陳春穎, 陶 超, 丁木子, 王鳳舞, 朱小麗, 申 麗

(1. 揚州大學醫(yī)學院, 江蘇 揚州, 225009; 2. 江蘇省中西醫(yī)結合老年病防治重點實驗室, 江蘇 揚州, 225009;3. 青島農業(yè)大學 食品科學與工程學院, 山東 青島, 266109)

微生物來源的天然藥物是新藥及其先導化合物的重要來源,特殊生態(tài)環(huán)境下的微生物與特殊的次生代謝產物密切相關,因此微生物源新藥或先導化合物的研究更多地集中于特殊生境微生物[1-2]。生活在海洋環(huán)境中的真菌和細菌,在寡營養(yǎng)、低溫、高壓、高鹽、無光照等惡劣條件下,常形成特殊的代謝途徑,易產生結構新穎、活性顯著的次生代謝產物[3]。研究[4]發(fā)現,海洋真菌和細菌與海洋動物(節(jié)肢動物、刺胞動物、軟體動物等)存在密切的共生關系,海洋共生微生物很可能是多種海洋生物活性成分的真正產生者。海洋動物共生菌作為海洋微生物藥物的重要研究方向之一,為新藥研發(fā)提供了豐富的物質基礎。毀絲霉(Myceliophthora)為半知菌類真菌,在自然界中廣泛分布。Myceliophthora屬真菌根據分子鑒定和表型可分為4個分支,即Myceliophthora、Corynascus、Crassicarpon和Thermothelomyce[5], 其中Crassicarponthermophilum和Thermothelomycespp. 為嗜熱真菌,其能產生非常豐富的酶系。目前,關于Myceliophthora屬真菌的研究大多集中在其所產生的耐熱木聚糖酶[6]、淀粉酶[7]、纖維素酶[8]等熱穩(wěn)定性酶方面,次生代謝產物相關研究則極少。前期實驗[9]從長島海域牡蠣中分離得到共生真菌MyceliophthoraluteaML-1(M.luteaML-1), 本研究基于液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)分子網絡技術研究其發(fā)酵液的化學成分,以期明確M.luteaML-1的次生代謝產物譜,為挖掘新穎結構藥物先導化合物提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Atlantis T3色譜柱(2.1 mm×150 mm, 3 μm), 美國安捷倫科技有限公司; 色譜甲醇,美國TEDIA化學試劑有限公司; 色譜甲酸,美國ACS恩科化學公司; D-山梨醇,國藥集團化學試劑有限公司; D-(+)-麥芽糖一水合物,國藥集團化學試劑有限公司; 酵母膏,國藥集團化學試劑有限公司; L-色氨酸,阿拉丁生化科技有限公司; 海鹽,中國鹽業(yè)集團有限公司; 其他試劑為分析純。

TripleTOF 4600液-質聯用儀(美國AB SCIEX有限公司); SHP-250恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設備有限公司); SKY-200B恒溫振蕩搖床(上海蘇坤實業(yè)有限公司); DW-HL388超低溫冰箱(中科美菱低溫科技有限責任公司)等。

1.2 菌株發(fā)酵和發(fā)酵產物提取方法[10]

M.luteaML-1是從長島海域牡蠣中分離得到的共生真菌[9](Genbank號: ON005439), 菌株保存于揚州大學醫(yī)學院天然藥物化學研究室。使用真菌1號培養(yǎng)基(山梨醇20 g、麥芽糖20 g、味精10 g、KH2PO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、色氨酸0.5 g、酵母膏3 g、海鹽30 g、水1 000 mL)進行菌株小量發(fā)酵。從M.luteaML-1凍存管中挑取少量菌體接入PDA平板, 28 ℃培養(yǎng)2～3 d; 挑取菌塊接入500 mL三角瓶中(200 mL PD培養(yǎng)基), 28 ℃、120轉/min培養(yǎng)3 d; 再將種子液接入1 000 mL三角瓶中(400 mL真菌1號培養(yǎng)基), 28 ℃、120轉/min培養(yǎng)15 d。發(fā)酵液經乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,減壓蒸餾去除溶劑,得到粗浸膏。發(fā)酵液粗浸膏經色譜甲醇溶解、0.22 μm微孔濾膜過濾后,進行LC-MS/MS分析。

