• 
    

    
    

      99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

      高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定兩當(dāng)狼牙蜜中5種苦參類生物堿

      2023-11-29 03:09:58蘇阿龍王麗君顧培良
      現(xiàn)代食品 2023年18期
      關(guān)鍵詞:乙酸銨苦參堿苦參

      ◎ 禹 潔, 周 佳, 蘇阿龍, 王麗君, 顧培良

      (甘肅省食品檢驗(yàn)研究院, 甘肅 蘭州 730300)

      生物堿是廣泛存在于自然界中的一類含氮堿性物質(zhì),具有一定的毒理作用和藥理作用[1-3]??鄥㈩惿飰A廣泛存在于苦參、苦豆子等豆科植物當(dāng)中[4]。苦參堿和氧化苦參堿均屬于苦參類生物堿中的活性成分,兩者在特定的條件下能夠互相轉(zhuǎn)化[5],具有抗腫瘤、抗炎癥、調(diào)整心律、保護(hù)心臟、提高免疫力等多種功效[6-7]。除此之外,在病蟲(chóng)害預(yù)防及治理方面,苦參堿和氧化苦參堿是一類利用率高,效果顯著的植物源殺蟲(chóng)劑,具有低毒性、低殘留等優(yōu)點(diǎn),被廣泛被應(yīng)用在防治各種松毛蟲(chóng)、茶毛蟲(chóng)等農(nóng)林害蟲(chóng)領(lǐng)域[8-9]?;惫麎A即13,14-脫二氫苦參堿,氧化槐果堿即13,14-脫二氫氧化苦參堿,均屬苦參類生物堿,有研究發(fā)現(xiàn),其具有調(diào)節(jié)心律失常和一定的中樞神經(jīng)藥理作用[10]?;倍▔A即5β-苦參堿,是苦參堿(α-苦參堿)的差向異構(gòu)體,研究表明,槐定堿對(duì)多種癌癥尤其是消化道類癌癥療效很好,且不良反應(yīng)發(fā)生率較低。近年,槐定堿因具有穩(wěn)定、化學(xué)結(jié)構(gòu)靈活、生物利用度高、安全性好等優(yōu)點(diǎn),受到學(xué)界廣泛關(guān)注[11-13]。

      狼牙刺(Sophora viciifolia Hance)為豆科槐屬多年生灌木,又名白刺花,通常生長(zhǎng)于海拔1 000~1 500 m的陽(yáng)坡或河谷地帶,廣泛分布于我國(guó)的陜西、甘肅等地。狼牙刺不同部位中均含有苦參堿、氧化苦參堿等多種生物堿,其中,氧化苦參堿的含量在果實(shí)中可高達(dá)3.6%[14-17]。此外,狼牙刺還是一種特色蜜源植物,因狼牙刺花而得名的狼牙蜜,產(chǎn)量大,品質(zhì)獨(dú)特,內(nèi)含豐富的礦物質(zhì)、氨基酸、維生素和活性酶等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),能夠被人體吸收,體現(xiàn)了較高的食用和藥用價(jià)值。狼牙蜜盛產(chǎn)于甘肅兩當(dāng)縣、徽縣,是在得天獨(dú)厚的地理環(huán)境和優(yōu)渥的資源條件下,經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選擇和精煉加工孕育而生的一種特殊產(chǎn)品,年產(chǎn)量達(dá)5萬(wàn)多kg,遠(yuǎn)銷中外,兩當(dāng)縣也因此被譽(yù)為“狼牙蜜之鄉(xiāng)”[18-19]。2008年,原國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局將兩當(dāng)狼牙蜜作為地理標(biāo)志產(chǎn)品[20]。目前,對(duì)狼牙刺植株中生物堿的組成和含量測(cè)定已有不少報(bào)道[21-23],蜂蜜中生物堿的測(cè)定采用固相萃取、QuEChERS提取和凈化,然后用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行定性和定量分析[1-2],但對(duì)狼牙蜜中苦參類生物堿的組成及含量測(cè)定至今未有報(bào)道。

