看出，AU藍(lán)莓酒從色澤、香氣、口感和典型性方面表現(xiàn)突出、果香濃郁、協(xié)調(diào)性好、品質(zhì)最佳。感官評(píng)價(jià)得分如2.2所述，本研究根據(jù) VIP 值（VIP>1）和P值（P<0.05）篩選出關(guān)鍵揮發(fā)性成分存在一定的內(nèi)在聯(lián)系，其中，α-松油醇VIP值最大，在AU藍(lán)莓酒中含量最高，可能是影響感官評(píng)價(jià)得分的關(guān)鍵物質(zhì)。

表2 不同酵母藍(lán)莓酒感官評(píng)價(jià)表

3 結(jié)論

本研究采用3種不同酵母釀造的藍(lán)莓酒，通過(guò)頂空固相微萃取-氣質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC/MS）技術(shù)共鑒定揮發(fā)性化合物76種，經(jīng)數(shù)據(jù)處理歸納總結(jié)后可以發(fā)現(xiàn)，有3種不同酵母的藍(lán)莓酒間有41種相同的化合物，說(shuō)明3種藍(lán)莓酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在種類上具有一定的差異性。在此基礎(chǔ)上，本研究利用PCA和PLSD-DA對(duì)風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，均能驗(yàn)證3組藍(lán)莓酒存在整體差異，能夠被完全區(qū)分開來(lái)，并找出15種差異風(fēng)味物質(zhì)，其中，α-松油醇VIP值最大。從感官評(píng)價(jià)來(lái)看，AU藍(lán)莓酒得分最高，RA藍(lán)莓酒得分最低，原因在于AU藍(lán)莓酒中α-松油醇含量最高，可能對(duì)風(fēng)味起著較為顯著的作用。綜上所述，AU酵母比其余2種酵母更適合用于釀造藍(lán)莓酒。