1.3 發(fā)酵液粗浸膏的LC-MS/MS分析[10]

高效液相色譜(HPLC)條件: Atlantis T3柱(2.1 mm× 150 mm, 3 μm), 流動相A(0.1%甲酸溶液),流動相B(甲醇),梯度洗脫(0～10 min, 80%→20% A; 10～20 min, 20%→1% A; 20～32 min, 1%→1% A), 流速0.3 mL/min, 柱溫40 ℃, 進樣量5 μL。

四極桿飛行時間串聯質譜(Q-TOF-MS/MS)條件: 電噴霧離子源; 正離子模式; 氣簾氣壓力35 kV; 霧化溫度550 ℃; 霧化氣55 Psi, 輔助氣55 Psi; 噴霧電壓5 500 V; 去簇電壓80 eV; 碰撞電壓35 eV; 全掃描模式,一級母離子掃描范圍100～2 000, 二級子離子掃描范圍50～2 000。

1.4 經典分子網絡(CMN)構建和化學成分識別

原始質譜數據經MSconvert軟件轉換為.mzXML格式文件,再上傳至全球天然產物社會分子網絡(GNPS)平臺構建CMN。參數設置: 碎片離子質量誤差值為0.02 Da, 最小余弦值為0.6, 最小碎片匹配峰為6。將生成的CMN導入Cytoscape軟件進行可視化,同時可利用GNPS平臺“MS/MS Library”檢索功能快速識別潛在化學成分,設置最小匹配峰為6和最小匹配分數為0.7。

1.5 特征峰分子網絡(FBMN)構建和相對定量

原始質譜數據經MSconvert軟件轉換為.mzXML格式文件后,導入MZmine 2軟件進行原始譜圖的識別、提取、對齊、去噪、分組等處理,再以.mgf和.csv格式文件導出,并上傳至GNPS平臺的“FBMN”模塊中構建FBMN。參數設置: 前體離子質量誤差值為0.02 Da, 碎片離子質量誤差值為0.02 Da。將生成的FBMN導入Cytoscape軟件進行可視化。FBMN可通過LC-MS特征豐度(峰面積或峰高度)更準確地估計相對離子強度,因此能進行化學成分的相對定量[11]。FBMN中,節(jié)點大小可直觀反映化合物的相對含量。

2 結 果

2.1 基于CMN的發(fā)酵液化學成分識別和結構預測

應用CMN進行大規(guī)模數據集的元分析,可以方便快捷地分析LC-MS2數據。對M.luteaML-1發(fā)酵液粗浸膏的LC-MS/MS譜進行處理后,上傳到GNPS平臺構建CMN, 見圖1、圖2。該分子網絡共有1 282個節(jié)點,其中節(jié)點數≥3的分子簇有39個,見圖2。利用GNPS平臺的"MS/MS Library"功能搜庫,將初步匹配的化合物與平臺二級質譜庫數據進行比對,結果識別出潛在的化學成分39個; 在此基礎上,根據分子簇中各節(jié)點間的質荷比和MS2碎片離子關系又進一步預測出10個化學成分的結構,見圖2、表1。已識別和預測出的化合物包括18個脂肪酸類衍生物(分子簇A, 化合物1～18)、8個蒽醌類化合物(分子簇B, 化合物19～20,23～26; 2個單節(jié)點簇,化合物21和22)、12個環(huán)二肽類化合物(分子簇C, 化合物27～38)及11個其他類型化合物(化合物39～49), 見圖2。研究[11]發(fā)現,在非靶向LC-MS2數據采集過程中,同一前體離子在色譜洗脫過程中經常被多次碎片化,雖然MS-Cluster通常能夠將這些光譜聚類到CMN中的1個節(jié)點中,但在某些情況下,會產生代表同一化合物的多個節(jié)點。此外,由于算法的原因,分析結果會出現結構類似物并未聚集在同一個分子簇的現象[12]。