      本研究以兩當(dāng)狼牙蜜中苦參類生物堿為研究對(duì)象,采用液液萃取結(jié)合高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜建立一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的定性定量分析方法,旨在為狼牙蜜中苦參類生物堿的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù),更好地研究與開(kāi)發(fā)與狼牙刺有關(guān)的植物資源。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      乙腈、甲醇、三氯甲烷、甲酸:色譜純(德國(guó)默克公司);乙酸銨:色譜純(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);氨水:分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

      苦參堿(純度:98.9%)、氧化苦參堿(純度:99.1%)、氧化槐果堿(純度:99.4%)、槐定堿(純度:98.5%),均購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;槐果堿(純度:99.85%),購(gòu)于Stanford Chemicals 上海佰世凱化學(xué)科技有限公司。

      蜂蜜:共65份,根據(jù)蜜源進(jìn)行分類。其中,狼牙蜜10份,槐花蜜10份,棗花蜜10份,油菜蜜10份,椴樹(shù)蜜5份,枸杞蜜5份,桂花蜜5份,茴香蜜5份,野菊花蜜5份。樣品均來(lái)源于甘肅省兩當(dāng)縣及蘭州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和大型超市。

      1.2 儀器與設(shè)備

      5500QTRAP高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB.SCIEX公司);ME403T電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器公司);Elmasonic P 300 H超聲波清洗機(jī)(德國(guó)Elma公司);SORVALL LYNX 6000高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)賽默飛公司);VORTEX 3渦旋混合器(德國(guó)IKA公司);N-EVAP116氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)。

      1.3 實(shí)驗(yàn)方法

      1.3.1 樣品前處理

      稱取攪拌均勻的蜂蜜樣品2 g(準(zhǔn)確至0.01 g)于50 mL離心管中,加入3 mL氨水使樣品溶解,再加入10 mL三氯甲烷,渦旋振蕩3 min,超聲提取30 min,8 000 r·min-1離心5 min,用吸管將下層三氯甲烷層轉(zhuǎn)移至新的50 mL離心管中,用10 mL三氯甲烷反復(fù)洗滌吸管,洗滌液轉(zhuǎn)移至殘?jiān)薪?jīng)上述相同操作進(jìn)行提取。重復(fù)此過(guò)程3次,合并提取液于40 ℃氮?dú)獯蹈伞埩粑镆猿跏剂鲃?dòng)相溶解并定容至1 mL。經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后,待測(cè)。

      1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

      (1)混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱取適量的5種苦參類生物堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于100 mL容量瓶中,用乙腈溶解并定容至刻度,配制成濃度為100 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

      (2)混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確量取配制的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL,用乙腈定容至10 mL,配制成濃度為1 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。

      (3)標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。臨用時(shí),取配制的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液適量,用初始流動(dòng)相稀釋制成含5種苦參類生物堿濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

      (4)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液 。用空白基質(zhì)蜂蜜樣品按1.3.1樣品前處理方法制得空白基質(zhì)溶液,采用空白基質(zhì)溶液配制成0.1、0.2、0.5、1.0 、2.0、5.0、10.0 、20.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液。

      1.3.3 儀器條件

      (1)色譜條件。色譜柱:Waters ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(50×2.1 mm,1.7 μm);色譜柱溫度:30 ℃;進(jìn)樣量:10.0 μL;流動(dòng)相:A為2 mmol乙酸銨-0.1%甲酸水溶液,B為2 mmol乙酸銨-0.1%甲酸乙腈溶液;流速:0.25 mL·min-1;梯度洗脫程序:0~1.0 min,95% A;1.0~4.0 min,95%~10% A;4.0~6.0 min,10% A;6.0~6.1 min,10%~95% A;6.1~8.0 min,95% A。

      (2)質(zhì)譜條件。電噴霧離子源(Electron Spray Ionization, ESI),正離子模式掃描;離子化電壓(IonSpray Voltage, IS):+5 500 V;動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multiple Reaction Monitoring, MRM)模式,5種苦參類生物堿的質(zhì)譜參數(shù)詳見(jiàn)表1。

      表1 5種苦參類生物堿的質(zhì)譜參數(shù)表

      1.4 數(shù)據(jù)處理

      將實(shí)驗(yàn)獲取的數(shù)據(jù)在MultiQuant軟件進(jìn)行處理分析,以5種苦參類生物堿的保留時(shí)間、定性離子、定量離子及兩個(gè)子離子的相對(duì)豐度比進(jìn)行定性判斷;繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析蜂蜜樣品中的不同目標(biāo)物;采用Origin 2022軟件進(jìn)行圖形繪制。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 儀器條件的優(yōu)化

      2.1.1 質(zhì)譜條件

      在正離子模式下,找出加合離子峰,在一定的去簇電壓和碰撞能量下,選擇子離子中相對(duì)豐度較強(qiáng)的2對(duì)子離子作為定性和定量離子對(duì)。在去簇電壓不斷增大的變化過(guò)程中,簇離子會(huì)隨之減少,目標(biāo)加合離子的響應(yīng)強(qiáng)度增高,當(dāng)電壓增大到一定數(shù)值時(shí),由于源內(nèi)裂解的發(fā)生,導(dǎo)致目標(biāo)加合離子的響應(yīng)隨之降低,從而優(yōu)化出最佳去簇電壓。當(dāng)碰撞能量不斷增大過(guò)程中,目標(biāo)加合離子響應(yīng)會(huì)降低,特征子離子響應(yīng)增強(qiáng),當(dāng)達(dá)到一定數(shù)值時(shí),特征子離子會(huì)進(jìn)一步碎裂,從而響應(yīng)減弱,此過(guò)程可優(yōu)化出最佳碰撞能量(見(jiàn)表1)。

      2.1.2 色譜條件

      本研究比較了乙腈-0.1%甲酸水;0.1%甲酸乙腈-5 mmol乙酸銨;(2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸水溶液)-(2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸乙腈溶液)作為流動(dòng)相時(shí)5種苦參類生物堿的保留時(shí)間及峰形。結(jié)果表明,乙腈-0.1%甲酸水體系下目標(biāo)物分離效果不佳且拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重;0.1%甲酸乙腈-5 mmol乙酸銨體系下,因?yàn)橐宜徜@的加入使5種苦參類生物堿的分離效果得到改善,但是出峰時(shí)間較早,可能存在目標(biāo)物未完全洗脫的情況。(2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸水溶液)-(2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸乙腈溶液)作為流動(dòng)相時(shí),5種苦參類生物堿出峰時(shí)間適宜,目標(biāo)物響應(yīng)強(qiáng)度增加,峰形尖銳,分離效果較好,可能是由于加入緩沖鹽后,可以降低堿基與色譜柱中極性的硅醇基相互作用,從而改善因其導(dǎo)致的拖尾效應(yīng)[24]。因此,采用(2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸水溶液)-(2 mmol乙酸銨+0.1%甲酸乙腈溶液)作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,在8 min內(nèi)完成目標(biāo)物的測(cè)定(如圖1、2)。

      圖1 5種苦參類生物堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖

      2.2 提取條件的優(yōu)化

      2.2.1 提取溶劑的選擇

      在萃取過(guò)程中,本研究比較了甲醇、乙腈、正己烷和三氯甲烷作為提取劑的提取效果。其中,正己烷對(duì)極性化合物的提取效果較差;甲醇作為提取劑,會(huì)出現(xiàn)微量沉淀物,提取效率低;乙腈和三氯甲烷都能使目標(biāo)物富集,提取效果較好,但在最后的濃縮過(guò)程中三氯甲烷更易揮發(fā),能更快氮吹干,進(jìn)而縮短前處理時(shí)間,提高前處理的效率(如表2)。此外,本研究進(jìn)行了多次重復(fù)提取,可以使目標(biāo)物提取充分,降低損失,提高回收率。

      2.2.2 料液比的優(yōu)化

      蜂蜜中含糖量較高,一般在60%~80%,若直接提取可能由于蜂蜜本身黏度較大,目標(biāo)物附著于糖分上,影響提取效果[25]。因此,先用適量水溶解狼牙蜜,使其成為均勻相,再進(jìn)行后續(xù)提取步驟。直接用三氯甲烷萃取,提取效果較好。為了更進(jìn)一步提高回收率,使用適量氨水溶解狼牙蜜,同時(shí),因苦參類生物堿為堿性化合物,遂在萃取溶劑中加入適量堿,以增加其在三氯甲烷中的溶解度。