圖1 牡蠣共生真菌M.lutea ML-1發(fā)酵液粗浸膏的總離子流圖

A: 脂肪酸類化合物; B: 蒽醌類化合物; C: 環(huán)二肽類化合物。紅色節(jié)點為已識別或預測出的化合物。

直接利用GNPS平臺的"MS/MS Library"功能, 快速發(fā)現菌株ML-1發(fā)酵液中存在15個脂肪酸類化合物(化合物1～15), 其中化合物1～10分別為Linolenic acid(1)、13-hydroxyoctadeca-6, 9, 11-trienoic acid(2)、9, 12-Octadecadienoicacid(3)、1-stearoyl-sn-glycerol(4)、Monopalmitin(5)、2, 3-Dihydroxypropyl 9, 12, 15-octadecatrienoate(6)、1-Monolinolein(7)、elaidic acid(8)、13-Docosenamide(9)、Oleamide(10)。分析分子網絡圖發(fā)現, 節(jié)點m/z293.248 0([M+H-H2O]+,tR=14.51 min)、m/z339.289 0([M+H-H2O]+,tR=16.98 min)、m/z295.264 9([M+H-H2O]+,tR=17.58 min)、m/z381.301 2([M+H-H2O]+,tR=17.76 min)和m/z263.236 7([M+H-H2O]+,tR=16.4 min)分別與化合物methyl 13-hydroxyoctadeca-9, 11-dienoate、Glyceryl monooleate、methyl 12-hydroxyoctadec-9-enoate、1-oleoyl-2-acetoyl-sn-glycerol和10, 12-Octadecadienoic acid具有相同的二級質譜, 故確定其分別為methyl 13-hydroxyoctadeca-9, 11-dienoate(11)、Glyceryl monooleate(12)、methyl 12-hydroxyoctadec-9-enoate(13)、1-oleoyl-2-acetoyl-sn-glycerol(14)和10, 12-Octadecadienoic acid(15); 比對二級質譜發(fā)現,節(jié)點m/z357.300 6([M+H]+,tR=16.95 min)與m/z339.289 0([M+H-H2O]+,tR=16.98 min)為同一化合物Glyceryl monooleate(12)。在此基礎上,依據分子網絡提示的相鄰節(jié)點之間的結構關系進行其他節(jié)點化合物的結構預測,結果又識別出3個化合物。節(jié)點m/z309.241 3([M+H]+,tR=14.35 min)比節(jié)點m/z295.225 7([M+H]+,tR=12.22 min, 化合物2)多1個CH2, 同時比節(jié)點m/z293.248 0([M+H-H2O]+,tR=14.51 min, 化合物11)少2個H, 結合二級質譜可確定其為化合物Methyl 13-oxo-9, 11-octadecadienoate(16); 節(jié)點m/z341.306 1([M+H-H2O]+,tR=18.26 min)比節(jié)點m/z339.289 0([M+H-H2O]+,tR=16.98 min,12)多2個H原子, 結合二級質譜推測其為化合物1-Monostearin(17); 節(jié)點m/z280.264 5([M+H]+,tR=15.27 min)與節(jié)點m/z281.248 1([M+H]+,tR=16.4 min, 化合物3)質荷比相差1, 同時比m/z282.279 9([M+H]+,tR=16.43 min, 化合物10)少2個H原子,可能是化合物3結構中的羧基變?yōu)轷０坊?結合二級質譜確定其為化合物9, 11-Octadecadienamide(18)。分子簇中某些節(jié)點分子的提示信息較少,僅靠二級碎片無法確定結構,有待進一步鑒定。見表1-1、圖3。

表1-1 牡蠣共生真菌M.lutea ML-1發(fā)酵液的脂肪酸類化學成分

圖3 分子網絡中的脂肪酸類化合物分子簇

運用"MS/MS Library"檢索功能,快速發(fā)現菌株ML-1發(fā)酵液分子網絡中的蒽醌類化合物分子簇。節(jié)點m/z543.127 7([M+H]+,tR=10.77 min)、m/z節(jié)點575.119 4([M+H]+,tR=7.95 min)、m/z節(jié)點285.075 9([M+H]+,tR=13.73 min)和節(jié)點m/z315.050 4([M+H]+,tR=9.11 min)分別與GNPS平臺譜庫收錄的蒽醌類化合物Rugulosin A、(-)-Luteoskyrin、1, 8-dihydroxy-3-methoxy-6-methylanthracene-9, 10-dione和Endocrocin的二級質譜基本一致,故確定上述節(jié)點化合物為Rugulosin A(19)、(-)-Luteoskyrin(20)、1, 8-dihydroxy-3-methoxy-6-methylanthracene-9, 10-dione(21)和Endocrocin(22)。依據相鄰節(jié)點之間的結構關系,對節(jié)點化合物進行結構預測,又識別出4個蒽醌類化合物: ① 節(jié)點m/z559.124 1([M+H]+,tR=9.21 min)比節(jié)點m/z543.127 7(Rugulosin A, 化合物19)質荷比大16(多1個O原子),其結構有3種可能,分別為Rugulosin A(19)的C-6、C-8、C-11羥基化衍生物; 其比節(jié)點m/z575.119 4[(-)-Luteoskyrin, 化合物20]質荷比小16(少1個O原子),也存在3種結構可能,即 (-)-Luteoskyrin(20)的C-2、C-5、C-8脫羥基化衍生物; 綜合上述結構信息,并結合二級質譜裂解規(guī)律,推測其為化合物19的C-8位羥基化衍生物(+)-Deoxyluteoskyrin(23)。② 同理推測節(jié)點m/z591.113 7([M+H]+,tR=5.55 min, 化合物24)是節(jié)點m/z575.119 4(-)-Luteoskyrin, 化合物20)的一氧化物,其有4種可能結構,即(-)-Luteoskyrin(20)的C-2、C-4a、C-6、C-11羥基化衍生物; 以分子式C30H22O13檢索SciFinder數據庫發(fā)現, (-)-Luteoskyrin(20)的C-4a羥基化衍生物(-)-4α-Oxyluteoskyrin已有報道,但化合物24是否為該化合物有待進一步確定。③ 節(jié)點m/z[M+H]+573.101 9(C31H24O11,tR=10.07 min, 化合物25)和節(jié)點m/z[M+H]+589.099 5(C31H24O12,tR=8.63 min, 化合物26)分別為化合物(+)-Deoxyluteoskyrin(化合物23, C30H22O11)和化合物(-)-Luteoskyrin(化合物20, C30H22O12)的甲基化衍生物。用化合物25、26的分子式檢索SciFinder數據庫,未發(fā)現符合二蒽醌結構特征的化合物,提示這2個化合物可能為新二蒽醌類化合物。因二蒽醌化合物的質譜裂解規(guī)律比較復雜,僅靠二級質譜信息暫時無法確定化合物25、26的具體結構。見圖4、表1-2。

表1-2 牡蠣共生真菌M.lutea ML-1發(fā)酵液的蒽醌類化學成分

圖4 分子網絡圖中的蒽醌類化合物所在分子簇

運用"MS/MS Library"功能進行化合物匹配,快速發(fā)現菌株ML-1發(fā)酵液分子網絡中的環(huán)二肽類化合物分子簇,經與GNPS平臺譜庫收錄的二級質譜進行比對,快速識別出9個節(jié)點化合物,分別為cyclo(Leu-Pro)(27)、cyclo(Val-Pro)(28)、cyclo(Phe-Pro)(29)、cyclo(Leu-Phe)(30)、cyclo(Phe-4-hydroxy-Pro)(31)、cyclo(L-Leu-trans-4-hydroxy-L-Pro)(32)、cyclo(Val-Phe)(33)、cyclo(Leu-Val)(34)和cyclo(Tyr-Pro) (35)。根據分子網絡提示的節(jié)點化合物的分子式以及相鄰節(jié)點的結構關系,結合環(huán)二肽類化合物的裂解規(guī)律[13-15], 進一步將節(jié)點m/z263.139 2([M+H]+,tR=3.92 min)、節(jié)點m/z185.128 5([M+H]+,tR=3.77 min)和節(jié)點m/z227.176 9([M+H]+,tR=7.46 min)分別鑒定為化合物cyclo(Val-Tyr)(36)、cyclo(Ala-Leu)(37)和cyclo(Leu-Ile)(38), 見表1-3、圖5。