      此外,本研究考察了狼牙蜜質(zhì)量同氨水添加量的不同配比,隨著氨水添加量的增加,回收率也相應(yīng)提高,由圖3可知,當(dāng)狼牙蜜質(zhì)量與氨水比例為1∶1.5時(shí),提取效果最佳,回收率最高;當(dāng)狼牙蜜質(zhì)量與氨水比例為1∶2時(shí),回收率略微下降,繼續(xù)增大氨水比例,回收率繼續(xù)降低。故選擇稱取2.00 g狼牙蜜,加入3 mL氨水進(jìn)行溶解。

      圖3 料液比對(duì)回收率的影響圖(n=3)

      2.3 基質(zhì)效應(yīng)考察

      基質(zhì)效應(yīng)是指對(duì)復(fù)雜目標(biāo)物進(jìn)行分析時(shí),除了被分析物外,其他存在的物質(zhì)對(duì)整個(gè)分析過(guò)程造成的影響?;|(zhì)效應(yīng)可以在很大程度上導(dǎo)致目標(biāo)物信號(hào)的增強(qiáng)或抑制,從而影響定性和定量分析。干擾物質(zhì)可以是樣品的組分、預(yù)處理萃取過(guò)程中釋放的化合物,或添加到流動(dòng)相中以提高色譜分辨率的試劑等。總之,目標(biāo)分析物的化學(xué)性質(zhì)、基質(zhì)的種類、基質(zhì)與分析物的濃度比、提取工藝、色譜條件以及質(zhì)譜儀器的種類和電離條件,都可以引起基質(zhì)效應(yīng)[26]。在高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜分析中,基質(zhì)效應(yīng)的考察顯得非常重要?;|(zhì)效應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法,即基質(zhì)效應(yīng)是基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)系列濃度曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)系列濃度曲線的斜率進(jìn)行評(píng)估[27]。基質(zhì)效應(yīng)小于100%,表明存在基質(zhì)抑制;基質(zhì)效應(yīng)大于100%,表明存在基質(zhì)增強(qiáng)。

      本實(shí)驗(yàn)選用空白蜂蜜樣品,按照1.3.1的前處理方法制得空白基質(zhì)溶液,配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。同時(shí),用初始流動(dòng)相配制溶液工作標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到兩者斜率比,考察基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示,5種苦參類生物堿均存在基質(zhì)抑制效應(yīng)。因此,本實(shí)驗(yàn)配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行了分析定量,數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

      表3 5種苦參類生物堿基質(zhì)效應(yīng)表

      2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

      2.4.1 方法線性范圍及檢出限

      參照2.1優(yōu)化后的儀器條件,對(duì)5種苦參類生物堿混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測(cè)定,繪制以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。5種苦參類生物堿在0.1~50 ng·mL-1濃度范圍線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2≥0.999 1。以標(biāo)準(zhǔn)溶液中目標(biāo)組分最低水平的3倍信噪比為檢出限(LOD),10倍信噪比為定量限(LOQ),計(jì)算得到本方法的檢出限和定量限(見(jiàn)表4)。當(dāng)稱樣量為2.00 g時(shí),檢出限為0.10~0.20 μg·kg-1;定量限為0.30~0.45 μg·kg-1。

      表4 5種苦參類生物堿的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限表

      2.4.2 回收率和精密度

      為了確證該方法的可行性,本實(shí)驗(yàn)對(duì)狼牙蜜樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),同一批次狼牙蜜中添加3個(gè)含量水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別為0.5、5 μg·kg-1和20 μg·kg-1,按照1.3.1所述方法進(jìn)行前處理后上機(jī)分析。由表5可知,5種苦參類生物堿的平均回收率在87.82%~93.18%之間,RSD≤3.8%。該結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)方法在不同濃度加標(biāo)水平下,能夠體現(xiàn)較高的回收率和較好的精密度,能夠滿足狼牙蜜樣品中5種苦參類生物堿的檢測(cè)要求。

      表5 5種苦參類生物堿在不同加標(biāo)水平下的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表(%,n=6)