表1-3 牡蠣共生真菌M.lutea ML-1發(fā)酵液的環(huán)二肽類化學成分

圖5 分子網絡圖中環(huán)二肽類化合物所在分子簇

除脂肪酸類、蒽醌類、環(huán)二肽類化合物,本研究還識別出11個其他結構類型化合物,具體包括: 鄰苯二甲酸酯類, dibutyl phthalate(39)和dioctyl phthalate(40); 麥角甾醇類, ergosterol-5, 8-peroxide(41); 香豆素類, 1H-2-Benzopyran-1-one(42); 喹啉類, 4-Hydroxy quinolie(43)和4-Quinolinecarboxylic acid(44); 吡啶類, 3-Pyridinecarboxylic acid(45); 仲胺, N-benzyl-1-phenylmethanamine(46); 聚醚類, Nonaethylene glycol(47)、EG-10(48)和undecaethylene glycol(49)。見表1-4。

表1-4 牡蠣共生真菌M.lutea ML-1發(fā)酵液的其他類型化學成分

2.2 基于FBMN的發(fā)酵液化學成分分析

利用GNPS平臺的“Feature Networking”模塊構建菌株發(fā)酵液的FBMN, 見圖6。FBMN共有649個節(jié)點,比CMN少633個,結合分子網絡快速識別出41個化合物; 節(jié)點數≥3的分子簇有14個,比CMN少25個。FBMN構建前的原始質譜數據處理,在剔除儀器、雜質離子和系統(tǒng)誤差等因素影響的同時,還會過濾掉一些質譜信息,因此FBMN的節(jié)點和分子簇比CMN少。構建FBMN需使用適當的處理步驟和參數,否則會影響分子網絡的分析結果; 此外, CMN使用光譜計數或前體離子計數,而FBMN可通過LC-MS特征豐度(峰面積或峰高度)更準確地估計相對離子強度,從而實現分子網絡化學成分的相對定量[11]。本研究利用FBMN進行發(fā)酵液化學成分的相對定量,結果發(fā)現,節(jié)點m/z317.245 5(tR=18.63 min)、m/z319.225 0(tR=12.96 min)、m/z763.179 0(tR=24.75 min)、m/z837.198 8(tR=26.91 min)、m/z279.232 5(tR=12.96 min)、m/z321.240 5(tR=13.81 min)、m/z393.298 1(tR=18.01 min)、m/z303.229 7(tR=16.91 min)、m/z235.097 1(tR=6.56 min)和m/z211.144 5(tR=4.69 min)為相對含量排名前10位的化學成分。其中,節(jié)點m/z279.232 5(tR=12.96 min)、m/z235.097 1(tR=6.56 min)和m/z211.144 5(tR=4.69 min)分別被鑒定為脂肪酸類化合物Linolenic acid(1)的順反異構體(兩者的二級質譜相同,但保留時間有明顯差異)、香豆素類化合物1H-2-Benzopyran-1-one(42)和環(huán)二肽類化合物cyclo(Leu-Pro)(27), 其余7個節(jié)點分子的結構有待鑒定,見圖6、圖7。該分析結果明確了菌株ML-1采用真菌1號培養(yǎng)基發(fā)酵時的主要次生代謝產物。

圖7 M.lutea ML-1發(fā)酵液中的主要次生代謝產物(相對含量排名前10位)