      2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

      本實(shí)驗(yàn)采用前處理方法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件,對(duì)甘肅省兩當(dāng)縣及蘭州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和大型超市的65份蜂蜜進(jìn)行了5種苦參類生物堿的分離提取及測(cè)定(圖4),各目標(biāo)物含量如表6所示。實(shí)際樣品分析結(jié)果表明,5種苦參類生物堿普遍存在于不同蜜源的蜂蜜中,只有10批次油菜花蜜中未檢出苦參堿和槐定堿;10批次棗花蜜和5批次野菊花蜜中未檢出槐定堿。狼牙蜜中5種苦參類生物堿的含量均高于其他蜜源品種的蜂蜜,在10批次狼牙蜜中苦參堿最高含量達(dá)0.769 μg·kg-1,氧化苦參堿達(dá)到2.102 μg·kg-1,槐果堿達(dá)到2.332 μg·kg-1,氧化槐果堿為5.987 μg·kg-1,槐定堿為0.882 μg·kg-1。由于狼牙刺的不同器官中均含有苦參類生物堿,其作為一種特色蜜源植物,因而狼牙蜜中也普遍含有苦參類生物堿。

      圖4 樣品中5種苦參類生物堿的MRM色譜圖

      3 結(jié)論與討論

      本研究建立了液液萃取結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測(cè)定狼牙蜜中5種苦參類生物堿的檢測(cè)方法,在堿性條件下液液萃取對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行提取富集,同時(shí),優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜條件,采用基質(zhì)外標(biāo)法加以定量。實(shí)驗(yàn)表明,5種苦參類生物堿在0.1~50 ng·mL-1濃度范圍線性關(guān)系良好(R2>0.999 1),方法檢出限的范圍在0.1~0.2 μg·kg-1之間;定量限范圍在0.30 ~0.45 μg·kg-1之間。在不同的加標(biāo)水平下,5種苦參類生物堿的平均回收率在87.82%~93.18%之間,RSD≤3.8%。由此可見(jiàn),該方法提取率高,定量準(zhǔn)確,適用于狼牙蜜中5種苦參類生物堿的檢測(cè)。同時(shí),測(cè)定的不同蜜源品種蜂蜜中5種苦參類生物堿的含量差異較大,狼牙蜜中5種苦參類生物堿的含量均高于其他品種。

      綜上所述,本研究重點(diǎn)關(guān)注兩當(dāng)狼牙蜜中苦參類生物堿的含量測(cè)定,建立了一種高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法,旨在為狼牙蜜中苦參類生物堿的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考,為學(xué)界全面了解狼牙蜜的食用和藥用價(jià)值提供研究途徑和技術(shù)支撐。

      猜你喜歡
      乙酸銨苦參堿苦參
      Efficacy of Kushen decoction (苦參湯) on high-fat-diet-induced hyperlipidemia in rats
      以苦參為主治療心律失常的療效觀察
      苦參百部液治蟲(chóng)咬皮炎
      流動(dòng)相組分及比例對(duì)苯甲酸、山梨酸、糖精鈉保留時(shí)間的影響
      不同土壤陽(yáng)離子交換量測(cè)定方法的對(duì)比分析
      快速檢測(cè)土壤陽(yáng)離子交換量的方法優(yōu)化
      大劑苦參治不寐
      苦參堿對(duì)乳腺癌Bcap-37細(xì)胞增殖和凋亡的影響
      中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:54
      氧化苦參堿對(duì)SGC7901與ECV304的體外活性比較研究
      二氮雜菲分光光度法測(cè)定水中總鐵試劑空白的討論
      高唐县| 泾源县| 甘孜县| 甘南县| 前郭尔| 镇坪县| 望城县| 钟山县| 合作市| 辰溪县| 贵阳市| 额济纳旗| 明水县| 惠州市| 玉田县| 定日县| 咸宁市| 东阳市| 银川市| 新昌县| 汉中市| 南涧| 武邑县| 苍山县| 太原市| 墨竹工卡县| 肇源县| 阿勒泰市| 奎屯市| 平舆县| 博兴县| 陆河县| 定南县| 宣武区| 广元市| 太仆寺旗| 武威市| 广德县| 德惠市| 和平县| 麻城市|