3 討 論

Index fungorum網站(https://www.indexfungorum.org/Names.asp)統(tǒng)計顯示,Myceliophthora屬已被報道的種共有19個,去掉同物異名和無效種,被承認的種僅14個,即M.fergusii、M.guttulate、M.heterothallica、M.hinnulea、M.indica、M.lutea、M.novoguineensis、M.officinarum、M.sepedonium、M.setosus、M.sexualis、M.similis、M.thermophila和M.verrucosa[16]。但目前為止,僅M.thermophila、M.lutea和M.heterothallica有次生代謝產物的相關研究報道。GAO Y L等[17]從M.thermophilaATCC 42464中分離得到4個具有反式稠合十氫萘骨架的聚酮-氨基酸雜合化合物myceliothermophin A、B、E、F, 其中新化合物myceliothermophin F對人結腸癌細胞株DLD-1、人肝癌細胞株Hep3B、人肝癌細胞株HepG2、人胃癌細胞株HGC-27有顯著抑制作用,半數抑制濃度(IC50)分別為0.48、0.89、0.80、0.33 μg/mL。NOZAWA O等[18-19]從M.luteaTF-0409中分離得到2個新的δ-內酯化合物Waols A、Waols B, 其具有廣譜體外細胞毒活性,對阿霉素耐藥人白血病細胞株HL-60/ADR、人白血病細胞株HL-60、小鼠白血病細胞株P388、人膀胱癌細胞株T-24、人宮頸癌細胞株Hela、人肺癌細胞株A549具有顯著抑制活性,IC50分別為0.1、0.2、4.0、0.5、1.0、1.0 μg/mL和0.2、0.2、4.0、0.5、1.0、1.0 μg/mL。此外, Waols A和Waols B僅對金黃色葡萄球菌有較弱的抑制活性。SMETANINA O F等[20]從庫頁灣(鄂霍次克海)海洋沉積物來源的真菌M.lutea中分離得到2個新化合物isoacremine D和acremine A, 其中acremine A在光作用下會轉化為spiroacremines A和spiroacremines B。這4個化合物對海膽精細胞具有體外細胞毒活性,濃度分別為40、50、15、30 μg/mL時,能使海膽精子的受精能力下降50%; isoacremine D在200 μg/mL時對金黃色葡萄球菌有抑菌活性,而acremine A、spiroacremines A和spiroacremines B對測試的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌沒有抗菌活性。深入開展Myceliophthora屬真菌的次生代謝產物研究,能夠為挖掘該屬真菌的化學多樣性和生物活性多樣性提供科學依據,并為真菌資源的開發(fā)利用奠定基礎。

2014年,基于LC-MS/MS的GNPS平臺正式開放使用,這是一個基于分子網絡和數據共享的信息平臺,能幫助研究者快速識別天然化合物的分子特征,已成為研究微生物次級代謝組學的重要技術手段。本研究利用CMN對牡蠣共生真菌M.luteaML-1發(fā)酵液粗浸膏的化學成分進行分析,共識別和預測出49個化合物,包括18個脂肪酸類化合物、8個蒽醌類化合物、12個環(huán)二肽類化合物和11個其他類化合物,其中可能有2個新二蒽醌類化合物,初步明確了該菌株的次生代謝產物譜。本研究進一步利用FBMN進行相對定量分析發(fā)現了真菌1號培養(yǎng)基的主要次生代謝產物,目前已識別出其中的3個化合物,該結果為后續(xù)化學成分的導向分離提供了思路,也為通過優(yōu)化發(fā)酵條件提高微量化合物的產量提供了依據。但由于GNPS平臺收錄的二級質譜數據有限,且可能存在新穎結構成分,目前僅從M.luteaML-1發(fā)酵液中識別及預測出不足5%的節(jié)點分子,后續(xù)考慮將“種子化合物”與菌株發(fā)酵產物共同構建分子網絡,利用“種子化合物”的結構線索幫助識別出更多化學成分,從而闡明菌株的次級代謝產物譜,為挖掘發(fā)現結構新穎、活性顯著的藥物先導化合物奠定基礎。